2001年Zuk等^[1]首次从人抽脂术中分离培养出ADSCs，相继证实ADSCs具有向多胚层多功能细胞的分化潜能。磁探针SPIO-PLL制作简单、易于排泄，MR成像无创且分辨率高，已成为示踪移植干细胞的理想无创方法。本研究通过流式细胞技术分析不同浓度磁探针对ADSCs生长的影响，寻找安全标记浓度，并行体外定量MR成像，为活体示踪移植磁标记细胞奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试剂及仪器

       Annexin-v-FITC细胞凋亡及周期检测试剂盒(Becton Dickinson公司)，倒置相差荧光显微镜(NIKON TE2000-U)，透射电子显微镜(日本HITACHI-7500型)，流式细胞仪(美国BD公司)，GE HD-X signa 3.0 T MRI成像系统(美国GE公司)、腕关节线圈等。ADSCs的培养鉴定、磁探针及Perls反应液的制作见文献[2]。

1.2　普鲁士蓝染色

       取12孔板，每孔加入单细胞悬液1 ml (1×10⁵个)，培养过夜后分别加25、50、75 μg/ml的磁探针培养液1 ml，未加探针组为空白对照组，各设3个复孔。孵育过夜后弃上清，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定40 min，双蒸水洗涤、Perls反应液作用30 min、弃反应液、双蒸水洗涤、核固红复染5 min、PBS洗涤、晾干、二甲苯透明处理10 min后中性树胶封片，光镜观察。

1.3　透射电镜鉴定

       收集各浓度组单细胞悬液1×10⁶个，1200 r/min离心5 min后弃上清，沿管壁缓慢加入2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定1 h，PBS洗涤，1%四氧化锇4 ℃固定h，PBS洗涤，梯度丙酮脱水，0.5%醋酸铀4 ℃染色固定过夜，环氧树脂包埋，切片，透射电镜观察。

1.4　流式检测细胞凋亡

       收集各浓度组及对照组细胞各1 ml (1×10⁶个)，离心后PBS洗涤，将细胞重悬浮于200 ml结合缓冲液，加10 ml Annexin-v-FITC，室温避光放置10 min，再加5 μl碘化丙啶(PI)，混匀后室温避光放置15 min，PBS洗涤，加300 μl结合缓冲液重悬细胞后上机检测。细胞凋亡图左下象限An (-) PI (-)，右下象限An (+) PI (-)，右上象限An (+) PI (+)，左上象限An (-) PI (+)分别代表正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡及坏死细胞及收集过程中的损伤细胞。

1.5　流式分析细胞周期

       收集各浓度组及对照组细胞各1 ml (1×10⁶个)，离心PBS洗涤，70%乙醇固定，4 ℃放置过夜，PBS洗涤，加20 mg/ml核糖核酸酶A (RNaseA)，37 ℃水浴1 h后加100 mg/l PI，4 ℃避光染色30 min，行流式细胞仪490 nm处检测并行细胞周期DNA含量分析。

1.6　定量MR成像

       收集经25μg/ml磁探针标记的细胞5×10⁵个(1 d)、1×10⁶个(1 d)、1×10⁶个(3 d)及1×10⁶个(未标记)，转入装有1%琼脂糖溶液的EP管中振荡混匀，置入腕关节线圈内，行GE HD-X signa 3.0 T GRE T2^*WI及多回波T2^*mapping序列扫描，通过adw 4.6工作站的Functool软件包中的T2^*弛豫时间测量软件，选取ROI测量各组T2^*弛豫时间。T2^*WI成像参数：TR 250 ms，TE 12 ms，FOV 8 cm×8 cm，层厚2 mm，层间距0.5 mm，NEX为3，矩阵324×256，反转角20°。T2^*mapping成像参数：TR 1000 ms，TE 11.1、22.2、33.3、44.4、55.5、66.6、77.7、88 ms，FOV 8 cm×8 cm，层厚2 mm，层间距0 mm，矩阵320×224。

1.7　统计分析

       应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据用±s表示，多组间比较用单因素方差分析方法，两两间比较应用LSD-t方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　普鲁士蓝染色及电镜

       光镜下示磁标记细胞普鲁士蓝阳性染色率近100%，胞浆内见蓝色致密颗粒，数量不等(图1A)。透射电镜示磁标记细胞浆内见斑点状的高密度氧化铁颗粒，聚集在胞浆的囊泡内(图1B)。

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图1  A：磁标记细胞普鲁士蓝染色(　×400)胞浆内见蓝色铁颗粒(白箭)；B：磁标记细胞透射电镜观察(　×15000)胞浆囊泡见致密铁颗粒(白箭)
图2  Annexin/PI双染色法检测细胞凋亡。A~D分别为对照组、25、50、75 μg/ml磁探针标记细胞组
图3  GRE T2^*WI序列轴面成像。1~6组分别为蒸馏水、琼脂、1×10⁶个细胞(未标记)、5×10⁵个细胞(1 d)、1×10⁶个细胞(3 d)、1×10⁶个细胞(1 d)，第6组信号强度最低
Fig. 1  A: The labelled cells Prussian blue staining (　×400) Blue particles were observed in nearly every cytoplasm (white arrow). B: The labelled cells observed under TEM (　×15000). The dense particles were observed in cytoplasmic vacuoles (white arrow).
Fig. 2  The cell apoptosis rate detected through Annexin/PI double staining method. A—D respresented blank group, ADSCs labelled with 25, 50, 75 μg/ml SPIO-PLL respectively.
Fig. 3  The axial image of GRE T2^*WI sequences. 1—6 groups represented distilled water, agar, 1×10⁶ cells (unlabeled), 5×10⁶ (labeled 1 d), 1×10⁶ (labeled 3 d) and 1×10⁶ cells (labeled 1 d), respectively, the SI of the sixth group was the lowest.

2.2　对细胞周期和凋亡的影响

       经25、50、75 μg/ml磁探针标记细胞后，流式细胞仪检测各组细胞周期，50、75 μg/ml组G0/G1阻滞率较空白对照组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，而25 μg/ml组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。运用Annexin/PI双染色，流式细胞仪检测各组间凋亡率具有统计学差异(P<0.05)，其中25 μg/ml组与对照组间比较无明显差异(P>0.05)，为安全标记浓度(图2，表1)。

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表1  SPIO-PLL对细胞周期与凋亡的影响(n=3，%，±s)
Tab. 1  Effects of SPIO-PLL on ADSCs cell cycle progression and apoptosis(n=3, %, ±s)

2.3　MR成像

       收集的各组细胞置入腕关节线圈内，行GE HD-X signa 3.0 T MRI扫描，GRE T2^*WI序列扫描显示经25 μg/ml磁探针标记1×10⁶个(1 d)的信号强度最低(图3)；经多回波T2^*mapping序列扫描后，测量1~6组T2^*弛豫时间分别为(17.30±0.44) ms、(17.27±0.55) ms、(16.63±0.86) ms、(10.10±0.40) ms、(10.17±0.31) ms、(9.33±0.42) ms，对照组与各磁标记细胞组T2^*弛豫时间比较，差异均有统计学意义(F=169.837，P<0.01)。

3　讨论

       2001年Zuk首次从抽脂术中分离培养出ADSCs，2004年ADSCs首次被移植治疗一位颅面部严重损伤的患儿，并取得了满意的疗效^[3]。目前ADSCs作为一种多功能的成体干细胞，已经实现自体、异体及异种移植，相继被移植用于治疗外周神经及肌腱韧带损伤、椎间盘退变、克罗恩病以及抑制排斥反应等^[4,5,6,7]。本研究联合应用转染剂PLL与SPIO制成理化性质稳定的SPIO-PLL悬液，具有正电效应，能与带负电的细胞膜高亲和力结合形成囊泡内吞进入细胞，同时又有明显的负性效应^[8]；本研究结果证实普鲁士蓝染色及透射电镜示ADSCs磁标记率近100%，铁颗粒以囊泡的形式内吞入细胞浆。纳米铁生物降解性强，能够通过旁路代谢进入血浆铁池并参与铁的循环代谢，因此SPIO-PLL是一种理想的MR活体示踪剂，可安全高效标记不同物种的多种细胞^[9,10,11,12]。

       细胞凋亡不同于细胞死亡，前者是一种由基因调控的主动程序性死亡过程，检测凋亡的方法及特点：(1)显微镜只局限于观察细胞的形态；(2)电泳法不能清晰显示细胞的内部结构；(3)免疫学法不能实现细胞的准确定位；(4)原位缺口末端标记法(TUNEL法)难以控制处理时间；(5)流式法，联合应用荧光探针Annexin-v-FITC与核酸染料PI能区分凋亡细胞与坏死细胞。细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外露早于细胞的DNA，Annexin-V能与膜外的磷脂酰丝氨酸特异性结合，因此流式法能更敏感地检测早期凋亡细胞；同时，流式法不需要固定细胞，避免因细胞固定过程中造成的细胞碎片过多及原位缺口末端标记法因固定出现的DNA片段丢失，因此流式法检测细胞凋亡更省时、结果更可靠，是最佳的凋亡定量检测方法^[13,14,15]。

       细胞周期包括分裂间期和有丝分裂期(M期)，分裂间期又分为生长前期(G1期)，DNA合成期(S期)及生长后期(G2期)，各时期细胞的DNA含量均不同，与核酸染料PI结合后显示的荧光强度不等，因此流式细胞仪可敏感检测细胞的生长情况^[16,17]。本研究表明随着磁探针浓度增大，ADSCs的早晚期细胞凋亡率及坏死率增大，细胞周期阻滞率增高，以G0/G1期明显，其中25μg/ml组细胞周期阻滞率及凋亡率与对照组比较无明显差异(P>0.05)，对细胞分裂增殖及凋亡无明显影响，因此25μg/ml磁探针为有效安全标记浓度。

       本研究用磁探针标记1×10⁶、5×10⁵个细胞1 d，1×10⁶个细胞标记1 d、3 d，后者弛豫时间均较前者短，这可能与细胞数量增多、培养时间延长，细胞增殖分化能力及生物降解能力降低有关；用25μg/ml磁探针标记1×10⁶个细胞1 d后，T2^*弛豫时间最短，有明显统计学意义(P<0.01)，为下一步活体移植经25μg/ml的磁探针标记细胞，并运用T2^*mapping技术定量评价移植细胞生长情况奠定基础。虽然死亡细胞释放出铁粒子或巨噬细胞吞噬磁标记细胞使周围细胞或组织呈假阳性，干扰对移植细胞生长状况的精准靶向示踪，但随着示踪技术的不断改进，MRI在干细胞移植及示踪领域会有光明的应用前景。