本课题组在前期研究的结果中证实，扩散加权MRI (diffusion-weighted MRI，DWI）活体检测rAd/p53治疗人类结肠癌荷瘤裸鼠24 h即可以出现具有统计学意义的改变^[1]。同时也发现，rAd/p53+5-FU治疗非耐药SW480结肠癌荷瘤裸鼠，可以加速肿瘤细胞的凋亡及提高p53蛋白的表达^[2,3]。笔者进一步运用DWI观察rAd/p53逆转耐5-FU人类结肠癌耐药性效果早期改变，探索DWI活体评价rAd/p53逆转耐5-FU人类结肠癌效果早期疗效的标记物。

1　材料与方法

1.1　对5-Fu耐药的结肠癌细胞株制作

       人类结肠癌SW480细胞系（购自中山大学动物中心细胞库）培养于RPMI-1640培养液（含10％胎牛血清（杭州四季青公司）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基)、37°C，5%CO2孵箱中。采用逐步提高培养基中5-氟尿嘧啶(5-FU）浓度间歇诱导肿瘤细胞耐药，5-FU药物浓度从0.5 μg/ml开始，1~2 d换液一次，待细胞重新从此浓度生长至对数生长期时再次提高药物浓度（依次为1 μg/ml、1.5 μg/ml、2 μg/ml、2.5 μg/ml、3 μg/ml、3.5 μg /ml、4 μg/ml、4.5 μg/ml、6 μg/ml)，连续培养5个月，获得能够在6 μg/ml 5-FU浓度中稳定生长的人类结肠癌SW480耐药细胞株（SW480/5-FU)。

1.2　动物模型制作

       本项目经中山大学实验动物中心伦理委员会审查通过。选取鼠龄4周的健康BALB/c裸小鼠（购自中山大学实验动物中心），体重约16~18 g，前期研究所采用组织块移植方法^[1,2,3]制作耐5-FU结肠癌SW480/5-FU荷瘤鼠，100只。

       荷瘤鼠肿瘤1.5 cm左右，活体测量肿瘤体积(V=π／6×长×宽×高），将上述荷瘤鼠分随机成三组：对照组（给予生理盐水）、rAd/p53组（深圳赛百诺生物科技公司）、5-FU组、rAd/p53+5-FU组。rAd/p53用量为1×10⁷ VP (virus particle)/mm³肿瘤，5-FU（武汉远城科技发展有限公司）用量为0.5~0.9 cm的肿瘤用25 mg，1.0~1.4 cm的肿瘤为50 mg，1.5 cm以上的肿瘤为75 mg^[2,3]。给药途径为直接瘤内注射。

1.3　MRI及实验室检查

1.3.1　MRI检查

       治疗后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h每组随机抽5只荷瘤鼠，水合氯醛麻醉（4.5％水合氯醛2 ml/100 ml，腹腔注射），采用SIEMENS MAGNETOM Verio-3.0 T超导型磁共振成像系统及配套腕关节正交线圈进行检查。

       (1) T2WI快速自旋回波（TSE)：TR 4500 ms，TE 82 ms，层厚2 mm，间隔0，FOV 128mm×128mm，NAS为4，SENSE加速因子为2，采集矩阵128×128，重建矩阵512×512，行轴面、冠状面、矢状面成像，成像时间3 min 45 s（图1A)。(2) DWI：采用单次激发平面回波成像序列（single shot echo planar imaging, EPI)，横轴面成像，TR 5900 ms, TE 100 ms，按各向同性施加扩散敏感梯度场，取b值= 800 mm²/s，成像时间9 min 26 s。FOV 220 mm×220 mm，NAS为3，层厚2 mm，采集矩阵220×220，重建矩阵308×308。采集的起止范围与T2WI轴面绝对一致（图1B)。

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图1  荷瘤鼠肿瘤T2WI成像(A）与ADC图(B)
Fig. 1  The T2 weighted image (A) and ADC map (B) of tumor in nude mice.

1.3.2　标本检测

       BALB/c裸小鼠于磁共振检查完毕后，腹腔注射5倍于麻醉量的10％水合氯醛处死，在无菌状态下掏出肿瘤，以最大径线处一分为二，放入缓冲福尔马林溶液中，以便进行石蜡包埋切片及细胞凋亡检测。

1.3.3　数据收集

       DWI数据的采集使用西门子磁共振成像仪工作站输出ADC图，在肿瘤最大横切面利用感兴趣区（ROI)自动测量并计算出ADC值，ROI放置在肿瘤边缘非坏死区最大区域，ROI面积为8~75 mm² （图1B)。

       HE染色与TUNNEL结果分析：病理切片由2名病理科医师分别按同一标准在显微镜下阅片分析，取2名医师所采集的均值为病理的检测最终结果数值。TUNNEL检测阳性细胞为细胞核呈棕黄色，在×100视野下观察并估算切片内TUNNEL染色阳性细胞与形态为死亡细胞的肿瘤细胞面积的百分比为肿瘤凋亡范围。

1.4　统计学方法

       采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理，数据用 ± s表示，数据符合正态分布两组之间比较用t检验，数据符合正态分布相关性分析采用Pearson相关检验，数据不符合正态分布相关性分析采用Spearman相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　DWI检测结果

       5-FU组24 h、48 h时ADC值较对照组减少，72 h、120 h、168 h时ADC值较对照组增加，两者之间的差别无统计学意义(P值分别为0.223、0.151、0.135、0.748、0.369；表1)。

       rAd/p53组及rAd/p53+5-FU肿瘤边缘（24 h、48 h、72 h、120 h、168 h) ADC值均较对照组增大，两者之间的差别均有统计学意义(P<0.05；表1)。

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表1  不同组各时间点肿瘤ADC定量结果( ± s，× 10^-4 mm²/s)
Tab. 1  ADC values of different groups at observed time point ( ± s, × 10^-4 mm²/s)

2.2　治疗组与对照组肿瘤凋亡（TUNNEL）情况比较(±s)

       对照组与各治疗组不同时间点荷瘤鼠肿瘤组织均见癌细胞凋亡（表2)。5-FU组癌细胞凋亡范围较对照组有增大，两者差别没有统计意义(P值分别为0.069、0.160、0.174、0.127、0.083)；rAd/p53与rAd/p53+5-FU治疗组癌细胞凋亡较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)；rAd/p53+5-FU组癌细胞凋亡较rAd/p53组增加，24 h两者差别无显著性(P=0.055)，在48 h、72 h、120 h、168 h差异有统计学意义(P<0.05)。

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表2  不同治疗组肿瘤凋亡(TUNNEL)情况比较( ± s)
Tab. 2  The area ratios of tumor cell apoptosis of different groups at observed time point ( ± s)

2.3　ADC值与肿瘤凋亡的相关性分析

       5-FU治疗组，肿瘤ADC值与肿瘤细胞凋亡范围无相关性(r=0.090，P=0.805)；rAd/p53治疗组，肿瘤ADC值与肿瘤细胞凋亡范围呈正相关性(r= 0.427，P= 0.001)；rAd/p53+5-FU治疗组肿瘤ADC值与肿瘤细胞凋亡范围呈显著正相关(r=0.571，P=0.000)。

3　讨论

       大多数结肠癌患者诊断时已是中晚期，治疗主要以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU）为主的化疗性姑息治疗，但肿瘤细胞本身或在化疗过程中出现对5-FU的耐受使患者无进展生存期仅8.7~12.3个月^[4]，也成为结肠癌临床化疗的主要问题。有研究结果提示肿瘤抑制基因p53的突变或丢失可促进耐药性产生^[5,6,7,8]。

       rAd/p53抗癌机制之一就是逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性或增加肿瘤细胞对化疗的敏感性^[9,10,11,12]。实验研究证实，腺病毒介导的野生型p53可逆转对5-FU耐药的人类结肠癌LoVo/5-FU的MDR^[9]与对阿霉素耐药的人类乳腺癌MCF-7/ADM的MDR^[10]，或增加胃癌对奥沙利铂的敏感性^[11]、膀胱癌细胞对长春新碱的敏感性^[12]。临床试验研究发现，放疗与化疗无效的结肠癌肝脏转移瘤的患者经肝动脉插管注入腺病毒包装的p53基因，随后给予5-FU或放射治疗，可见肿瘤缩小，并生存期较无反应的患者明显提高^[13]。本课题组前期研究首次显示rAd/p53与5-FU对结肠癌荷瘤鼠有相互协同抗癌作用^[2,3]。本研究针对耐药结肠癌进行研究，通过构建表达突变型p53的耐5-FU人类结肠癌SW480/5-FU裸鼠耐药模型，对模型分别给予5-FU、rAd/p53、rAd/p53+5-FU治疗，与对照组对比，5-FU组肿瘤细胞凋亡范围无明显增加，rAd/p53组凋亡范围有意义增大，rAd/p53+5-FU凋亡范围进一步增加，提示rAd/p53本身对耐药肿瘤具有促进凋亡作用，同时与5-FU有协同抗癌作用，进一步说明具有逆转SW480/5-FU对5-FU的耐药性。

       而如何及时、准确的判断结肠癌的耐药性及p53干预后耐药性的逆转效果，以决定是否行单独化疗或联合p53基因治疗或其它治疗以及治疗的时间间隔等，寻找一种较客观、准确、能在活体状态下及时检测肿瘤耐药性及评价p53逆转耐药性效果的影像技术十分必要，对指导临床治疗中晚期结肠癌、提高结肠癌疗效有重要意义。

       DWI通过影像量化反应活体组织内水分子扩散运动，显示活体组织在分子和细胞水平上的生物学过程，已作为内源性分子影像技术用于活体结构改变前功能变化的探索^{[14,15,16,17,18]}，以及治疗前肿瘤对治疗的敏感性预测研究^[17,18,19]。扩散成像信号改变的水分子运动源自三个腔隙：细胞内间隙扩散、细胞外间隙扩散、血管内间隙扩散，表观扩散系数值（apparent diffusion coefficient，ADC）反映组织扩散特征的量化值，与细胞内外成分的比例有关，并随着组织或细胞密度的增加而降低^[14,15,16]；而细胞密度可以作为肿瘤侵袭性的指征，随着细胞密度的增加，肿瘤的转移性增加；除了细胞膜，细胞骨架、有机质、基质纤维和可溶性大分子对肿瘤的扩散受限起到了作用^{[2, 15,16]}。肿瘤治疗常引起肿瘤血管与细胞发生变化，导致三腔隙水分子扩散运动改变，成为DWI定量评估肿瘤治疗效果的分子基础^[14]。因此，DWI提供了与组织生物物理特性、细胞和细胞膜结构有关的独特信息，如细胞的组织结构、微结构和微循环。

       文献报道，DWI对晚期结肠癌辅助放化疗或抗肿瘤血管生成的治疗效果的预测研究结果有冲突^{[17, 19,20,21,22,23,24,25,26]}。大多数的研究结果显示对治疗有较好疗效或有效的肿瘤组织治疗前ADC值低于疗效差或无效的肿瘤组织^{[17, 19,20, 22,23,24]}，也有研究者的结果提示治疗有效与治疗无效的肿瘤组织治疗前的ADC值没有差别^{[21, 25,26]}。对结肠癌肝转移患者行一线化疗研究结果提示治疗前肿瘤组织的ADC值偏低者的无进展生存期与总生存期较短^[19]。尽管如此，在对晚期结肠癌放化疗、抗血管生成治疗的研究均提示DWI在治疗早期即可显示ADC值升高，对疗效的评价早于解剖影像的评价^{[1, 17,18,19,20,21,22,23,24]}。

       本研究基于DWI观察肿瘤对放化疗的敏感性预测的启发，将DWI用于结肠癌耐药性逆转评价。对耐5-FU的结肠癌SW480/5-FU荷瘤鼠，单独5-FU治疗，肿瘤的凋亡范围和ADC值与对照组对比无显著性变化；经rAd/p53或rAd/p53+5-FU治疗后24 h，肿瘤的凋亡范围和ADC值出现有意义增高，并联合治疗组凋亡范围和ADC值较单独rAd/p53组增加值高，治疗后ADC值与肿瘤凋亡范围呈正相关。野生型p53蛋白通过阻止肿瘤G1期细胞进入S期，通过多种途径引起p53触发凋亡机制清除肿瘤细胞^[5,6,7,8]。本研究的结果提示外源野生型p53增加了5-FU引起的癌细胞凋亡，可逆转结肠癌对5-FU的耐药性，使5-FU对耐药癌细胞发挥抗癌效果。笔者推测耐药肿瘤组织经rAd/p53或rAd/p53+5-FU干预后，促发肿瘤细胞凋亡，细胞体积缩小，细胞之间连接消亡，与周围的细胞分开，细胞浓缩，肿瘤细胞内细胞器碎裂、溶解，导致细胞数目减少，细胞间隙增宽，细胞膜完整性受到破坏，使水分子扩散能力增强，ADC值升高。

       综上所述，rAd/p53可逆转耐药结肠癌组织对5-FU的耐药性，DWI通过无创检测肿瘤内水分子扩散的改变，通过量化的实时ADC值，反映活体肿瘤内病理生理改变信息，可提供p53逆转耐药结肠癌早期疗效活体评价的生物标记物。本实验结果对临床研究的指导作用有待进一步探讨。