磁共振分子成像是一种无创、具有高特异性的新型诊断方法，可从细胞、分子水平对肿瘤进行靶向显像及诊断。叶酸受体（folate receptor，FR）在很多恶性肿瘤中超表达，其表达方式有很强的基因及组织特异性，但是在正常细胞及组织中无表达^[1,2]。作为非病毒载体，超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）因其具有超顺磁性及低毒性的特点，在分子影像磁共振成像中被广泛应用。本研究制备叶酸（folate，FA）靶向的多功能纳米复合物，研究其作用于人肝癌细胞Bel7402的细胞靶向性及应用磁共振成像系统对其监测的可能性。

1　材料与方法

1.1　试剂

       NP-DA-Dextra-FA叶酸靶向及非靶向NP-DA-Dextran纳米分子探针（苏州大学化工学院与材料部提供），多巴胺（Acros公司），葡聚糖（上海沪峰公司），叶酸（TCI公司），人肝癌细胞Bel7402（购于上海生科院细胞库），胎牛血清（杭州四季青公司），叶酸DMEM细胞培养液（美国Gibco公司），0.25%胰酶（Sigma公司）。

1.2　主要设备

       CO2培养箱（德国Herabus公司），FEI TecnaiG220透射电子显微镜，GE signa HDx 3.0 T磁共振成像系统，Jjouan MR23i低温高速离心机，NikonYS100倒置相差显微镜。

1.3　方法

1.3.1　Fe3O4和Fe3O4-NPs的合成[1]

       油酸钠（9.125 g，30 mmol)、FeCl3•6H2O(2.7 g，10 mmol)倒入正己烷（35 mL）、去离子水(15 mL)、乙醇（20 mL）混合物中，经4 h反应（70 ℃)后分离红褐色含油酸铁的正己烷混合物，用去离子水3次洗涤后放入旋转蒸发仪去除正己烷，获得含油酸铁的油状混合物。取含油酸铁的混合物(9 g，10 mmol）加入油酸（1.41 g，5 mmol）、十八碳烯（25 g)，在N2条件下，升温到320℃随后搅拌30 min。接着沉淀、离心，并用正己烷和乙醇洗涤3次，分散于正己烷中。取10 mL N,N-二甲基甲酰胺，将Fe3O4 (100 mg)分散其内，之后加入盐酸多巴胺（200 mg） （N,N-二甲基甲酰胺20 mL）溶液，超声20 min后搅拌12 h。然后经过葡聚糖的活化、连接葡聚糖及叶酸的活化一系列反应制作的产物备用。所得纳米分子探针进行一系列表征测量。

1.3.2　细胞培养

       将人肝癌细胞Bel7402接种于含10％胎牛血清的无叶酸DMEM培养基中随后放在培养箱内以37°C、5% CO2的条件下培养，待贴壁的H460细胞密度生长至90％时，去除原培养液，加入胰蛋白酶进行消化，每3 d传一代。在培养过程中用光学显微镜对培养中的细胞进行动态观察。待细胞生长总数达1×10⁷个时停止传代备用。

1.3.3　普鲁士蓝染色

       将人肝癌细胞Bel7402的靶向及非靶向分子探针行普鲁士蓝染色。将1×10⁶个的Bel7402细胞分别与铁浓度为40 μg/ml的叶酸靶向与非靶向分子探针在无叶酸DMEM培养液中孵育2 h后（置于37°C、5% CO2培养箱中），用磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，用4%戊二酮固定20 min后，蒸馏水洗3次，核固红复染3 min后，蒸馏水洗涤3次，随后在显微镜下观察细胞内铁染色效果。

1.3.4　竞争性抑制实验

       将数量为1×10⁶的人肝癌细胞Bel7402与不同浓度（0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）的游离FA孵育1 h后，再与铁浓度为40 μg/ml的FA纳米靶向探针孵育1 h后，行MR体外成像。

1.3.5　体外磁共振成像

       将人肝癌细胞Bel7402接种在6孔板内，分别与铁浓度为0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml的FA靶向与非靶向纳米分子探针与1×10⁶的人肝癌细胞孵育2 h，用PBS液冲洗3次，经过胰蛋白酶消化后重悬于0.5 ml 1％琼脂糖的EP管中。(1)成像方法：应用3.0 T MR扫描仪进行悬浮细胞成像，采用动物小线圈。扫描参数：采用快速自旋转回波（fast spin echo，FSE）序列：TR/TE=4240 ms/108 ms；层厚＝2 mm；层间距＝1 mm；矩阵＝256×256；FOV=8 cm×8 cm；T2 mapping扫描，采用多回波SE序列，共采集8回波，TR 1500 ms，TE 9.4 ms、18.7 ms、28.1 ms、37.4 ms、46.8 ms、56.1 ms、65.5 ms、74.8 ms，层厚2 mm；层间距1 mm；矩阵＝256×256；FOV= 8 cm×8 cm。(2)成像分析：选择测量面积大于30 mm²的感兴趣区（region of interest，ROI）测量信号强度和R2值，保持测量在同一横断面，每组样本含量保持一致，同一样品重复6次测量，计算平均值及标准差。

1.4　统计学分析

       数据统计采用SPSS 17.0软件包，所有数据均用均数±标准差来表示。T2磁共振信号强度分析运用One-way ANOVA单因素方差分析，两两比较运用SNK及LSD检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　NP-DA-Dextra-FA叶酸靶向纳米复合物的制备和表征

       SPIO和FA连接成功，分子靶向纳米探针呈现出特异性的苯环峰值（图1），峰值约2650 cm^-1；粒径在透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）下测得约14 nm。经TEM观察，分子纳米探针分布均匀、形态规则。

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图1  NP-DA-Dextra-FA纳米分子探针红外光谱图，红外峰值约为2650 cm^-1
Fig.1  The infrared spectrogram of NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe,the infrared peak is 2650 cm^-1

2.2　普鲁士蓝染色实验结果

       NP-DA-Dextra-FA叶酸靶向纳米分子探针（40 μg/mL）同人肝癌细胞Bel7402孵育后，肝癌细胞内可观察到大量铁颗粒沉积；FA非靶向NP-DA-Dextran纳米分子探针（浓度40 μg/mL）与Bel7402细胞孵育后，内仅见少量铁颗粒沉积（图2）。

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图2  普鲁士蓝染色图。A：叶酸靶向NP-DA-Dextra-FA分子探针；B：非靶向NP-DA-Dextran分子探针普鲁士蓝染色图
Fig.2  Prussian blue staining. A: Folate-targeted NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe; B: Non targeting NP-DA-Dextran.

2.3　体外竞争抑制实验

       随着细胞培养基中游离FA浓度从0 mmol/L增高到2.0 mmol/L时，Bel7402肝癌细胞的T2信号强度随着游离FA浓度增高而逐渐变亮（图3）。

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图3  体外竞争抑制实验图
Fig.3  Competitive inhibition experiment in vitro

2.4　MR体外成像结果

       铁浓度为0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的叶酸靶向NP-DA-Dextra-FA复合物和非靶向NP-DA-Dextran纳米分子探针分别与人肝癌Bel7402细胞孵育2 h后，靶向组细胞T2信号强度随铁浓度的升高显著降低，非靶向组细胞T2信号强度下降相对不显著（图4A）。T2 maping序列显示R2值随着铁浓度的升高显著升高，非靶向组细胞的R2值升高相对不显著（图4B），两组R2值分别为图4B （a）依次测量为1.38×10^-2 ms^-1、1.64×10^-2 ms^-1、1.76× 10^-2 ms^-1、2.22×10^-2 ms^-1、2.50×10^-2 ms^-1、4.96×10^-2 ms^-1；图4B （b）依次测量为1.42× 10^-2 ms^-1、17.11×10^-2 ms^-1、27.51×10^-2 ms^-1、7.33×10^-2 ms^-1、12.34×10^-2 ms^-1、20.08×10^-2 ms^-1。

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图4  FA非靶向纳米与靶向纳米分子探针MR信号强度的改变及T2驰豫时间的改变
Fig.4  The change of signal strength of folate-targeted NP-DA-Dextra-FA and non targeting NP-DA-Dextran nanoparticles probe

2.5　信号强度变化、信号强度变化率与浓度间的关系

       FA靶向NP-DA-Dextra-FA纳米分子探针和非靶向NP-DPA-Dextran纳米分子探针分别与人肝癌细胞Bel7402孵育后，FA靶向NP-DA-Dextra-FA分子探针组肿瘤细胞MR信号强度随着铁浓度的升高明显降低，而非靶向NP-DA-Dextran纳米分子探针组降低相对不显著。在浓度80 μg/mL时，两组的信号强度下降率分别为89.67％及37.92%，靶向组的信号强度变化率约为非靶向组的2~ 3倍，两组比较差异具有统计学意义(P<0.01) （图4C，表1）。

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表1  不同铁浓度叶酸靶向对比剂及非靶向对比剂与Bel7402 MR孵育后信号强度变化
Tab. 1  The change of signal strength of different concentrations of iron folic acid targeted contrast agent and the targeted contrast agent incubation with Bel7402 cells

3　讨论

       叶酸作为一种B族天然维生素，在人体一碳单位代谢过程中有着极为重要的意义。叶酸受体在肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、子宫内膜癌及结肠癌等^{[1,2,3,4,5,6]}绝大多数恶性肿瘤中高表达或超表达，具有很强的组织特异性，在正常组织细胞中不表达或呈低表达。超顺磁性氧化铁具有明显的T2负超顺磁效应，在肝、脾等器官磁共振成像中常作为一种理想的对比被广泛应用。FA具有价格低廉、低免疫源性等优点，在临床中较为常用，FR介导的靶向成像及给药成为该领域研究的热点^[7,8,9,10]。以叶酸为载体，通过FR受体介导，可以将超顺磁性氧化铁带至肿瘤细胞表面，进入细胞内后摄入细胞胞浆，从而缩短肿瘤T2弛豫时间，对药物的释放监测及提高肿瘤诊断敏感性具有重要价值，以实现MRI对肿瘤治疗监测的可视化。

       此研究运用对人肝癌细胞Bel7402与叶酸靶向及非靶向分子探针进行孵育，通过比较由于人肝癌细胞Bel7402对靶向分子纳米探针摄取的差别而导致的磁共振信号强度差异，由细胞、体外分子水平来研究MR成像仪对肿瘤靶向成像和监测的可能性。FA具有靶向效应，主要表现在位点特异性、配体介导的纳米分子探针在肿瘤细胞中的聚集。本研究自行设计的FA靶向纳米分子探针，并利用非靶向纳米探针作为对照组，在细胞水平去探讨FA靶向纳米分子探针对FR表达阳性的肝癌细胞的靶向效应。本研究中将不同浓度的FA靶向、非靶向分子探针与肝癌细胞孵育2 h后，通过MR T2成像、T2 mapping成像及普鲁士蓝染色观察两种分子探针与Bel7402细胞内摄的情况，初步实验结果表明，靶向组的肿瘤细胞的摄取率比非靶向组明显高，靶向组T2驰豫时间比非靶向组明显减低，这表明由叶酸介导的纳米分子靶向探针对人肝癌细胞Bel7402靶向效应明显，普鲁士蓝染色实验结果表明，人肝癌细胞Bel7402靶向组铁颗粒含量明显比非靶向组高。在体外竞争抑制实验中，结果进一步表明了FA修饰的纳米分子探针对肝癌细胞的靶向摄取主要依赖于FR。

       NP-DA-Dextran-FA纳米分子探针是一种靶向对比剂，亦具有一定的特异性，其靶向效应的机制可能为以下几种。(1) FR受体与FA特异性结合，随后将分子靶向纳米探针带至肿瘤细胞的表面，来减低肿瘤的T2信号强度。(2)细胞外的叶酸被瘤细胞表面的叶酸受体介导，经过内化途径进入细胞内，从而导致瘤细胞T2信号减低，这是叶酸进入瘤细胞内的重要途径^[11]。(3)磷脂酶C裂解瘤细胞表面的叶酸受体后，使瘤细胞间隙内的叶酸受体明显聚集，故使瘤细胞间隙内分子纳米探针靶向聚集^[12]。这几种机制可对肿瘤内分子靶向探针长时间聚集及其特异性给予了恰当的解释。

       SPIO在MR成像、热疗中得到广泛的应用，和非聚合的Gd聚合物对比剂相比较，SPIO呈现更高的灵敏度。通常其表面被用葡聚糖、PEI及树枝状大分子等衍生物修饰，使其具有更好的生物相容性及稳定性^[13]。以提高对比剂的水溶性及分散性。而未经任何修饰的SPIO，其表面带有负电荷，很难被同样带有负电荷的细胞膜所摄取。此研究的超顺磁性氧化铁与多巴胺、葡聚糖相连并通过修饰后，粒径大小为14 nm，完全符合MR对比剂的基本条件。本研究课题组研制的FA分子靶向探针因其有低毒性及良好的生物相容性等优点，其应用前景极为广泛。

       叶酸受体介导的磁性纳米分子探针可同时用作MR靶向对比剂，及运送药物的载体，通过其介导的分子靶向纳米探针连接抗肿瘤药来靶向治疗肿瘤并行磁共振成像监测已是此领域的研究热点。目前国内外相关研究较多局限于肿瘤细胞分子靶向摄取机制，但是尚面临瘤细胞对特定纳米分子靶向探针的特异性识别及靶向药物在瘤内有效释放等问题，这将成为此领域的焦点问题，同时也面临着巨大的挑战^[14]。