在诸如患慢性肾病、双肾肿瘤、孤立肾等患者中，小的肾脏肿瘤是实行肾部分切除术的绝对指征^[1,2]。手术通常要求夹闭单侧肾动脉，以防止术中出血并提供无血的手术空间，实现精确切除肿瘤并缝合集合系统^[3]。然而，术中肾脏暂时缺血及术后再灌注所带来的肾脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）则不可避免，这是术后肾功能下降的主要原因^[4,5]。研究证实肾脏IRI主要损伤部位发生在肾脏外髓外带（the outer stripe of the outer medulla，OSOM）的近曲小管，Ysebaert等^[6]对大鼠IRI模型的研究分析表明，OSOM中80％的近曲小管细胞严重受损。Kalogeris等^[7]提出药物干预有助于激活细胞生存机制，降低肾脏IRI，如何研制出可以降低IRI的预处理药物已成为当今学者研究的热点问题^[8]。Murphy等研发出线粒体靶向抗氧化剂MitoQ，作为泛醌的衍生物，MitoQ与三苯基膦和亲脂性阳离子相偶联，这可以保证其通过线粒体脂质双分子层，并且在电化学梯度下可聚集在线粒体内^[9]。磁共振扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）可反映组织细胞水分子的扩散运动^[10]，故可以应用于急性或慢性肾功能衰竭患者的肾功能评估，且肾功能损害可导致表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）降低^[11]。因此，本研究设想DWI能无创地评估MitoQ对肾脏的保护作用。为监测MitoQ预处理对IRI的保护作用，本研究在大鼠模型中进行为期两周的肾脏DWI动态监测，并测量肾脏OSOM的ADC变化。

1　材料与方法

1.1　动物准备

       本研究得到本院动物保护和使用委员会的批准，并严格遵守实验室动物保护和使用准则。平均体重为250 g的10只雄性SD大鼠（北京大学医学部育种中心）随机分为两组：MitoQ组(5只，IRI+MitoQ)，大鼠在热缺血开始前15 min以20 µL/s的速度通过鼠尾静脉注射MitoQ（澳新生物制药公司捐赠）（每只大鼠2.8 mg/kg的剂量溶于700 µL 0.9％的生理盐水中），然后夹闭左肾动脉45 min，最后取下血管夹实现再灌注；对照组（5只，IRI +生理盐水），与MitoQ组过程相似，以700 µL 0.9%的生理盐水代替MitoQ注射液。

1.2　缺血再灌注模型

       所有大鼠在术前前夜均禁食，但饮水自由。手术时将大鼠置于一个恒温板上，以维持体温在(37±1)℃。术中采用汽化七氟烷面罩吸入（1.0%～2.5%）的方法使大鼠麻醉。对大鼠腹部进行备皮、消毒操作。在腹部做一个旁正中切口，分离出左肾动脉，并用微血管夹夹闭，以实现可逆性阻断肾动脉血供。观察到大鼠肾脏表面由亮红色变为红棕色，即实现了肾动脉的完全性夹闭。热缺血时间45 min的选择基于我们之前实验的经验积累：既保证肾功能的下降，又尽可能降低动物的死亡率。热缺血时间结束后取下血管夹，观察到肾脏恢复至亮红色，即实现了再灌注，随后关闭切口。

1.3　MRI检查

       MRI扫描在IRI术前（第0天）和术后（第2、5、7和14天）进行，仪器为3.0 T磁共振机（MR750，通用电气医疗集团，美国），使用6 cm孔径4通道小动物线圈（万通，深圳，中国）。大鼠在MRI检查前2 h禁食，扫描过程中采用汽化七氟烷面罩吸入（1.0%～2.5%）的方法使大鼠麻醉。每只大鼠处于仰卧位，扫描时对其腹部进行适当按压，以便把它们的呼吸运动限制到最小程度。横轴面多层面单次激发回波平面成像DWI参数：TR 2075 ms，TE 111.9 ms，层厚2 mm，层间距0.5 mm，FOV 6 cm×6 cm，矩阵192×96，带宽±100 kHz。b值为10、1200 mm²/s。

1.4　双肾ADC值测量

       将DWI数据传至工作站(ADW 4.5，GE医疗集团，美国)，利用Functools分析软件生成ADC图，在低b值（10 mm²/s）的DWI图像上勾画肾门水平的肾脏外髓外带感兴趣区（region of interest，ROI） （注意勾画ROI时应避开皮质和外髓内带等结构），在ADC图上测定ROI内的平均ADC值（图1）。

点击查看大图

图1  在DWI图像中勾画肾脏外髓外带（OSOM）感兴趣区并测量ADC值。A：术后左肾DWI图像(b=10 mm²/s)，由外向内依次为皮质（cortex，CO）、外髓外带（the outer stripe of the outer medulla, OSOM）和外髓内带（the inner stripe of the outer medulla，ISOM）。B：在DWI图像上勾画OSOM的感兴趣区。C：与B图相应的ADC图
图2  术前（第0天）和术后不同时间（第2、5、7、14天）两组大鼠双肾外髓外带(OSOM) ADC值变化的折线图。线条1、2、3、4分别代表MitoQ组右肾OSOM、对照组右肾OSOM、MitoQ组左肾OSOM、对照组左肾OSOM。术前两组所有大鼠双肾OSOM的ADC值接近在同一水平，术后两组大鼠右肾OSOM的ADC值无显著变化。两组大鼠左肾OSOM的ADC值在术后第2天明显下降，以对照组下降明显，之后变化不大
图3  术后第14天两组大鼠双肾组织HE染色切片(×400)。A：MitoQ组左肾；B：MitoQ组右肾；C：对照组左肾；D：对照组右肾。肾小管扩张、上皮细胞空泡形成、脱落；肾间质水肿和炎症细胞浸润在对照组大鼠左肾OSOM表现最明显，而这些现象在MitoQ组大鼠左肾OSOM不太明显。两组大鼠右肾组织学基本无变化
Fig. 1  Example of the region of interest (ROI) setting on axial DWI and the measurement of the ADC value. A: DWI of the left kidney after IRI (b=10 mm²/s): cortex (CO), the outer stripe of the outer medulla (OSOM) and the inner stripe of the outer medulla (ISOM) from the outside in. B: The ROI setting of OSOM on DWI. C: The ADC image corresponding to DWI.
Fig. 2  Graphs of ADC values of OSOM on bilateral kidneys in two groups before (day 0) and after IRI (day 2, 5, 7 and 14). Line 1, the right OSOM in MitoQ group. Line 2, the right OSOM in control group. Line 3, the left OSOM in MitoQ group. Line 4, the left OSOM in control group. The ADC values in two groups on day 0 were about the same level. The ADC values of the right OSOM in two groups changed little after IRI. The ADC values of the left OSOM dropped dramatically from day 2 in both of the groups, and it was more obvious in control group, since then they had little changes.
Fig. 3  Histological sections of renal tissue with HE staining (×400) of the bilateral kidneys on day 14 after IRI in two groups. A: The left kidney in MitoQ group. B: The right kidney in MitoQ group. C: The left kidney in control group. D: The right kidney in control group. Tubular dilatation, tubular epithelial cell vacuolization, desquamation, as well as interstitial tissue edema and inflammatory cell infiltration were the most predominant in the OSOM of the left kidneys in control group, which were less obvious in the OSOM of the left kidneys in MitoQ group. The pathological changes in the right kidneys in both groups were little.

1.5　病理学检查

       最后一次MRI检查结束后处死所有大鼠，取下双肾进行组织学分析。肾脏标本用5％缓冲福尔马林固定后石蜡包埋，并切成5 mm层厚。所有标本进行苏木精-伊红（HE）染色，并由1名经验丰富的病理学家对显微镜下组织学变化进行分析。肾损伤主要包括：肾小管：肾小管扩张，上皮细胞空泡形成，上皮细胞脱落；肾间质：肾间质水肿，炎症细胞聚集。借助半定量评分法对损伤区域的肾组织进行0~ 4分的评分：0分，肾脏无损伤；1分，肾损伤<25%；2分，肾损伤<50%；3分，肾损伤<75%；4分，肾损伤>75 %^[12]。

1.6　统计学分析

       采用SPSS 12.0.1软件进行统计学处理：Kolmogorov Smirnov检验评估数据是否符合正态分布；Levene's检验评估数据的方差齐性。正态分布数据用±s表示；非正态分布数据用M±Q表示。不同时间点各组间及组内ADC值比较采用最小显著差法(Least-significant difference，LSD)；肾脏组织病理学评分之间比较借助Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验。P<0.05视为有统计学意义。

2　结果

2.1　两组大鼠术前、术后（第2、5、7、14天）不同时间肾脏OSOM的ADC值变化

       术前两组所有大鼠双肾OSOM的ADC值接近。术后两组大鼠右肾OSOM的ADC值无显著变化。两组大鼠左肾OSOM的ADC值在术后第2天明显下降，以对照组下降显著，之后两组左肾OSOM的ADC值与第2天相比变化不大（图2）。在术后各个时间点两组大鼠左肾OSOM的ADC值均低于两组大鼠右肾OSOM，对照组大鼠左肾OSOM的ADC值更低于MitoQ组大鼠左肾OSOM（表1）。

点击查看表格

表1  两组大鼠术前（第0天）和术后不同时间双肾外髓外带(OSOM) ADC值(×10^-4 mm²/s，±s)
Tab. 1  The ADC values of the OSOM on bilateral kidneys prior to (day 0) and after IRI in two groups (×10^-4 mm²/s, ±s)

2.2　两组大鼠术后第14天肾脏组织病理学变化

       肾脏IRI的组织病理学表现为：肾小管扩张、上皮细胞空泡形成及脱落；肾间质水肿及炎症细胞浸润，在对照组大鼠左肾OSOM上表现最明显，这些现象在MitoQ组大鼠左肾OSOM上则明显缓解，两组大鼠右肾组织学变化较小（图3）。两组大鼠左肾OSOM的组织病理学评分均高于两组右肾OSOM，MitoQ组左肾OSOM的病理学评分低于对照组左肾OSOM（表2）。

点击查看表格

表2  两组大鼠术后第14天双肾组织病理学损伤评分(M±Q)
Tab. 2  Histopathological damage scores of the bilateral kidneys on day 14 among the two groups (M±Q)

3　讨论

       本研究借助肾脏DWI/ADC值监测大鼠IRI后的肾脏功能变化，结果显示对照组左肾ADC值于各时间点均低于MitoQ组，提示线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对肾脏IRI具有保护作用。尽管肾脏缺血再灌注损伤的发病率及死亡率较高，但目前对于肾缺血再灌注损伤无相对有效的治疗方法^[8]，因此寻求肾脏保护药物对IRI的临床治疗至关重要，本研究结果可以从方法学和治疗学两方面提供潜在的途径。

3.1　研发肾脏缺血再灌注损伤保护药物的意义

       IRI指器官的供血中断，随后恢复正常供血与供氧，通过启动炎症级联反应，从而加剧组织的损伤，肾脏IRI往往导致急性和慢性肾功能不全^[13]。IRI引起的细胞程序化死亡可能与细胞凋亡、坏死和自身免疫和过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）有关，上述过程与IRI中线粒体氧化损伤存在因果关系^[14,15]。目前，IRI无有效治疗方法，但对于术中夹闭血管造成的热缺血，许多学者尝试预防性使用药物以拮抗再灌注损伤。由于线粒体氧化损伤在肾脏IRI处于重要地位，因此降低IRI过程中线粒体氧化损伤可能是一种可行的治疗措施。Murphy等研发出线粒体靶向抗氧化剂MitoQ，MitoQ可使线粒体内大量的脂质过氧自由基和ROS含量下降，因此能降低线粒体氧化损伤^[9]。Murphy等借助PCR和ELISA方法证明MitoQ可降低小鼠肾脏缺血再灌注过程中组织细胞内线粒体氧化损伤^[15]。

3.2　DWI和ADC评估缺血再灌注损伤肾脏的优势和影像学基础

       目前肾活检是诊断肾脏疾病的金标准，但肾活检具有侵袭性且受取样部位的影响，因此建立一种非侵袭性技术来发现并监测肾脏疾病的进展非常重要^[16]。然而，肾功能连续监测存在方法学上的挑战，目前各种技术均存在缺陷。许多学者用生化的方法，如肌酐，监测肾功能，然而肌酐只能反映整体肾功能^[17,18]。为了监测单侧肾功能，许多学者采取切除大鼠对侧肾脏或夹闭双侧肾脏的办法，然而这与临床实际情况存在差异。此外，长期连续多次抽取血液样品也会干扰小动物体内环境。肾动态显像可量化单侧肾GFR^[19]，然而，由于大鼠的肾脏和动脉均较小，该方法无法在小动物身上实施。

       DWI是目前唯一可以无创地反映活体组织中水分子扩散运动情况的成像技术，能够反映活体组织的微观结构变化^[20]，其量化指标ADC可反映水分子运动速度，有学者还指出ADC值可在一定程度上反映肾脏滤过功能^[11]。DWI对于肾脏病变的评估价值在肾脏慢性疾病、急性泌尿系梗阻、移植肾功能评估、上尿路感染中广泛文献报道^[21,22,23]。肾脏IRI可导致肾小管上皮细胞水肿变性、肾小管内管型和坏死脱落细胞形成^[24]，这些病生理变化限制肾小管内水分子的运动，影响肾脏滤过功能，并使ADC值降低。杨荷霞等^[25]研究表明肾小管损伤最终表现肾脏单位体积内血流量降低，功能学表现为肾脏滤过受损；b值越低，微灌注提供的信息越多，与肾脏滤过的相关性也越好。所以本次实验采用低b值对IRI肾脏不同时间的ADC值进行测量并分析，从侧面探究IRI后肾脏滤过功能的变化。

       本次研究病理分析结果表明IRI损伤主要发生在肾脏OSOM，这与之前学者的研究一致^[6]。ADC结果分析表明，对照组大鼠IRI肾脏OSOM的ADC值低于MitoQ组大鼠IRI肾脏，张友元等^[11]研究表明肾ADC值与评估GFR呈正相关，提示Mito Q可能在降低IRI中起到一定作用，而本次研究的病理学也证实了这一点。本研究还发现MitoQ组右肾和对照组右侧肾ADC值、病理学评分无差异，提示MitoQ对大鼠健肾影响不大，这可能与下列因素有关：细胞氧化还原平衡维持细胞防御机制和ROS产物之间的正常平衡，而MitoQ只能降低左肾IRI所致过量的ROS所带来的氧化损伤，而对右侧相对正常肾脏作用不大。

       近年来有学者对肾脏不同状况下的ADC进行研究^{[11, 26]}。张友元等^[11]借助ADC探讨其肾功能的关系，发现ADC能在一定程度上反映肾小球滤过功能，并指出正常患者ADC值为(1.90±0.16)× 10^-3 mm²/s，本次研究结果与该结果存在差异，可能与下列因素有关：本研究对象为大鼠，且在扫描过程中无呼吸门控装置，这可能产生运动伪影，可能对结果有一定影响。Wu等^[26]借助ADC评估顺铂诱导下大鼠肾脏纤维化模型，建模前大鼠ADC值与本研究一致。本次研究各组大鼠健康肾脏ADC值在术后各个时间点较稳定，故可以纵向研究IRI大鼠在不同时间点的ADC值及其变化规律。

3.3　本次研究的不足之处

       本次研究存在不足。首先，本研究作为可行性探索，实验样本量小，未来需要扩大样本量，并进行MitoQ的剂量效能分析。再次，因为考虑到连续多次抽血会干扰大鼠生理状态，因此未进行血生化检查。

       综上所述，本研究对肾脏缺血再灌注损伤大鼠不同时间点的ADC值进行分析，研究结果提示线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。