原发性全面强直阵挛癫痫（generalized tonic-clonic seizure，GTCS）作为特发性全身性癫痫(idiopathic generalized epilepsy，IGE）中最常见的一种亚型，其临床表现为无明显诱因的全身强直阵挛发作，脑电图表现为广泛性棘慢复合波发放，而在常规MR检查中无脑结构异常。长期的癫痫发作可严重损害患者的意识状态和认知功能。目前对癫痫发病的确切成因尚不明确，但通过观察静息态下全脑自发脑神经活动的特点有助于加深对其发病机理的认识^[1]。小脑通常被认为是负责躯体运动调节的重要脑区，但近些年的研究提示小脑也参与认知、情感等调节功能^[2]，基于静息态功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI)技术的研究表明GTCS患者的小脑自发脑活动存在异常^[3,4]。然而之前的研究主要从全脑层面考察脑功能活动，对大脑和小脑之间功能连接关系研究较少，GTCS患者静息态下大脑和小脑之间的功能连通性改变特点需深入研究。本研究采用静息态下全脑低频振幅(amplitude of low-frequency fluctuations ，ALFF)指标，结合基于种子点的静息态功能连接（resting state functional connectivity，rsFC），探讨GTCS患者静息态下大脑和小脑之间功能连通性的改变特点及其相关的病理、生理机制与临床意义。

1　材料与方法

1.1　研究对象

       2014年2月至2015年1月，收集兰州大学第二医院癫痫中心确诊的GTCS患者共计19例纳入本研究。所有患者的入组标准依据2001年国际癫痫分类标准，满足临床发作符合全身强直痉挛，常规脑电图检查可见痫样波，常规头颅MRI检查正常。采用国立医院癫痫严重程度量表（national hospital seizure severity scale，NHS3）对每位患者进行病情评估。同期，招募在性别、利手、年龄和受教育程度均与GTCS组匹配的22名正常健康志愿者作为正常对照组，所有正常对照均无精神和神经病史，常规MRI检查无颅内病灶。两组被试在性别、利手、年龄和受教育程度上差异均无统计学意义(P >0.05)，具体临床资料如表1所示。所有被试被告知本试验的目的与内容，并自愿签署了知情同意书。本研究获得兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。

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表1  GTCS组与正常对照组临床资料比较
Tab. 1  Characteristics of the GTCS patients and HCs

1.2　数据采集

       所有被试的数据均在同一台Siemens Verio 3.0 T磁共振扫描系统完成采集，并且要求所有GTCS患者进行扫描之前近3 d内无癫痫发作，以便减轻可能因发作残余脑电信号对静息态fMRI数据产生的影响。扫描任务由专人负责完成。在数据采集过程中，要求被试佩戴专用静音耳机及耳塞，仰卧在扫描仪中，使用专用海绵垫将头部固定在矩阵线圈内，闭眼、放松、平静呼吸并尽量避免特定意向性思维活动，且不能睡着。采用梯度回波-平面回波成像（gradient echo-echo planar imaging，GRE-EPI）序列进行静息态fMRI扫描，扫描参数如下：重复时间（TR）=2000 ms，回波时间（TE）= 30 ms，视野(FOV)=240 mm×240 mm，层厚= 3.8 mm，层间距＝0.38 mm，矩阵（Matrix）=64×64，层数34层，采集扫描200个时间点，扫描时间共400 s。

1.3　数据预处理

       静息态功能数据的预处理采用DPARSF (http://www.restfmri.net)软件完成，主要过程包括：（1）剔除每个被试时间序列的前10个时间点信号，降低起始时被试非平稳状态引入和机器磁饱和效应引入的噪声。(2)时间层间校正，校正所有不同扫描时间点到同一个参考点。(3)头动校正，剔除被试头动平动大于2 mm，转动大于2°的被试，减少信号中因被试头动引入的噪声，本试验中所有被试均符合标准。(4)空间标准化，为了方便后续功能激活区的定位，将所有被试的功能像配准到蒙特利尔（Montreal Neurological Institute，MNI）标准空间模版，并将其重采样为3 mm×3 mm×3 mm。（5）平滑，采用高斯核的全宽半高（full width at half maximum ，FWHM）为6 mm对图像进行平滑，减少干扰信号的影响。（6）滤波，低频滤波带宽为0.01~0.08 Hz，排除该频段以外的生理噪声信号的影响。(7)去线性漂移和回归去除协变量（包括6个头动参数、全脑信号、白质信号、脑脊液信号），去除机器长时间采集积累的线性趋势和头动的影响。

1.4　低频振幅与静息态功能连接分析

       使用静息态fMRI工具包REST软件(http://www.restfmri.net)计算全脑灰质体素的ALFF值。为考察GTCS患者大脑和小脑之间静息态功能连通性改变，将两组被试ALFF显著差异区域按空间分布位置分为大脑ALFF差异区和小脑ALFF差异区，分别以各大脑ALFF差异区（小脑ALFF差异区）为种子区计算其与小脑（大脑）各体素之间的rsFC，即计算每位被试大脑ALFF差异区（小脑ALFF差异区）时间序列均值与小脑（大脑）所有体素时间序列之间的一致性，得到基于大脑（小脑）种子区域小脑（大脑） rsFC分布图。

1.5　统计分析

       在REST软件中，采用双样本t检验评估GTCS组和正常对照组之间在全脑灰质模板内ALFF值和FC值的差异，显著水平阈值为P<0.05，经AlphaSim校正。此外，采用皮尔森相关分析（数据服从正态分布）两组被试间显著差异脑区GTCS患者ALFF值和FC值与NHS3评分之间的关系，显著水平阈值为P<0.05，经FDR校正，并且将性别、年龄和头动作为协变量回归去除。

2　结果

       在REST软件中对GTCS患者组和正常对照组ALFF值进行双尾双样本t检验，并且将性别、年龄、受教育程度和头动作为协变量回归，统计结果显示，相对于正常对照组，GTCS患者组右侧楔前叶、左侧额中回ALFF值显著升高，而右侧海马、右侧小脑脚2区、左侧小脑4/5区ALFF值显著降低（图1，表2）。统计结果经AlpaSim校正，显著阈值P<0.05。

       采用双样本t检验统计GTCS患者组和正常对照组rsFC值差异，并且将性别、年龄、受教育程度和头动作为协变量回归，统计结果显示，相对于正常对照组，分别以各大脑ALFF差异区（右侧海马、右侧楔前叶、左侧额中回）为种子区域，GTCS患者组依次对应在左侧小脑8区、右侧小脑4/5区、右侧小脑4/5区rsFC值显著升高，以各小脑ALFF差异区（右侧小脑脚2区、左侧小脑4/5区）为种子区域，依次对应在左侧额下回、右侧颞中回rsFC值显著降低（图2，表3）。统计结果经AlpaSim校正，显著阈值P<0.05。结果表明，GTCS患者大脑和小脑之间静息态功能连通性发生改变。

       相关分析结果显示，GTCS患者组NHS3评分与各差异脑区ALFF值之间均无显著相关性。但是患者组NHS3评分与左侧小脑8区rsFC均值之间呈显著正相关(r=0.48 ，P=0.036)，与右侧颞中回rsFC均值之间呈显著负相关(r=-0.34 ，P=0.042)，见图3。

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图1  GTCS患者发作间期ALFF值异常脑区（P<0.05，AlphaSim校正），ALFF值显著降低的脑区主要包括右侧海马、右侧小脑脚2区、左侧小脑4/5区；ALFF值显著升高的脑区主要包括右侧楔前叶、左侧额中回
Fig. 1  The abnormal brain regions in ALFF of patients with GTCS during the interictal time. ALFF was significantly increased in the right hippocampus, right cerebellar_crus2 and left cerebellar_4_5, but significantly decreased in the right precuneus and left middle frontal gyrus. The statistical significance of group differences was corrected by AlphaSim (P<0.05).

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图2  GTCS患者基于各种子脑区rsFC异常脑区(P<0.05，AlphaSim校正)。A：表示基于GTCS患者各大脑ALFF值异常区域[右侧海马（HIP.R）、右侧楔前叶（PreC.R）、左侧额中回（MFG.L)）为种子区域rsFC异常脑区，分别为左侧小脑8区(C_8.L)、右侧小脑4/5区(C_4_5.R)、右侧小脑4/5区（C_4_5.R)]；B：表示基于GTCS患者各小脑ALFF值异常区域[右侧小脑脚2区(C_C2.R)、左侧小脑4/5区(C_4_5.R)）为种子区域rsFC异常脑区，分别为左侧额下回(IFG.L)、右侧颞中回（MTG.R）
Fig. 2  Statistical significance of rsFC patterns for each seed region with significant group differences in ALFF between GTCS and HCs. Seed-based rsFC analysis showed that rsFC in patients with GTCS was significantly increased in the left cerebellar_8, right cerebellar_4_5 and right cerebellar_4_5 (A), but significant decreased in the left inferior frontal gyrus and right middle temporal gyrus (B). Warm and cool colors indicate that rsFC increases and decreases, respectively, in patients with GTCS.

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图3  GTCS患者NHS3评分与差异脑区rsFC均值之间相关性。A：表示患者NHS3评分与左侧小脑8区rsFC均值之间存在显著正相关(r=0.48，P=0.036)；B：表示患者NHS3评分与右侧大脑颞中回rsFC均值之间存在显著负相关(r=-0.34，P＝0.042)
Fig. 3  Correlations between NHS3 score and mean rsFC value in the left cerebellar_8 (C_8.L), right middle temporal gyrus (MTG. R). The rsFC values in the figure extracted from the significant clusters after age, gender, and head motion of each subject were regressed out.

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表2  GTCS患者组与正常对照组ALFF值差异脑区
Tab. 2  Differences in ALFF between patients with GTCS and HCs

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表3  GTCS患者基于ALFF值差异种子区域rsFC异常脑区
Tab.3  Significant differences in rsFC of seed regions of ALFF between patients with GTCS and HCs

3　讨论

       大脑在静息状态下会产生有规律的自发性神经活动，其通常被认为与脑高级功能高度相关，观察自发脑神经活动可以间接探究脑功能特点^[5]。静息态fMRI技术为观察自发脑神经活动提供了有效途径，已经被广泛地应用于各种疾病的研究。全脑ALFF作为静息态fMRI研究中的常用指标，其主要反映的是自发脑神经活动的震荡特点，而癫痫是由神经元集群自发异常放电所引起的一种神经系统疾病，因此ALFF指标可以表征癫痫神经活动的改变。

       本研究采用全脑ALFF分析发现，GTCS患者组右侧楔前叶、右侧海马、左侧额中回、右侧小脑脚2区、左侧小脑4/5区ALFF值出现异常，提示这些脑区静息态下的自发脑活动发生改变。楔前叶通常被认为是默认网络（default mode network，DMN）的重要脑区^[6]，该脑区与情景记忆、环境监测、意识等多个高级认知功能相关，既往研究发现GTCS患者的默认网络存在异常^[7,8]，本研究患者楔前叶自发脑活动异常可能导致整个默认网络模式紊乱，引起患者认知能力的衰退。海马主要负责记忆和学习等高级认知功能，GTCS患者一般表现为不同程度的记忆和学习障碍，本研究表明静息态下长期性的海马异常激活可能是癫痫患者记忆和学习障碍形成的潜在因素。额中回参与视觉运动、行为控制等，GTCS患者经常性的自发不可控强直阵挛发作可能与该脑区自发脑活动异常有关。GTCS患者静息态下的相关研究已经发现小脑激活异常^[9,10]，本研究发现GTCS患者多个小脑区域ALFF值降低，表明GTCS患者经常性的癫痫活动可能会引起小脑自发脑活动受损。此外，本研究并未发现GTCS患者丘脑ALFF异常，先前研究发现癫痫患者静息态下丘脑激活存在异常^[11,12]，这可能和研究病例和数据处理方法选择有关。

       静息态下大脑-小脑功能连通性的异常已经在不同疾病中被发现^[13,14,15]，但这些研究大多采用经验脑区为种子点rsFC分析，忽略了不同采集数据集特点。本研究采用基于ALFF差异区为种子区的rsFC分析探究GTCS患者大脑和小脑之间功能连通性改变特点，并且将种子区按解剖位置分为大脑种子区和小脑种子区。基于大脑种子区rsFC分析结果发现，GTCS患者右侧海马-左侧小脑8区、右侧楔前叶-右侧小脑4/5区和左侧额中回-右侧小脑4/5区功能连通性升高。小脑8区和小脑4/5区分别与静息态下背侧注意网络和运动网络相关^[16]，这些脑区在运动控制中扮演着重要角色，通常小脑与大脑运动相关皮层之间存在神经通路，癫痫患者在发作期间持续性阵挛发作，频繁的痫电发放扰乱了静息态下自发脑活动的固有模式，使注意和运动功能连接通路长期处于兴奋状态，以便患者随时参与运动控制。同时，基于小脑种子区rsFC分析结果发现，GTCS患者右侧小脑脚2区-左侧额下回和左侧小脑4/5区-右侧颞中回功能连通性降低。小脑脚2区在默认网络自发脑活动中起重要作用^[16]，而额下回和颞中回均与注意网络紧密关联^[17]，最近一项基于小脑种子点的静息态功能连接研究表明，癫痫患者小脑多个脑区与大脑默认网络和注意网络功能连接下降^[18]，本研究显示右侧小脑脚2区-左侧额下回功能连通性降低，即默认网络和注意网络之间的功能连接减弱，预示癫痫患者全脑功能整合能力下降。此外，本研究中GTCS患者的NHS3评分与左侧小脑8区rsFC值呈正相关，与右侧颞中回rsFC值呈负相关，说明右侧海马-左侧小脑8区和左侧小脑4/5区-右侧颞中回功能连通性改变特点与GTCS患者的疾病严重程度存在一定关系，预示这些脑区大脑-小脑功能连接通路可能依据癫痫严重程度最终做出不同的响应。

       本研究也存在一些局限。首先，两组间ALFF值和rsFC值统计结果采用多重比较校正方法AlphaSim校正，该方法通常被认为是一种较弱的校正方法。其次，被试样本数量偏少，可能会因个体误差引入统计差异，后期开展大样本的研究对印证本研究结论尤为必要。再次，本研究并未考虑GTCS患者发作期及间期长短、距离MRI采集时间等因素，这可能会对本研究的结果产生一定影响，后期研究将进一步验证以上因素是否会导致功能连接分析结果差异。最后，本研究未对患者被试的服药与未服药情况进行分组，因此不能准确地判定脑功能活动的异常是否全部归因于长期痫电发放，后期对服药与未服药被试进行细分进一步确定不同因素对脑功能改变的影响。

       综上所述，本研究采用全脑ALFF指标和基于种子点的rsFC对GTCS患者发作间期静息态下的大脑和小脑之间功能连通性进行了研究，研究发现GTCS患者发作间期大脑和小脑之间多个脑区功能连通性发生改变，并且右侧海马-左侧小脑8区、左侧小脑4/5区-右侧颞中回的rsFC值均与患者疾病严重程度相关，这些结果可有助于认识GTCS患者内在神经机制，解释患者临床表现，对于患者治疗方案制定提供一些新的参考依据。