失眠（insomnia disorder, ID）指患者对睡眠时长及质量不满意，并导致日间功能损害^[1]。ID患病率高达37.9%^[2]，是多种内科疾病及精神疾病的危险因素^{[3, 4, 5]}，且会导致认知缺陷^[6]，为社会带来巨大的经济负担^[7]。过度觉醒学说认为ID患者某些脑区过度活跃^[8]。蓝斑（locus coeruleus, LC）属于上行激活系统^[9]，是神经系统中去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）的主要来源^[10]。LC-NE系统被认为是调节觉醒和注意的关键系统^[11]。研究发现LC在ID患者的过度觉醒中起着重要作用^[12]。功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）通过血氧水平依赖可直观反映神经功能活动，已应用于ID的机制研究。功能连接（functional connectivity, FC）是fMRI常用研究方法之一，通过线性时间相关性来反映不同脑区之间的相互作用，以阐明大脑的功能活动与ID症状之间的神经关联^[13]。LC在睡眠觉醒中的作用日益受到重视，但目前对LC的研究多采用光遗传学和电生理方法^{[14, 15]}，功能影像学研究相对较少。本研究采用FC的方法，分析ID患者LC与全脑的FC的变化，为阐明ID脑功能机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究为前瞻性病例对照研究，研究对象为2018年12月至2021年9月北京中医医院针灸科门诊就诊的59例ID患者（ID组），纳入标准：（1）符合第5版《美国精神障碍诊断与统计手册》（DSM-5）中有关ID的诊断，睡眠困难持续至少3个月；（2）年龄18～60岁；（3）匹兹堡睡眠量表（Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI）评分＞8分；（4）汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale, HAMD）评分＜7分；（5）汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Scale, HAMA）评分＜14分；（6）过度觉醒量表（Hyperarousal Scale, HAS）评分＞32分；（7）近1个月未服用睡眠药物；（8）可配合完成MRI扫描；（9）签署知情同意书。

       排除标准：（1）发作性睡病、呼吸相关睡眠障碍、快速眼动睡眠障碍等其他类型的睡眠-觉醒障碍；（2）因精神障碍疾病及服用药物引起的继发性睡眠障碍；（3）患有严重内科疾患；（4）孕期及哺乳期妇女；（5）在MRI扫描中发现确切病变或头部解剖结构严重不对称者。

       同期从社会招募30例健康志愿者为健康对照（health control, HC）组。纳入标准：（1）年龄18～60岁；（2）无对睡眠数量及治疗不满的主诉；（3）PSQI评分＜8分；（4）HAMD评分＜7分；（5）HAMA评分＜14分；（6）HAS评分＜32分；（7）无内科及精神疾患；（8）无幽闭恐惧症或其他磁共振检查禁忌证；（9）签署知情同意书。

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，得到首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会批准（批准文号：2018BL-002-02），所有受试者均签署知情同意书，遵循自愿原则。

1.2 方法

1.2.1 收集临床量表资料

       由两位具有10年以上执业医师资格的神经内科主治医师分别对所有受试者进行PSQI、HAMA、HAMD及HAS等临床量表的评分，通过Kappa一致性检验后，结果取平均值。

1.2.2 数据采集

       所有受试者均在首都医科大学附属北京中医医院3.0 T磁共振扫描仪（Skyra; Siemens Medical System，Erlangen，Germany）上进行MRI扫描。采用磁化预备梯度回波序列对T1WI-3D脑结构图像进行扫描，扫描参数如下：TR 2300 ms，TE 2.32 ms，视野（field of view, FOV）240 mm×240 mm，翻转角（flip angle，FA）8°，层厚0.9 mm，矩阵256×256，切片数量192层，体素0.9 mm×0.9 mm×0.9 mm；采用轴位平面回波成像（echo-planar imaging, EPI）序列对静息态fMRI（resting-state fMRI, rs-fMRI）图像进行采集，扫描参数如下：TR 3000 ms，TE 30 ms，FOV 220 mm×220 mm，FA 90°，层厚3.0 mm，体素3.5 mm×3.5 mm×3.5 mm，切片数量32层，带宽1774 Hz。共采集240个全脑图像。

1.2.3 脑功能成像数据处理

       采用基于MATLAB 2018a平台的DPABI（http://rfmri.org/dpabi）进行数据的预处理及FC计算。

       预处理步骤主要包括：（1）将DICOM格式图像转换为NIFTI文件格式；（2）去除每个被试前10个时间点；（3）头动校正；（4）空间标准化，将每个个体fMRI图像通过EPI模板配准到标准化MNI空间；（5）空间平滑，为增加图像信噪比，以半峰全宽为6 mm×6 mm×6 mm进行高斯平滑；（6）去线性漂移，除去机器温度、受试者适应性等产生的线性趋化影响，以减轻被试呼吸、心跳对数据的影响。

       FC值计算：使用DPABI从Automated Anatomical Labeling 3（AAL 3）^[16]中提取双侧LC为感兴趣区（region of interest, ROI）并制作种子点模板，将ROI的时间序列与全脑所有体素的时间序列进行相关性分析，并将相关系数经Fisher转换为z值以增强正态性。

1.3 统计学处理

1.3.1 人口学数据及临床量表评分统计分析

       应用SPSS 26.0进行统计分析，计量资料符合正态分布的用均数±标准差（x¯±s）表示,组间比较采用独立样本ｔ检验，不符合正态分布则用中位数（四分位数间距）[M（IQR）]表示，组间比较采用秩和检验。计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3.2 影像学数据的统计分析

       将年龄、性别、头动参数作为协变量，应用DPABI将两组数据进行独立样本t检验，并采用高斯随机场（Gaussian random field, GRF）校正，显著阈值设定为体素水平P＜0.001且团块水平P＜0.05。提取出有差异脑区的Z值，使用SPSS 26.0将其与临床量表评分进行Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义，|r|值越大，相关性越强。

2 结果

2.1 人口学数据及临床量表评分比较

       ID组和HC组的人口学特征（年龄、性别、受教育年限）差异无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。各量表评分经Kappa一致性检验，Kappa值均＞0.75，具有较好一致性。ID组PSQI（12.15±2.34）、HAMA（10.81±2.37）、HAMD（5.61±0.67）、HAS（43.63±7.50）评分均明显高于HC组，差异具有统计学意义（P＜0.001）。详见表1。

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表1  两组受试者人口学及临床量表数据
Tab. 1  Demographic and clinical scale data of two groups

2.2 rs-fMRI比较

       与HC组比较，ID组LC与右侧额中回（middle frontal gyrus, MFG）的FC增强（GRF校正，体素水平P＜0.001，团块水平P＜0.05），未见FC减弱的脑区。详见表2及图1。

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图1  与健康对照者相比，ID患者LC与右MFG的功能连接增强（GRF校正，体素P＜0.001,团块P＜0.05）。以LC为种子点，ID患者较健康人全脑FC升高的脑区为右侧MFG，橙色代表FC增强。ID：失眠；LC：蓝斑；FC：功能连接；MFG：右侧额中回。
Fig. 1  Compared with the healthy group, the FC between LC and right MFG was enhanced in patients with ID (GRF correction, P-voxel＜0.001, P-cluster＜0.05). With LC as the seed point, the brain region with elevated whole-brain FC in more healthy ID patients was the right MFG, and orange represents the FC enhancement. ID: insomnia disorder; LC: locus coeruleus; FC: functional connectivity; MFG: middle frontal gyrus.

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表2  FC值组间分析结果显著的脑区（GRF校正，体素P＜0.001，团块P＜0.05）
Tab. 2  Brain region showing significant group differences in FC between groups（GRF correction, P-voxel＜0.001, P-cluster＜0.05）

2.3 LC-右MFG FC强度与临床量表的相关性

       相关性分析显示，PSQI（r=0.40）、HAMA（r=0.39）、HAMD（r=0.39）、HAS（r=0.46）评分与LC-右MFG的FC强度呈显著正相关（P均＜0.001），见图2。

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图2  功能连接强度与临床量表评分的相关性散点图。PSQI：匹兹堡睡眠量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAS：过度觉醒量表；FC：功能连接。
Fig. 2  Correlation analysis between FC values and the scale scores. PSQI: Pittsburgh Sleep Quality Index; HAMD: Hamilton Depression Scale; HAMA: Hamilton Anxiety Scale; HAS: Hyperarousal Scale.

3 讨论

       本研究使用fMRI评估ID患者LC与其他脑区相互作用的变化。结果显示与HC组相比，ID患者LC与右侧MFG的FC值显著上升，且与PSQI、HAMA、HAMD、HAS的评分呈正相关。提示LC与右MFG的FC的增强可能与ID患者的过度觉醒状态及焦虑抑郁情绪相关。该研究从影像学角度证实了LC在ID过度觉醒中的重要作用。

3.1 LC与过度觉醒假说

       过度觉醒是目前最为广泛接受的ID机制学说，认为ID患者在躯体、认知以及脑功能活动方面存在着高度觉醒^[17]。LC作为上行激活系统的重要组成部分，其分泌的NE在促进觉醒、抑制睡眠方面发挥重要作用^[18]。LC-NE系统在觉醒状态下保持高度活跃，并可通过不同受体调节腹外侧视前区（ventrolateral preoptic area, VLPO）中的睡眠、觉醒活动神经元^[15]，去甲肾上腺素能系统的功能障碍可导致睡眠微结构的改变^[19]，Alejandro等^[20]发现激活或抑制LC可以调节睡眠脑电的纺锤节律并调节心率变异，认为LC-NE构成警觉促进机制，该系统的过度活跃使哺乳动物更容易被唤醒。rs-fMRI研究也证实LC对于维持觉醒和调节睡眠觉醒状态非常重要。Song等^[12]发现，LC在功能上与诸多脑区相连，改变觉醒状态时，LC与多个脑区的连接也会发生变化，提示其参与形成觉醒环路。Gong等^[21]发现与健康对照组相比，ID患者LC与额下回的FC降低，与左缘上回和左枕中回的FC升高。李春龙等^[22]发现慢性ID患者LC与默认网络的大部分脑区FC增强，推测ID患者DMN脑区的皮层可能接受高度唤醒系统中LC的纤维投射，从而导致从清醒到睡眠的转化障碍或睡眠难以持续。以上研究说明，作为促进觉醒的重要结构，LC与其他脑区存在着异常的FC，进一步从影像学角度支持慢性ID的过度觉醒学说。

3.2 LC-右MFG FC升高的意义

       MFG属于背外侧前额叶（dorsolateral prefrontal cortex, dLPFC），是认知控制网络（cognitive control network, CCN）的重要脑区，参与执行功能和认知控制^[23]。多项影像学研究发现dLPFC在睡眠中发挥作用。Joo等^[24]发现ID患者双侧dLPFC的灰质密度降低及灰质体积减小；经颅磁刺激dLPFC能够提升ID患者的睡眠质量^[25]。Nofzinger等^[26]发现ID患者双侧dLPFC的兴奋性增强，认为可能是其对外界刺激过度关注的主要原因。Axelrod等^[27]发现对左侧dLPFC进行兴奋性刺激后，会导致受试者认知的过度觉醒，从而导致走神的倾向性增加。Vanessa等^[28]发现抑制左侧dLPFC可以提高受试者对于任务的专注程度。Qi等^{[29, 30]}发现睡眠剥夺使MFG与下丘脑及脑岛的FC减弱，认为是导致受试者警惕性注意力下降的原因。本试验结果同样显示ID 患者LC-右MFG连接与HAS评分呈正相关，且与PSQI评分呈正相关，说明二者之间的连接增强是参与过度觉醒并导致睡眠质量下降的潜在机制。

       MFG还参与情绪的调节，其活动会影响杏仁核对于刺激的反应，从而导致焦虑症状的出现^[31]，从临床量表结果可以看出，虽然我们纳入的ID患者未达到焦虑症或抑郁症的诊断，但其HAMA和HAMD的评分仍然显著高于睡眠正常的对照组，且FC强度与HAMA、HAMD评分成正相关，说明MFG FC的增强或许与ID患者的焦虑抑郁状态有关。

       本研究结果提示与HC组相比，ID患者LC与右MFG的FC值显著上升（GRF校正，体素水平P＜0.001，团块水平P＜0.05），并与临床过度觉醒、睡眠质量及焦虑抑郁量表评分相关，提示LC与右MFG FC的增强可能是引发ID患者的过度觉醒状态及焦虑抑郁情绪从而导致睡眠质量下降的潜在脑功能机制。

3.3 局限性

       本研究有以下几点不足：（1）研究中纳入的样本量过少；（2）缺乏多导睡眠监测等客观数据；（3）LC分泌NE参与睡眠觉醒调节，本研究中未涉及NE测定，在今后的研究中可加入相应指标检测。

       综上所述，ID患者LC与右MFG FC增强可能与ID患者过度觉醒状态有关，并且可能导致ID患者的焦虑抑郁情绪，从而引起各种形式的日间功能障碍。本研究以LC为ROI，为ID的过度觉醒学说提供了影像学依据，揭示了ID的发病脑功能机制，进一步验证了LC在睡眠觉醒中的重要作用，为ID治疗靶点的选择提供了新思路。