肿瘤新生血管为肿瘤的生长提供大量的氧气和营养物质，是肿瘤增殖、转移的基础，直接破坏肿瘤组织中的新生血管能够抑制肿瘤生长以及引起肿瘤细胞缺氧坏死^[1]。A64是由暨南大学药学院自主研发的一种长春新碱衍生物，是新型的血管破坏剂(长春碱类衍生物及其制备方法和应用。国际PCT专利，申请号：PCT/CN 2014/000192)。基于扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)技术的体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像技术在提供组织内水分子真实扩散特征的同时，可在不注射对比剂的情况下无创、定量地反映组织内的灌注改变，在活体上可用于肿瘤内水分子的扩散、血流灌注信息进行动态、定量监测。本实验利用IVIM-DWI技术对A64治疗裸鼠肝癌皮下移植瘤的超早期疗效进行动态监测与定量评估，并结合病理组织学与免疫组化结果，探讨A64治疗后肿瘤超早期的病理生理改变与IVIM参数的相关性。

1　材料与方法

1.1　实验对象及肿瘤模型

       使用人肝癌Huh7细胞株。健康BALB/C nu/nu，鼠龄4~5 w，雌性，体重14~16g。将1×10⁷个/mL密度的肝癌细胞按0.2 mL/只的量接种于裸鼠腹侧后肢根部皮下。常规饲养，直至瘤块直径约1 cm左右，建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。所有动物实验有关的操作程序均得到暨南大学实验动物使用与伦理管理委员会批准。选取成功建模后成瘤裸鼠22只，将其随机分为影像检查组和平行病理组，每只裸鼠一次性尾静脉给药A64 (2 µmol/kg)。

1.2　MR检查及数据后处理

       影像检查组10只，分别给予基线、给药后1 h、2 h、4 h、24 h 5个时间点进行体素内不相干运动弥散成像，动态测量D^*值、f值、D值，在24 h点扫描完毕后全部处死取肿瘤组织。每只裸鼠在扫描前尾静脉注射0.3%戊巴比妥进行麻醉。MR检查采用美国GE公司的Signa 1.5T MR扫描仪，动物线圈，头先进，仰卧位，将移植瘤的中心定位于线圈及磁体的中心。扫描序列：常规快速自旋回波序列(fast spin echo，FSE)的T1加权像，参数：TE=14.7 ms，TR=540 ms，层厚2 mm，层间距0.2 mm，FOV=5 cm×5 cm，矩阵192×160，NEX=2。快速恢复自旋回波(fast recovery fast spin echo，FRFSE)的T2加权像，相关参数：TR=2140 ms，TE=82.3 ms，层厚2 mm，层间距0.2 mm，FOV=5 cm×5 cm，矩阵256×192，NEX=2。IVIM-DWI检查序列：TR=4200 ms，TE=101.7 ms，矩阵96×128，层厚2 mm，层间距0.2 mm，FOV=7.0 cm×5.6 cm，共13个b值，分别为0、25、50、75、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1500 s/mm²，对应的NEX分别为1、2、2、3、3、3、4、4、4、6、6、8、10，扩散梯度分别施加于X、Y、Z 3个方向。

       后处理在GE公司提供的ADW 4.5图像后处理工作站进行，观察常规序列T1WI、T2WI图像，根据经典双指数模型对原始图像进行分析得到D^*值、f值及D值。感兴趣区(region of interest，ROI)的选择是在IVIM-DWI序列上肿瘤最大层面及其上、下两个相邻层面，尽量避开血管及坏死区域，在实性部分放置大小25~30 mm²的圆形ROI，测量3个平面的ROI取平均值。

       IVIM-DWI的计算公式：Sb/S0=(1-f)×exp(-b×D)+f×exp [-b (D+D^*)]，S代表体素内的信号强度，D代表体素内真性扩散系数，D^*为假性扩散系数，f是灌注分数^[2]。

1.3　病理组织学及CD31免疫组化分析

       平行病理组12只，分别对应影像检查组的基态及给药后各时间点处死3只取肿瘤组织，其中24 h时间点的3只从影像检查组的10只中随机选取。取出处死裸鼠的瘤体，妥善固定，进行常规HE染色、CD31染色。在镜下观察肿瘤体积、瘤内细胞密度、坏死及肿瘤血管形态、数量等定性指标。利用ipp6软件对CD31进行肿瘤血管密度的定量检测，计算指标为高倍视野下(×200)肿瘤内CD31平均累积光密度值，计算公式：平均累积光密度值=阳性染色细胞累积光密度值/(阳性染色细胞面积+阴性染色细胞面积)。

1.4　统计学分析和相关性检验

       应用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计学分析，采用GraphPad Prism 6.0进行统计图的绘制。定量资料以±s表示，实验组D值、D^*值、f值和病理组CD31平均累积光密度值计数各时间点采用重复测量方差分析，各时间点测量值前后的两两比较采用配对t检验，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

       成功建模22只裸鼠，扫描前、后实验动物一般情况无明显异常。

2.1　常规MRI结果

       常规MRI表现与基态相比，给药后不同时间点肿瘤大小未见明显变化。给药后1 h在T2WI上肿瘤内可见极少量小斑片状低信号和高信号，随着时间的推移至给药后24 h，肿瘤高、低信号稍增多，信号略混杂，T1WI上肿瘤信号均无明显变化。

2.2　影像检查组IVIM-DWI结果

       组内各时间点样本的正态性检验：由于样本量小于50，采用Shapiro-Wilk进行正态性检验，结果显示，D、D^*、f、CD31-IOD值4项指标0~24 h各时间点P值均大于0.05，说明数据服从正态分布。

       D值在给药后2 h内明显下降，4~24 h肿瘤D值逐渐上升恢复至基态水平，且以肿瘤周边D值升高为著。重复测量方差结果显示，D的F时间为8.110，P=0.000，说明给药前后不同时间点D值差异有统计学意义(P<0.05) (见表1和图1、图2)。

       D^*值在给药后1~4 h进行性下降，24 h回升。重复测量方差结果显示，D^*值的F时间为12.860，P=0.000，说明给药前后不同时间点D^*值差异有统计学意义(P<0.05) (见表1和图1、图2)。

       f值在给药后2 h、4 h有所降低，24 h上升。重复测量方差结果显示，f值的F时间为4.580，P=0.005，说明给药前后不同时间点f值差异有统计学意义(P<0.05) (见表1和图1、图2)。

       D值各时间点比较，基态与4 h、24 h，1 h与4 h，4 h与24 h之间差异没有统计学意义，P分别为0.211、0.955、0.326、0.107；基态与1 h、基态与2 h、1 h与2 h、1 h与24 h、2 h与4 h、2 h与24 h之间差异有统计学意义，P值分别为0.000、0.000、0.042、0.011、0.022、0.002。

       D^*值各时间点比较，1 h与4 h、1 h与24 h和2 h与4 h差异没有统计学意义，P值分别为0.051、0.744、0.583；基态与1 h、2 h、4 h、24 h，1 h与2 h、2 h与24 h、4 h与24 h差异有统计学意义，P值分别为0.002、0.001、0.002、0.016、0.016、0.012、0.015。

       f值各时间点比较，基态与1 h、2 h、24 h和1 h与24 h、2 h与4 h差异没有统计学意义，P值分别为0.741、0.121、0.285、0.426、0.209；基态与4 h、1 h与2 h、1 h与4 h、2 h与24 h、4 h与24 h差异有统计学意义，P值分别为0.046、0.037、0.005、0.018、0.020。

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图1  IVIM-MRI各定量参数(D、D^*及f值)的箱式图。中间横线代表中位数，箱子两端代表上四分位数
图2  尾静脉注射A64前及注射后各时间点肿瘤IVIM-DWI序列相关参数伪彩图。给药后1 h、2 h肿瘤的D值明显下降，4 h、24 h回升接近基态，以肿瘤周边明显。D^*值在给药后4 h内逐渐下降，24 h转为升高。f值4 h内有所降低，24 h转为上升，变化不明显
Fig. 1  The box diagram of D, D^* and f. The middle lines represent the medians, and both ends of the boxes represent the quartile.
Fig. 2  The colour map of IVIM-DWI parameters at each time point before and after caudal vein injection of A64. D value decreases apparently at 1 h and 2 h after injection, and rises to baseline at 4 h, 24 h, especially by the surrounding of the tumor. D^* value decreases gradually at 4 h and rises at 24 h as well as f value, but the change is not evident.

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表1  IVIM-DWI序列各参数均数及标准差(n=10)
Tab. 1  The mean value and standard deviation of each IVIM-DWI parameter

2.3　平行病理组结果

       HE染色：与基态相比，给药后1 h肿瘤内坏死不明显，细胞数量仍较多，排列密集。2 h开始肿瘤内坏死增多，组织结构紊乱。4 h及24 h时，坏死、出血范围进一步扩大，以中央为著，肿瘤周边可见部分细胞增殖。高倍镜下4 h、24 h肿瘤内新生血管逐渐增多(图3)。

       CD31血管染色：给药1 h肿瘤血管即出现形态失常，管腔狭窄，血管数量尚无明显变化；2 h时血管破坏明显，管腔闭塞，内皮细胞固缩，血管数量稍减少；4 h血管破坏更加明显，肿瘤周边可见少量新生血管，这些血管由单层内皮细胞围成，结构简单；24 h肿瘤周边出现更多的新生小血管，相较于基态，瘤体内血管数量有所增加(图3)。

       CD31-IOD在给药后2 h持续减少，4 h起明显增加，且超过基态水平。0 h、1 h、2 h、4 h、24 h的CD31染色平均IOD值(×100)分别为0.94±0.37、0.53±0.08、0.49±0.17、1.09±0.27、1.34±0.35。重复测量方差分析结果显示IOD值的F时间=11.525，P=0.000，说明给药前后不同时间点CD31-IOD值差异有统计学意义。

       CD31-IOD值各时间点前后比较，基态与4 h、基态与24 h、1 h及2 h、4 h及24 h的变化没有统计学意义，P值分别为0.174、0.151、0.569、0.273；基态与1 h，基态与2 h、1 h与2 h、1 h与4 h、1 h与24 h、2 h与4 h、2 h与24 h差异均有统计学意义，P值分别为0.056、0.021、0.005、0.002、0.004、0.004。

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图3  各时间点平行病理组的肿瘤HE染色切片镜下表现。随着给药时间的延长，肿瘤内坏死区逐渐增多，以中心为著，并出现进行性加重的出血及坏死，40倍镜下4 h和24 h肿瘤内出现较多新生血管。CD31染色可见给药后1 h，肿瘤血管明显塌陷，管径狭窄，2 h后大部分管腔闭塞，血管数量减少。4 h及24 h肿瘤内见新生不成熟小血管，总体上血管数量有所增加
Fig. 3  HE staining of the parallel pathology group at each time point shows that with the prolongation of time after injection, the tumor necrosis area gradually increased especially in the middle, as well as the progressive increase in bleeding and necrosis. New vessels can be observed at 4 h and 24 h under 40× microscope. CD31 staining shows that tumor vessels are collapse and stenosis at 1 h after injection. At 2 h most of the lumens occlude and the amount of the vessels reduce. At 4 h and 24 h newborn immature small vessels can be observed inside the tumor, while the number of vessels increase in total.

3　讨论

3.1　A64的作用机制

       A64是长春碱衍生物，属于小分子微管蛋白结合剂类血管破坏剂，可以靶向作用于肿瘤不成熟的新生血管内皮细胞，引起肿瘤血管的塌陷、破坏，具有明显的抗肿瘤疗效。其作用机制是微管蛋白结合剂与血管内皮细胞微管蛋白的结合而抑制微管聚合，引起微管解聚，并重构肌动蛋白骨架引起内皮细胞形态发生改变，阻断肿瘤微血管的血流，增加血管渗透性，肿瘤微循环血流减少，暴露的血管基底膜，激活凝血机制，导致凝血和出血，从而使肿瘤血管堵塞，达到破坏血管的作用^[3]。正常成熟的血管内皮细胞的细胞排列规则，骨架发育完全，有血管壁周细胞和肌细胞的保护，基底膜完整，故对A64作用不敏感，因此，A64作为新型血管破坏剂，对肿瘤血管破坏具有特异性和更高的敏感性。

3.2　IVIM-DWI各相关参数的原理与临床价值

       DWI是目前唯一能够检测活体组织内水分子扩散运动的无创方法，其影像对比主要取决于组织间的表观扩散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)，ADC值可量化评估组织平均扩散，反映病理生理改变引起的组织细胞水平的微观变化，在临床上已用于肿瘤良恶性病变的鉴别和疗效预测等^[4]。IVIM的理论是由Denis Le Bihan于1985年提出的，由于DWI影像上信号衰减的同时包括真性水分子扩散和毛细血管网中随机血流微循环灌注，后者使扩散影像上出现假扩散信号，导致ADC值反映的信息有限。基于此理论，在一组包含高b值(≥200 s/mm²)与低b值(≤200 s/mm²)的扫描序列下，应用双指数模型对衰减信号进行分析，得出反映组织扩散特性及灌注特性的参数：真性扩散系数(D值)、假性扩散系数(D^*值)、灌注分数(f值)。D值代表活体内水分子的扩散，反映扩散情况；D^*与f值代表水分子在血管内的宏观运动，反映灌注情况^[5]。因此，IVIM可以分离出组织水分子的真实扩散信息和微循环细血管内血液的灌注信息，比DWI更能准确地反映肿瘤微观的变化，同时可以在不注射对比剂的情况下无创、定量地反映组织内的灌注改变，可用于腹部脏器良恶性病变的鉴别、早期诊断疾病、定量观察病情进展，成为研究的热点^[6,7,8,9]。Chiaradia等^[10]用IVIM参数评价结直肠癌肝转移患者转移瘤坏死程度和存活组织的相关性；Lewin等^[11]用IVIM的f值作为肝细胞肝癌抗血管生成治疗的标志物进行了探索性研究。

3.3　A64给药后D值变化及其病理学改变

       IVIM中的D值代表体素内真性水分子扩散，称为真性扩散系数，代表纯的水分子扩散运动。本实验的影像检查组中，D值表现为在给药后2 h内持续下降，此时病理对照组的HE染色显示肿瘤坏死变化不明显，细胞数量仍较多，排列密，CD31血管染色已显示肿瘤血管出现形态失常，管腔狭窄。D值于4 h开始回升，24 h上升恢复至基态水平，对应的HE染色显示肿瘤组织内坏死、出血范围进一步扩大。因此推测前2 h肿瘤D值的下降是由于A64短时间内迅速引起血管壁破坏、狭窄导致肿瘤组织血流量下降，肿瘤细胞缺血缺氧、肿胀，细胞外容积减小，水分子运动受限；4 h及24 h时，肿瘤坏死增多，逐步抵消细胞肿胀所致的D值减低，因此观察到D值逐渐上升，提示了A64治疗后早期D值的变化与肿瘤细胞肿胀和坏死相关。

3.4　A64给药后肿瘤D*值和f值的变化及其病理学改变

       IVIM中的D^*代表体素内微循环灌注，称为假性扩散系数；f即灌注分数，代表体素内微循环灌注效应占总体扩散效应的容积率。本实验中影像检查组D^*值和f值给药后1 h、2 h、4 h内持续性下降，24 h时肿瘤D^*值和f值明显回升，其对应的CD31染色和CD31-IOD值的结果显示，给药后1 h、2 h血管壁即塌陷、闭塞，血管数量减少，平均光密度值下降，4 h及24 h观察到肿瘤内新生不成熟小血管增多，平均光密度值上升。这是由于虽然血管破坏剂主要是能够引起肿瘤的大面积坏死或死亡，但同时还与宿主的正常细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、血小板、内皮细胞和基质成纤维细胞等关系密切，这些正常细胞能够分泌促血管生成因子，在治疗过程中能促进肿瘤血管再生，肿瘤的缺血缺氧也可促使微血管增生，血管的再生反过来又影响肿瘤的灌注，因此灌注的增高可解释为新生血管所致。D^*值和f值的动态变化总体趋势与CD31-IOD值相似，只在4 h的时间点上存在不同，即灌注的改变要晚于不成熟微血管数量上的变化，这是由于异常新生的血管结构上不成熟，在灌注上不如给药前的血管。这既从病理学上解释了D^*值和f值升高，同时也反映功能上的灌注增加要迟于新生微血管数量与形态学的变化。Joo等^[12]也报道了利用IVIM对血管破坏剂CKD-516治疗兔肝癌模型疗效进行评估，结果显示D^*和f值在给药后4 h明显下降，24 h回升，与本实验在这两个时点上趋势相似。

       本实验中的f值和D^*值的变化虽然相似，但f值变化的幅度不如D^*值，推测给药后早期灌注下降的同时，总体扩散水平也在下降，给药后期，灌注恢复的同时，坏死区增大，肿瘤扩散受限也有所减轻，故微循环灌注所占的百分比变化不够显著。Shi等^[13]将f值和D^*值与MRI对比剂增强参数进行了对照研究，在观察鼠非小细胞肺癌对血管破坏剂反应的实验研究中发现，IVIM参数中的D、f和D^* 3个值与DCE-MRI的K^trans有较好的相关性，但不同脏器与肿瘤的研究结果并非完全一致^{[12, 14]}。因此f值和D^*值能否反映肝细胞癌的血供或取代对比剂增强MRI尚需进一步研究。

       综上所述，IVIM-DWI相关参数可以定量检测A64治疗后裸鼠肝癌移植瘤的超早期的真实扩散信息和微循环灌注信息，从而间接地反映给药后肿瘤缺血、坏死和瘤内新生血管的形成，为疗效的检测提供无创的评价方法。