肝纤维化(liver fibrosis，LF)是胶原、糖蛋白和蛋白多糖等肝细胞外基质过度沉积的慢性损伤性病理过程，是慢性肝炎、代谢性等慢性肝病向肝硬化甚至肝癌进展的关键环节及影响肝病预后的重要因素^{[1, 2]}。既往研究表明，未经治疗的LF会增加肝硬化、肝细胞癌或肝衰竭的风险，而LF早期诊断并及时采取的有效的抗纤维化药物治疗，可逆转早期LF，肝移植是目前唯一有效治疗晚期LF及肝硬化的方法^{[3, 4]}，因此了解LF精准诊断及分期对指导治疗、患者预后判断具有重要的临床价值。

       肝活检一直被认为是诊断LF的参考标准，但其作为一种有创方法，存在许多并发症及局限性^[5]。肝功能Child-Puph分级虽然广泛应用于临床肝功能评估，但其5项指标对于评估肝实质病变敏感性不高，且容易受治疗因素影响。钆塞酸二钠(gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-EOB-DTPA)作为一种新型肝细胞特异性对比剂，前期研究证实Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期信号强度评价对LF诊断及分期具有较高的价值^{[5, 6]}。Hako等^[6]研究表明Gd-EOB-DTPA MRI是评估LF最准确的无创方法。Noren等^[7]研究结果显示LF分期显著影响着肝细胞对Gd-EOB-DTPA的特异性摄取。

       直方图作为一种新的肝纹理分析方法，可以采用数学模型分析肉眼看不到的图像灰度信息，准确、定量评估肝脏异质性随LF进展的变化^[8]，既往研究表明，MR直方图分析有助于LF的检测和分期，不同功能的MRI序列[包括弥散加权成像(diffusion weighted imaging)、敏感性加权成像(sensitivity weighted imaging)和磁共振弹性成像(magnetic resonance elastography)]的直方图分析对反映组织病理学异质性和诊断LF分期有很大的临床价值和意义^[9]。但目前尚未见基于Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期的直方图分析鉴别诊断LF的研究。因此，本研究拟探索Gd-EOB-DTPA增强肝胆期直方图分析成像对诊断LF的价值，为LF诊断及治疗提供客观的影像学依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型

       本研究经过本单位医学伦理委员会批准[批准文号：(2018)科第025号]前瞻性纳入100只健康新西兰雌性大白兔(6月龄，体质量2.0～2.6 kg)，单笼饲养(温度20 ℃～28 ℃，湿度40%～70%)，随机分为LF组(80只)和正常对照组(20只)。LF组^[10]颈背部皮下注射50％四氯化碳油(CC14)溶液(100％CC14与橄榄油1∶1均匀混合)，第1～3周剂量0.1 mL/kg，第4～6周剂量0.2 mL/kg，第7～10周剂量0.3 mL/kg，每周注射1～2次，对照组兔仅注射同剂量、等频率的生理盐水。

1.2 Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期成像

       在注射50％CC14溶液的第4、5、6、15周末随机选择20只LF兔和5只正常对照兔进行Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期成像。扫描前兔禁食12 h，肌注水合氯醛0.1 mL/kg，并在扫描过程中采用小动物麻醉仪(ABS-100，Y100141035，China)保持面罩吸入3.5%异氟烷维持麻醉。MRI扫描采用3.0 T超导MRI扫描仪(Philips Achieva，Philips Medical Systems，Best，the Netherlands)，18通道相控阵头颈线圈，保持兔仰卧位并用腹带固定腹部抑制呼吸。扫描序列包括：(1)轴位T1WI：重复时间(TR) 185 ms，回波时间(TE) 185/3.3 ms，翻转角(FA)=15°，扫描野(FOV) 160 mm×140 mm，层厚(ST) 4 mm，层间距(SP) 0.4 mm；(2)轴位Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期成像：采用多梯度回波序列，TR 1090 ms，TE 3.4～39.2 ms，翻转角15°，层厚4 mm，层间距0.4 mm，矩阵218×256。

1.3 图像分析

       Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期图像以DICOM格式存储，并传输到Firevoxel软件(FireVoxel，329；https：//wp.nyu.edu/firevoxel/downloads/)，由2名分别具有5年和10年以腹部影像学为研究方向的放射医师在双盲前提下对获取的MR图像分别独立进行直方图分析，如遇分歧则通过讨论解决。逐层手工勾画ROI以覆盖全肝，避免肉眼可见血管、胆管、伪影和肝边缘(图1)，获取全肝肝胆期直方图及以下参数值：平均值(mean)，中位数(median)，不均质性(inhomogeneity)，偏度(skewness)，峰度(kurtosis)，熵值(entropy)，第10 (10^th)、25 (25^th)、75 (75^th)和90 (90^th)百分位数。

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图1  Gd-EOB-DTPA肝胆期全肝直方图分析感兴趣区勾画示意图
图2  肝纤维化1期和3期在典型病理特征、肝胆期伪彩图及直方图的对比F1期兔病理图(A)、伪彩图(B)、直方图(C)，F3期兔病理图(D)、伪彩图(E)、直方图(F)

1.4 病理学检查

       Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期扫描完成后空气栓塞致死实验兔，取兔肝脏并置于10%福尔马林溶液浸泡，甲醛固定后制石蜡切片，行Masson染色后2名富有经验的病理医师于显微镜下进行Metavir分期：F0：无LF；F1：门静脉汇管区扩大，局限窦周、小叶内纤维化；F2：汇管区周围纤维化或少量间隔形成，小叶结构保留；F3：大量纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；F4：肝硬化。其中F1～F2期为早期LF，F3～F4期为晚期LF。

1.5 统计学分析

       采用SPSS 22.0和MedCalc 18.2软件进行统计学分析。采用Spearman相关性分析直方图各定量参数值与LF进展的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义，并以相关系数r值的绝对值大小表示相关性高低，|r|＞0.7、|r|=0.4～0.7、|r|=0.2～＜0.4分别代表强、中等、弱相关，|r|＜0.2代表无相关性。对于与LF进展呈现明显相关性的参数值，采用Mann-Whitney U检验比较各正常对照组、早期LF (F1～F2)、晚期LF组(F3～F4)之间定量参数值的差异性，并应用AUC值分析各定量参数值鉴别诊断F0与F1～F4、F0与F1～F2、F1～F2与F3～F4、F0与F3～F4的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔LF模型和病理学结果

       初步纳入研究的100只实验兔中，6只LF兔因不耐受CC14死亡，1只正常兔和3只LF兔因麻醉意外死亡而未纳入，1只正常对照组和5只LF兔因呼吸、运动伪影重导致Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期图像质量较差而排除，故最终纳入18只正常对照组兔和66只LF兔。F0期18只，F1期17只，F2期17只，F3期18只，F4期14只，早期LF (F1～F2)兔34只，晚期LF (F3～F4)兔32只。LF典型病理特征、肝胆期伪彩图及直方图如图2所示。

       F1期LF病理图，门静脉汇管区扩大，局限窦周、小叶内纤维化(2A)；F3期LF，大量纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化（2D；Masson 染色 ×100）；F1～F3期，肝胆期伪彩图Map信号减低(2B、2E)；F1期(2C)和F3期(2F)直方图，F1～F3期直方图向左偏移，参数值增大。

2.2 直方图参数值与LF进展相关性分析

       LF各期的全肝肝胆期图像直方图参数值的分布如表1所示。随着LF进展，不均质性(r=0.809)和90^th参数值(r=0.718)呈强正相关性(P＜0.001)，75^th (r=0.645)、熵值(r=0.546)、中位数(r=0.425)中等正相关性(P＜0.05)，峰度呈弱相关(r=0.305，P＜0.05)，而平均值、偏度、10^th、25^th、50^th与LF进展未见明显相关性，具体如表2所示。

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表1  肝纤维化不同分期直方图参数值(x¯±s)
Tab. 1  Histogram parameter values of different LF stages (x¯±s)

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表2  直方图参数值与兔肝纤维化进展的相关性
Tab. 2  Correlation between histogram parameter values and LF progression

2.3 不同LF分期直方图参数值比较

       如图3所示，中位数无法有效鉴别诊断，F0与F1～F4、F1～F2与F3～F4、F0与F3～F4期比较，峰度值差异不显著。熵值、不均质性、75^th、90^th可有效鉴别诊断正常、早期和晚期LF。

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图3  中位数(A)、峰度(B)、熵值(C)、不均质性(D)、75^th (E)、90^th (F)与兔肝纤维化进展箱式图

2.4 ROC诊断效能

       参数值不均质性鉴别诊断F0与F1～F4、F0与F1～F2、F0与F3～F4、F1～F2与F3～F4的AUC值分别为0.87、0.77、0.90、0.97，高于90^th (AUC=0.86，0.76，0.83，0.97)和75^th (AUC=0.79、0.66、0.87、0.92)，熵值(AUC=0.77、0.66、0.74、0.88)和中位数(AUC=0.69、0.59、0.71、0.80)诊断价值较低，而峰度值(AUC=0.63、0.57、0.63、0.71)诊断价值最低(表3；图4)。

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图4  F0与F1～F4 (A)，F0与F1～F2 (B)，F1～F2与F3～F4 (C)，F0与F3～F4 (D)分期的ROC曲线分析
Fig. 4  ROC curve analysis of F1～F4 (A)，F0与F1～F2 (B)，F1～F2与F3～F4 (C)，F0与F3～F4 (D).

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表3  直方图参数值诊断肝纤维化分期的ROC曲线分析
Tab. 3  ROC curve analysis of histogram parameter value in diagnosis of LF staging

3 讨论

3.1 实验背景

       Gd-EOB-DTPA能通过肝细胞膜有机阴离子转运多肽(organic anion transport polypeptide，OATP)转运吸收，LF进展引起肝功能受损，OATP减少，加之LF进展伴随的细胞外基质沉积增多引起Gd-EOB-DTPA摄取进入肝细胞内速度减慢、单位时间内进入肝细胞的量减少，导致摄取Gd-EOB-DTPA减少，因此肝胆期信号随LF进展降低^{[9, 10, 11, 12]}。本研究为肝胆期成像鉴别诊断LF提供理论基础。Hako等^[6]和Noren等^[7]学者研究证实肝胆期肝脏信号强度鉴别诊断早期(F1～F2)、晚期(F3～F4) LF的敏感度和特异度分别为96.30%、90.62%，但目前未见基于肝胆期直方图分析评价LF的研究。

3.2 直方图分析的优势

       直方图分析是纹理分析的一种方法，其利用数学方法对获得的图像数据的ROI灰度分布进行评价，量化病理变化的异质性，反映早期病理阶段肉眼无法检测到的细微变化，其突破了局限于大小、密度和形态学等传统影像学征象观察，能通过提取医学图像中的直方图参数值，对图像灰度值(像素)变化规律和分布模式进行深度挖掘、量化分析^{[13, 14, 15, 16]}。前期基于体素内不相干运动^[9]和扩散峰度成像^[13]的直方图分析可有效鉴别LF病理分期及分析图像灰度变化，为功能成像MR无创预测LF进展及诊断提供了新的研究思路。研究表明，LF与活化的肝星状细胞密切有关，肝星状细胞在LF过程中的形态、超微结构、基因表达和细胞功能均发生明显改变，显示其异质性。因此，直方图分析对LF的诊断和分期具有潜在价值。

3.3 MRI肝胆期全肝直方图各参数值结果以及原因分析

       本研究基于实验兔肝胆期全肝直方图分析的研究显示参数值不均质性可有效预测LF，而且诊断LF各期的效能较高，与Yang等^[17]学者的研究结果相符。随着LF进展，细胞外基质沉积、过度铁沉积及炎性水肿增加，肝血窦内皮细胞破坏，这一系列病理变化导致灰度异质性随LF进展增大呈正相关。本研究结果显示中位数鉴别诊断LF的价值较平均值高，这可能是由于平均值受肝脏边缘及噪声所引起的异常信号强度值影响^[15]。参数值90^th代表小于第90％体素区间内的平均灰度值，其与LF进展相关性较90^th更高、鉴别诊断价值较大，而较小的10^th较25^th诊断价值较低，提示较高的百分位数参数值更适用于反映HF病理特征，与Barry等^[18]和Zheng等^[19]的研究结果相符。

       偏度值代表总体灰度值直方图分布的对称性，偏斜程度越高代表偏度值越大。偏度值鉴别诊断各期LF的效能较低，表明随着LF进展直方图偏斜程度变化较小，本研究结果与Sheng等^[16]研究结果相符，Wang等^[20]研究结果显示，MR的T1图的直方图分析，特别是20 min肝结合蛋白-T1的熵，有助于预测LF分期。峰度值反映直方图分布形态陡缓程度，数值越大表示其分布的陡缓程度与正态分布差异越大。我们的研究发现峰度值随LF进展呈增加趋势，与Yoon等^[21]学者相符，表明随着LF进展直方图灰度值陡缓程度增加，峰度值可作为有效预测LF进展的影像学参数值。熵值代表全肝直方图参数值分布的复杂程度，熵值越大，则直方图分布越分散。在本研究中，熵值增加可反映LF进展，与Fujimoto等^[22]和Xu等^[23]的研究结果一致，Fujimoto等^[22]发现熵值随着纤维化程度的增加而增加。

       通过直方图分析参数值提取的量化参数虽然不能代表真正的病理状态，在本研究中，在整个肝脏的每一个轴位层面上描绘了感兴趣区，其所获得的定量参数反映整个肝组织纤维化的整体特征，所得到的参数值受主观因素影响较少，在一定程度上反映LF内在异质性，具有无创性、重复性高的优势。

3.4 不足与展望

       但本研究也存在一定的局限性：(1)虽然本研究基于肝脏最大层面勾画全肝直方图感兴趣区，但本研究仅分析肝脏最大层面的直方图分析特征，未能分析全肝三维特征。(2) CCl4诱导的兔模型无法准确反映人类肝脏组织的病理学变化，因此，高质量、前瞻性临床探究成为未来科研的方向。(3)多模态影像学对LF分级有一定研究，对F1级、F4级能够明确区分，但对于F1、F2级之间则区分困难，因此，寻找一种能有效反映LF细微变化的图像纹理分析，仍是今后研究探索的方向。

       总之，基于Gd-EOB-DTPA增强MRI肝胆期的直方图参数值分析对预测实验兔LF进展、分期和评价肝脏灰度异质性具有较高的诊断及鉴别诊断价值，有望成为无创评估LF的影像学方法。