乳腺癌是一种生物学特征高度异质性的恶性肿瘤，乳腺癌的雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2 ，HER-2）及细胞增殖抗原标记物Ki-67 (antigen identified by monoclonal antibody Ki-67，Ki-67)四种免疫组化指标是判断预后的主要因素、对治疗方案的指导起到重要作用。传统的单指数DWI模型所得到的ADC值（standard ADC）同时受到组织内水分子扩散和微循环灌注两种成分的影响，不能全面反映组织的水分子的运动情况。Le Bihan等^[1]学者针对这一问题提出"体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion，IVIM）"模型，最初应用于脑成像，现已广泛应用于全身成像^[2]。体素内不相干运动扩散加权成像（intravoxel incoherent motion diffusion-weighted imaging，IVIM-DWI）将弥散效应和灌注效应区分开，则可更为准确的评价组织的扩散运动及微循环灌注情况。本研究旨在基于DWI和IVIM-DWI技术，探究乳腺癌ADC值和IVIM-DWI多参数值（D值、D^*值、f值）与乳腺癌免疫组化指标（ER、PR、HER-2和Ki-67）不同表达情况之间是否具有统计学差异，进而探究IVIM-DWI对乳腺癌生物学行为、预后预测等方面的价值和潜力。

1　材料与方法

1.1　临床资料

       前瞻性搜集自2015年11月至2016年2月上海交通大学医学院附属新华医院术前怀疑为乳腺癌的患者，均于Philips公司3.0 T MRI （Ingenia）机行术前MRI检查。所有患者在检查前均签署知情同意书。追踪所有手术病人病理结果，最终入组经病理确诊的乳腺癌患者共51例，所有患者均为女性，年龄范围29~85岁，平均年龄55岁。

1.2　仪器与方法

       采用Philips Ingenia 3.0 T超导型磁共振扫描仪和乳腺专用相控线圈。受检者俯卧位，双侧乳腺自然悬垂于检查线圈内。扫描序列包括：(1)常规三平面定位及校正。（2）轴面T2WI-SPAIR序列，TR 5000 ms，TE 65 ms，层厚4 mm，间隔0 mm，矩阵400×382，FOV 32 cm×37 cm，激励次数1，层数40。（3）轴面IVIM，b值取0, 10, 20 ，50, 100, 200, 500和800 s/mm²，TR 5098 ms，TE 69 ms，层厚4 mm，间隔1 mm，矩阵140×93 ，FOV 35 cm×24 cm，激励次数1，层数32。(4)轴位动态增强扫描，采用美国GE公司专有的乳腺容积成像序列eTHRIVE，横轴面扫描，TR 4.1 ms，TE 2.1ms，层厚1 mm，间隔0 mm，矩阵336 ×405，FOV 28 cm×34 cm，激励次数1，层数150。对比剂采用钆喷酸葡胺注射液（Gd-DTPA） 0.2 mmol/kg。高压注射器开始注药后立即进行扫描，连续扫描5期。

1.3　图像分析处理

       由2名从事乳腺影像诊断的放射科医师，利用单指数DWI模型测量ADC值，利用双指数IVIM模型对多b值DWI进行后处理，通过飞利浦后处理工作站相关软件(DWI-tool)获得IVIM各参数值：D值、f值及D^*值。感兴趣区（region of interest，ROI）的选择：结合动态增强及常规T2WI综合确定病灶范围，避开囊变区及坏死区，取病灶高信号区最均匀处作为ROI ，ROI面积需小于病灶，测量三次并取平均值。每次所选取的感兴趣区依据所测对象大小而不同，面积在6~50 mm²之间。

1.4　免疫组化指标的检测和判定

       阳性结果染色呈棕黄色或棕褐色颗粒，阴性细胞无着色，以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。HER-2阳性部位在细胞膜，ER、PR和Ki-67阳性部位在细胞核。

       ER和PR表达判定标准：评估整张切片中阳性染色的肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的比例，当≥1%的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色时，即为阳性；整张切片中<1％的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色或完全无着色，即为阴性^[3]。

       HER-2表达判定标准：观察细胞膜着色的浸润癌细胞的比例及着色强度，结果分为（－）～（+++），结果判读标准（按每张切片计）：（－）：无染色或≤10％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；(+) ：>10％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；（++）：有两种情况，第一种为>10％的浸润癌细胞呈现不完整和（或）弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；（+++）：>10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。对于+＋的病例，应该做Fisher检测，有扩增者为阳性组，无扩增者为阴性组。将（－）、（+）、（++）无扩增定义为阴性组，将（++）扩增、（+++）定义为阳性组^[4]。

       Ki-67表达判定标准：正确的Ki-67免疫组织化学染色阳性应定位于细胞核，评估Ki-67阳性指数时应计数核阳性的肿瘤细胞百分比，但目前尚无统一的Ki-67阳性指数评估体系，绝大部分病理科采用人工计数的方法来评估Ki-67阳性指数。Ki-67高低表达的判定值文献报道高低不一，2009年Cheang等^[5]将Ki-67阳性指数临界值定为14%，被2011年欧洲St．Gallen乳腺癌共识所采纳。本研究采用14％作为判断Ki-67高低的界值。

1.5　统计学方法

       所有统计学分析均采用SPSS 19.0软件进行。使用单样本S-W检验各样本的正态分布性，正态分布数据行两独立样本t检验，非正态分布数据行非参数检验（Mann-Whitney U检验）进行比较。探究乳腺癌ADC值和IVIM-DWI多参数值（D值、D^*值、f值）与乳腺癌免疫组化指标(ER、PR、HER-2和Ki-67)不同表达情况之间是否具有统计学差异。所有统计分析均以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　临床特征与病理结果

       51例患者中，2例患者双侧均为浸润性导管癌，2例患者为单侧乳腺两个病灶。51例患者共55个病灶，病理类型以浸润性导管癌为主（45例，82 %），导管内癌3个，导管内乳头状瘤或不典型导管上皮增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）伴癌变2个，导管内癌伴微浸润2个，实性乳头状癌1个，小管癌2个。根据免疫组织化学染色结果判定：ER阳性45个病灶，阴性10个病灶；PR阳性40个病灶，阴性15个病灶；HER-2阳性14个病灶，阴性41个病灶；Ki-67高表达36个病灶，低表达19个病灶（图1，图2）。

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图1  女，46岁。A：DCE-MRI显示右乳内上异常强化肿块，形态不规则，边缘毛刺状，增强后肿块内部不均匀强化。B：DWI上肿块呈稍高信号，ADC值为0.70×10^-3 mm²/s。C、D：使用Phillips后处理软件DWI-tool，选定双指数IVIM模型和相关层面，合理选取ROI，测得病灶D值、D^*值和f值分别为0.61×10^-3 mm²/s，15.56×10^-3 mm²/s，9.6%。E~G：D值、D^*值及f值伪彩参数图。H：病理提示"右乳晕上方"浸润性导管癌，WHO Ⅱ级。I：病理免疫组化结果显示Ki-67(30%+)
图2  女，63岁。A：DCE-MRI显示左乳内下节段性异常强化灶。B：DWI上病灶呈高信号，ADC值为1.12×10^-3 mm²/s。C、D：使用Phillips后处理软件DWI-tool，选定双指数IVIM模型和相关层面，合理选取ROI，测得病灶D值、D^*值和f值分别为1.05×10^-3 mm²/s，51.64×10^-3 mm²/s，8.0%。E~G：D值、D^*值及f值伪彩参数图。H：病理提示"左乳"浸润性导管癌，Ⅱ级。I：病理免疫组化结果显示Ki-67(10%+)
Fig. 1  Female, 46 years. A: There was an irregular mass with spiculated margin in the upper inner quadrant of the right breast. The lesion showed inhomogeneous enhancement. B: Diffusion weighted imaging showed a slightly high signal lesion, ADC map derived from monoexponential model. ADC value was 0.70×10^-3 mm²/s. C, D: IVIM parameters (D, D^*, f) values were obtained using multi-b-value DWI with a biexponential curve fitting on Philips DWI-tool. The D, D^*, and f value was 0.61×10^-3 mm²/s, 15.56×10^-3 mm²/s, and 9.6%, respectively. E-G: D, D^*, and f maps originated from IVIM model. H, I: The pathology was invasive ductal carcinoma, grade 2, Ki-67> 30%.
Fig. 2  Female, 63 years. A: DCE-MRI showed non-mass lesion with segmental distribution in the left breast. B: The lesion showed high signal on DWI. The ADC map derived from monoexponential model. ADC value was 1.12×10^-3 mm²/s. C—D: IVIM parameters (D, D^*, f) value were obtained using multi-b-value DWI with a biexponential curve fitting on Philips DWI-tool. The D, D^*, and f value was 1.05×10^-3 mm²/s, 51.64×10^-3 mm²/s, and 8.0%, respectively. E—G: D, D^*, and f maps originated from IVIM model. H, I: Pathology proved breast invasive ductal carcinoma, grade 2, Ki-67>10%.

2.2　免疫组化指标与ADC值和IVIM多参数值之间的关系

       Ki-67高表达组与低表达组组间D值的差异具有统计学意义（高表达组：(0.80±0.16)×10^-3 mm²/s，低表达组：(0.88±0.14)×10^-3 mm²/s ，P=0.046)，两组间D^*值、f值和ADC值未见显著性差异。

       ER、PR及HER2阳性组与阴性组组间的D值、D^*值、f值和ADC值的差异均无统计学意义。具体数据详见表1。

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表1  55例乳腺癌免疫组化指标表达情况与ADC和IVIM各参数
Tab. 1  ADC or IVIM parameters of breast cancer and immunohistochemical index in 55 lesions

3　讨论

       乳腺癌的发生与ER、PR分泌过多和长期作用有关，ER、PR的检测对判断乳腺癌的预后、指导内分泌治疗具有一定的意义^[3]，ER、PR阳性患者对激素治疗反应性高，通过内分泌治疗，可显著改善患者预后，尤其ER、PR均阳性患者有更好的内分泌治疗效果，且ER、PR阳性的乳腺癌一般分化好、发展慢，术后不易复发，生存率高。HER-2高表达的乳腺癌，细胞整合素和黏合素功能异常，侵袭力强，容易发生转移，预后差^[6]。细胞增殖抗原标记物Ki-67是一种与细胞增殖周期有关、参与DNA合成的蛋白质，Ki-67阳性指数是评估肿瘤细胞增殖活性的重要指标，可用于判断乳腺癌的预后，影响乳腺癌治疗方案的选择，预测和判断乳腺癌治疗的疗效^[7]。

       国内外关于ER、PR表达与ADC值之间相关性的研究较多，但目前尚无统一定论。Jeh等^[8]对107例IDC患者研究发现，ER阳性表达的乳腺癌ADC值较低。Choi等^[9]对290例浸润性导管癌研究发现，ER、PR阳性组的ADC值低于ER、PR阴性组并具有统计学意义。然而，Sun等^[10]对52例浸润性导管癌研究发现，ER、PR、HER-2阳性组与阴性组的ADC平均值差异均无统计学意义(P>0.05)。传统的单指数模型ADC值在一定程度上可以从分子水平评价疾病的病理生理状态，但是生物活体内除了组织内水分子的扩散外，微循环内的血液像水分子一样在做无规律的运动，因而扩散加权图像同时受水分子扩散和微循环血液灌注的影响^[11,12]，也就是说，传统的ADC值不能单纯地反映水分子的扩散运动，它并没有排除血液微循环灌注的影响。

       文献报道，乳腺恶性肿瘤的肿瘤血管生成会不同程度增加，灌注效应会导致恶性病灶的ADC值显著升高，即微循环灌注和组织细胞构成从完全相反的方向影响ADC值^[13]，且病变组织内微血管密度（microvessel density，MVD）在肿瘤边缘区高于中心区。对于乳腺恶性肿瘤，灌注效应的影响是不可忽视的^[14]，Sigmund等^[15]认为乳腺癌的微循环灌注平均约占ADC值的10% , Bokacheva等^[16]研究发现在81%的乳腺癌IVIM模型中的，微循环灌注效应的比例大于4%。IVIM双指数模型可以通过多b值弥散加权成像生成双指数拟合曲线，进而计算出定量多参数值，其中，纯扩散系数D (Slow ADC)剔除了微循环灌注因素的影响，更为真实地反映了水分子真实的扩散情况，直接反映了组织的细胞密度，从而提高了诊断的敏感性；另外，也能在无需对比剂的条件下得到相对应的灌注参数：灌注相关扩散系数D^* (FastADC)及微血管内容量分数f (fraction)^[17,18]，反映出病变血流灌注的信息。本研究采用IVIM-DWI将扩散和灌注分离开，结果显示，ER、PR、HER2阳性组与阴性组的ADC值及IVIM各参数值（D值、D^*值、f值）之间差异均无统计学意义。文献报道，ER对血管生成途径有抑制作用，从而诱导灌注减少，进而影响ADC值^[8,9,19]。Hyder等^[20]研究发现，PR通过调节乳腺癌细胞的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促进血管生成。即ER、PR对ADC值的影响是通过影响血管生成实现的。笔者推测ER、PR、HER2与IVIM各参数无明显相关性，可能是由于ER、PR阳性表达对微循环灌注影响小，且微循环灌注效应本身在恶性肿瘤IVIM模型中所占比例较小，远不及组织细胞密度影响大；还有可能与选取较小的ROI且避开灌注丰富的边缘区域有关。

       Choi等^[9]对290例浸润性导管癌研究发现，Ki-67高表达组的ADC值低于Ki-67低表达组并具有统计学意义(P=0.028)。Sun等^[10]对52例浸润性导管癌研究发现，Ki-67高表达组和低表达组的ADC平均值差异无统计学意义(P=0.087)。本组结果显示，Ki-67高表达组和低表达组的ADC平均值差异无统计学意义(P=0.491)，而Ki-67高表达组的Slow ADC平均值低于Ki-67低表达组并具有统计学意义(P=0.046)，这充分说明了ADC值不能单纯地反映水分子的扩散运动，Slow ADC值诊断的敏感性高，因去除了微循环灌注影响，可真实地反映组织细胞的密度和水分子真实的扩散情况，并且Ki-67高表达的乳腺癌较Ki-67低表达的乳腺癌细胞增殖旺盛，细胞密度较高，细胞外间隙相应减小，水分子扩散运动受限更为明显，因此代表水分子真实扩散的Slow ADC平均值更低。

       综上所述，乳腺癌Ki-67高低表达组的IVIM-DWI定量参数D值存在统计学差异，提示了通过非侵入性的影像学检查方法预测Ki-67表达情况的潜能，即可望通过IVIM-DWI的D值来预测肿瘤的Ki-67增殖指数，进而用于判断乳腺癌的预后，为乳腺癌患者治疗方案的选择提供一定的参考，预测和判断乳腺癌治疗的疗效。笔者初步探索了IVIM多参数预测乳腺癌免疫组化指标表达情况的可行性，预示了此技术的应用前景，但还需要更大数量的样本研究来证实。