Mn²⁺是哺乳动物体内一种必不可少的微量元素，保证其机体生长发育及正常生理功能的进行^[1]。Mn²⁺也是体内多种酶的辅因子，在调节能量代谢、免疫应答、血糖稳态、生殖等多方面扮演重要的角色^[2]。早期动物实验Mn²⁺的细胞毒性限制其作为磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)对比剂的进一步发展^[3]，近年来，由于Mn²⁺特有的理化特性，再次成为生物学研究的热点之一。主要研究包括静脉输注氯化锰(MnCl2)溶液后MRI显示相关组织、器官细微解剖结构的强化；Mn²⁺可经电压门控钙通道进入细胞内，并在T1WI上呈高信号，该技术被称为活动诱导Mn²⁺依赖MRI (activity-induced manganese-enhanced MRI，AIM-MRI)；Mn²⁺增强MRI (Mn²⁺-enhanced MRI，MEMRI)可进行特定神经束路示踪，对嗅觉、视觉及体表感觉传导通路顺行的神经元连接进行显像。上述3个方面研究的成功应用，是基于一种以合适的剂量及时递送Mn²⁺至相关兴趣区的能力^[4]，实现了活体观察特定区域的解剖结构及功能状态。

1　MEMRI的基本原理

1.1　Mn2+的理化特性

       顺磁性镧系元素和过渡金属离子(通常为GdⅢ、MnⅡ和FeⅢ)的配合物因有较大磁矩，能通过偶极相互作用缩短邻近质子的弛豫时间。锰的主要氧化价态有6种(Ⅱ~Ⅶ)，其中以Mn²⁺的化合物最稳定，不容易被氧化，也不容易被还原。与Ca²⁺相比，Mn²⁺在第3轨道有5个不成对电子，具有很强的顺磁性，能显著缩短周围水质子的纵向弛豫时间，在T1加权MR影像上呈高信号，因此Mn²⁺能够用作MRI对比剂^[5]。但是，Mn²⁺作为人体必需的微量元素以离子形式存在于体内，总含量仅有12~20 mg，正常生理情况下不足以引起周围组织纵向弛豫时间的改变。

1.2　Mn2+作为Ca2+类似物

       Mn²⁺半径及生理作用与Ca²⁺相似，实验证明，当神经元细胞活动时，Mn²⁺能与Ca²⁺竞争且呈比例通过电压门控钙通道进入细胞内，在去极化的神经轴突末梢内代替Ca²⁺触发神经递质的释放。进入细胞内的Mn²⁺部分被微管运输系统转运至轴突突触，随神经递质被释放至突触间隙，最后可被顺行的下一个神经元细胞摄取，借此通过跨突触方式来示踪整个神经传导通路^[4]。很多研究表明，Ca²⁺通道阻滞剂可影响Mn²⁺在中枢神经系统的正常运输。细胞内Mn²⁺与Ca²⁺的代谢方式不同，后者可通过细胞膜上的钙泵及时排出细胞外，细胞内外迅速达到动态平衡，而Mn²⁺在活体细胞内与大分子具有很高的亲和力，并在细胞内持续聚集数小时，Mn²⁺这种"快进慢出"的集聚特性使其具备细胞内MRI对比剂的潜质。20世纪90年代美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)已经批准锰离子螯合剂Mn-DPDP (dipyridoxyl diphosphate，二吡啶氧基二磷酸)作为一种细胞内MRI对比剂应用于肝脏等相关疾病的临床诊断^[6]。

1.3　活动诱导Mn2+依赖MRI

       基于Mn²⁺良好的理化特性，Mn²⁺诱导增强在细胞内极其明显^[7]。Mn²⁺进入细胞内是以活动依赖的方式通过细胞膜上电压门控钙通道而进行的，细胞去极化期间细胞膜上的电压门控钙通道短暂开放允许Ca²⁺内流，同时Mn²⁺以相同的方式进入细胞内并大量积聚，此过程通过监测由Mn²⁺进入心肌细胞的速率造成荧光钙离子指示剂的猝灭而得到证实^[8]。荧光猝灭率已被用作一种替代标志物来对多种细胞钙内流进行定量测定^[9]。局部脑功能区活动增强导致Mn²⁺内流增加，从而增大T1加权MRI信号变化，这种技术被称为AIM-MRI^[7]。由谷氨酸、苯丙胺、体表感觉刺激引起相应脑功能区活动的增强会在MR影像上产生强烈的信号差异，同样，在麻醉复苏后也会观察到此现象^[10]。

       目前，AIM-MRI主要应用于脑功能成像方面的研究，与其他脑功能成像[如血氧水平依赖功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging，BOLD-fMRI)等]比较，AIM-MRI所激活的脑功能区已被证实和BOLD-fMRI和正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography，PET)具有很好的一致性，但前者具有明显的优势^[11]。AIM-MRI所获得的图像具有更高的灵敏性和信噪比，能达到显微成像水平，不但可以获得脑活动区的功能信息，同时也能得到精细的解剖学信息，多种信息相结合为综合分析脑活动区的变化提供更加有效的手段。

2　多器官功能障碍综合征及其早期细胞内Ca2+超载的发生机制

2.1　多器官功能障碍综合征的发生机制

       多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)发生发展过程中可累及机体几乎每个系统和器官，继发性、顺序性及进行性为其发病的主要特点^[12]。目前，广泛接受的MODS发病机制有4种学说，即全身性炎症反应失控、缺血及缺血-再灌注损伤、肠道细菌移位和细胞代谢障碍与细胞凋亡，4种病理生理过程相互影响并相互增强，逐渐将MODS推向疾病终末期，即多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，直至患者死亡。

       重大急性损伤后肠黏膜屏障功能受损，肠黏膜通透性增高，肠道细菌及内毒素经门静脉系统和肠系膜淋巴循环进入血液，造成肠源性细菌移位及内毒素血症。进入血液循环的细菌及其产物进一步促进内源性炎性介质、细胞因子及补体等产生，成倍激活炎性免疫系统，导致机体对炎症反应的失控而引起全身炎症反应综合征。MODS时机体组织、器官微循环障碍，造成缺血缺氧而产生一系列病理生理变化和细胞代谢异常，特别是能量代谢。基于能量代谢的一些生物学过程受阻，内环境稳态破坏。恢复血流灌注后大量O2进入，由于线粒体功能障碍及细胞内还原性物质含量降低，导致大量活性氧自由基的产生和释放，进一步加重组织、器官的损伤。MODS发生过程中也伴随细胞凋亡及坏死，凋亡与抗凋亡平衡状态被打破，损害严重的组织或器官多种凋亡信号通路被激活，引起主要由线粒体介导细胞凋亡的发生^[13]。

2.2　细胞内Ca2+超载的机制

       细胞内Ca²⁺稳态对于维持细胞正常生理功能极为重要，机体在各种局部或全身病理条件下均可发生细胞内Ca²⁺的变化^[14]。正常生理情况下，细胞外Ca²⁺浓度约为细胞内的10000倍，这种浓度梯度的维持依赖于细胞的膜系统对Ca²⁺的不自由通透性和Ca²⁺转运系统的调节。各种因素引起的损伤使细胞膜的完整性遭到破坏，细胞膜通透性增加，细胞外Ca²⁺顺浓度梯度进入细胞内，细胞内Ca²⁺水平升高又可激活磷脂酶，使膜磷脂降解，细胞膜的通透性进一步增大，形成恶性循环，加速Ca²⁺进入细胞内。同时，各种途径产生大量活性氧也可以破坏细胞膜和细胞器膜，造成膜的通透性增加和结构的破坏，从而使胞外Ca²⁺内流增大，细胞内肌质网和内质网Ca²⁺的转运障碍。

       缺血-再灌注过程中线粒体膜损伤，氧化磷酸化受到抑制，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成减少，造成依赖ATP的离子泵功能障碍，细胞内Ca²⁺不能泵出胞外或泵入细胞内钙库，促进细胞内Ca²⁺超载。在缺血期细胞内Ca²⁺水平开始升高，再灌注时随着血供的恢复又带来了大量的Ca²⁺，使细胞内Ca²⁺迅速增多，最终导致细胞内Ca²⁺超载。此外，各种原因引起组织、细胞缺血缺氧，细胞内pH降低，造成细胞内酸中毒。再灌注时细胞内外形成pH梯度差，Na⁺-H⁺交换增强；由于ATP合成减少，细胞内糖酵解途径增强引起代谢性酸中毒及活性氧损伤导致质膜上Na⁺-K⁺-ATP酶活性降低，故细胞内Na⁺水平明显增高，Na⁺-Ca²⁺交换反转，即Na⁺顺浓度梯度运出细胞，而细胞外Ca²⁺大量进入细胞内，也可以造成细胞内Ca²+超载。再者，缺血-再灌注过程中由于产生大量的儿茶酚胺，后者作用于α和β肾上腺素受体同样可以促使Ca²⁺内流。

       已有研究证实，细胞内Ca²⁺超载是各种原因引起多脏器损伤并进而导致MOF的主要原因之一^[15]。细胞内Ca²⁺超载在缺血-再灌注损伤发生发展过程中起决定性作用，也是多种原因引起细胞损害的最后共同通路，它不仅可作为一个独立因子产生损伤作用，其他许多因子的损伤作用最终也是通过Ca²⁺来完成的^[16,17]。Ca²⁺超载机制的明确为各种原因引起MODS进行早期干预治疗指明了一个方向。目前，已有许多针对细胞内Ca²⁺超载的药物用于推迟、阻止或消除细胞凋亡。

3　MEMRI动态监测早期MODS细胞内Ca2+超载的可行性

3.1　细胞内Ca2+超载现有的检测技术

       目前体外检测细胞内Ca²⁺超载的方法包括荧光Ca²⁺示踪剂、原子吸收分光技术、放射性自显影技术、以及细胞内Ca²⁺荧光探针等^[18,19]，均不能一次性同时检测多脏器细胞内Ca²⁺超载。其中，最常用的技术是直接测定细胞内Ca²⁺水平、水母发光蛋白和荧光指示剂。由于荧光指示剂与Ca²⁺结合后产生的荧光强度较高，稳定性好，且测试方法简单、易掌握，其优势更明显。水母发光蛋白测试细胞内Ca²⁺超载时，需要构建缺血缺氧细胞模型或缺血-再灌注动物模型，然后加入Ca²⁺荧光指示剂，通过荧光共聚焦显微镜观察荧光强度并借助计算机辅助分析细胞内游离Ca²⁺含量。

       Minocci等^[20]采用绿色荧光蛋白成功显像飞蝇大脑神经细胞和神经胶质细胞内Ca²⁺活动，但目前这种技术还仅限于体型微小的动物。基于高顺磁性钆络合物和超顺磁性三氧化二铁微粒的Ca²+MRI离子示踪也已成功用于体外实验，且对细胞内Ca²⁺浓度变化的检测具有较高的敏感度^[21,22]，但要实现活体研究，目前仍无法解决一些技术上的难题，最近几年未见取得突破性进展的报道。

3.2　早期MODS细胞内Ca2+超载的MEMRI检测

       近年来，一些新的MRI序列能够检测脏器损伤的早期病理生理学变化^[23,24]，但仍限于检测脏器或组织损伤后阶段，不能探索引起这些病理生理学变化的损伤因子和损伤机制，无法检测早期MODS细胞内Ca²⁺变化。细胞内Ca²⁺超载是早期MODS的关键事件，Ca²⁺超载将导致细胞结构损伤和功能代谢障碍。研究证明，大量Ca²⁺进入细胞多发生在再灌注后最初2 min以内，并对组织细胞产生损伤作用，且Ca²⁺浓度升高的程度往往与细胞受损的程度呈正相关^[19]。在缺血-再灌注损伤及梗死早期，由于细胞膜上电压门控Ca²⁺通道开放，大量Ca²⁺进入细胞内引起Ca²⁺超载，同时，Mn²⁺也随电压门控Ca²⁺通道大量进入细胞内。此外，Mn²+在细胞外体液中代谢速度很快，在犬体液中半衰期仅为0.8 min^[25]。Mn²⁺的这些良好的生物学特性和药代动力学特点允许MEMRI发展为多器官细胞Ca²⁺内流监测的新技术。

       Cross等^[26]给垂体腺瘤成年大鼠鼻腔注射一定量MnCl2溶液后，动态MRI发现瘤区信号强度与正常垂体形成明显差异，由于神经内分泌释放是细胞Ca²⁺内流而触发，使用钙通道阻滞剂后肿瘤信号强度降低，系列证据表明垂体腺瘤中Ca²⁺量明显较正常垂体组织增加，与FDG-PET结果有很好的一致性。Waghorn等^[27]在小鼠心肌梗死模型中采用T1WI及T1-mapping心脏MEMRI技术成功活体动态监测钙稳态的改变，梗死区及周围损伤心肌的纵向弛豫率变化量(△R1)明显低于正常心肌，可用来评估心肌活力及疾病的进程。Andrews等^[28]首次报道MEMRI技术研究心肌肥厚与△R1之间的关系，通过构建小鼠心肌肥大模型，观察心肌肥厚出现前后△R1的变化，结果显示心肌肥厚组织Mn²⁺摄取量显著低于正常心肌，MRI显示前者信号强度低于后者，两者△R1存在明显差异，表明心肌发生肥厚后Ca²⁺处理方式发生了变化。

       Zhao等^[29]采用MEMRI也成功早期检测急性肠系膜缺血，该研究采用急性肠系膜缺血兔模型，通过绘制Mn²⁺剂量-依赖曲线及Mn²⁺时间-清除曲线，进一步优化Mn²⁺输注剂量及扫描时相。结果发现输注Mn²⁺后缺血肠壁强化程度较正常肠壁降低，与对照组和假手术组比较，缺血肠壁△R1也存在明显差异，表明通过MEMRI检测急性肠系膜缺血△R1能够早期识别动物模型中存在缺血的小肠。同样，Zhao等^[30]在MRI动态监测小肠缺血-再灌注损伤肠上皮细胞内Ca²⁺变化的研究中发现，小肠缺血-再灌注损伤时肠上皮细胞内存在明显的Ca²⁺超载，采用Ca²⁺通道阻断剂对小肠缺血-再灌注损伤模型进行干预，发现相关药物可以明显抑制小肠上皮细胞内Ca²⁺超载。Mn²⁺具有良好的理化及生物兼容特性，Mn²⁺模拟Ca²⁺-MRI离子示踪是目前最有希望在临床上实现活体早期检测脏器损伤细胞内Ca²⁺超载的一种新技术。

3.3　MEMRI应用的注意事项

       Mn²⁺的主要缺陷是细胞毒性，限制了MnCl2溶液作为MRI对比剂的早期应用^[4]。MnCl2是一种有害化学物质，靶器官损伤主要为中枢神经系统、心脏及肺。慢性锰暴露可导致帕金森病样症状，急性过量锰暴露也可导致肝衰竭和心脏毒性^[4]。长期接触锰尘还会影响男性生育能力，提升肺炎的发病风险，也是一种潜在诱变剂^[31]。采用Mn²+动态示踪早期MODS细胞内Ca²⁺变化时，对Mn²+毒性应予充分重视，严格控制Mn²⁺溶液剂量及浓度。目前可选用降低其毒性的新型Mn²⁺对比剂：① Mn²⁺螯合至某些大分子上制成的锰螯合物，在血液循环时间较长，结合力较弱，可缓慢释放Mn²⁺，不致于造成血液中Mn²⁺浓度骤然显著升高。游离Mn²⁺在组织或器官呈累积沉积，一定时间后MRI可探测其引起的T1值及信号变化，达到既降低Mn²⁺毒性又能满足诊断要求。② Ca²⁺制剂成比例与Mn²⁺对比剂混合输注，Ca²⁺可竞争性减少Mn²+通过钙通道，也可达到降低Mn²⁺毒性的目的。

       关于Mn²⁺输注后MRI最佳检测时间窗的问题，目前有这方面单个器官的研究结果。例如，Yang等^[32]报道眼球内注射Mn²⁺溶液后MRI显示大鼠视觉通路中的最佳时间是24~30 h，视神经、外侧膝状体和上丘可达到最大强化。Delattre等^[33]和Waghorn等^[27]采用MEMRI对心肌梗死动物模型早期心脏相关指标进行量化评估，包括梗死灶大小、射血分数及室壁增厚百分比等，发现Mn²⁺输注后45 min可出现明显的心肌强化差异。Zhao等^[29]采用MEMRI研究了肠系膜缺血兔模型早期肠壁T1值的变化，发现Mn²⁺最佳输注剂量是10 nmol/g BW，MRI最佳扫描延迟时间为10~15 min。由此推测，采用MEMRI动态监测早期MODS细胞内Ca²⁺变化具有可行性，但其过程可能比较复杂，要实现对MODS早期多器官细胞内Ca²⁺变化进行监测，MRI扫描时间窗的确定十分重要，有待进一步动物实验进行探索。

4　研究前景及展望

       MRI对比剂的研制已有30余年历史，尤其是最近10年，越来越多的新型对比剂相继问世，并在临床上得到了应用。但是，传统对比剂只能满足部分或典型疾病的诊断及评估，临床亟待新型靶向对比剂投入应用。Mn²⁺化合物用作MRI对比剂的主要问题是其毒性，近年来不少学者为克服Mn²⁺毒性做了大量的探索，并能有效将其毒性降低至安全范围。除上述锰螯合剂和Ca²⁺-Mn²⁺混合制剂外，纳米技术在Mn²⁺相关MRI对比剂中的应用研究已取得更好的去毒效果，有望不久用于临床试验。

       20世纪后期，纳米技术崭露头角，如今在各个领域均为研究热点，包括生物医学，并推动了MRI对比剂的研发。将锰原子或氧化锰用纳米材料包裹成形状及大小可控的纳米颗粒，然后对纳米颗粒进行生物包被使其具有良好的生物兼容性。为了精确靶向病变，进一步在纳米颗粒的表面增加特异性抗体或多肽等"导弹分子"修饰，能使这种靶向纳米对比剂准确识别并与病变部位特异性结合，不仅能够进一步提高MRI对疾病诊断的敏感度和特异度，而且大大降低了Mn²⁺的细胞毒性。此外，将治疗药物同时负载于纳米颗粒内，多能纳米颗粒靶向病变并释放治疗药物，从而兼顾诊断与治疗双重功能。

       开展MEMRI探索多脏器损伤细胞内Ca²⁺变化的研究具有重要的意义，有望为开创一种早期、无创、实时活体监测各种原因导致全身多脏器损伤细胞内Ca²⁺变化的影像学新技术奠定基础，有助于对MODS病理生理机制的深入了解。其活体实时对全身多脏器细胞内Ca²⁺变化的动态监测可用于指导合理的干预治疗，筛选活性药物和直接评价疗效，对于降低MODS与MOF的发生率、提高患者的治愈率及生活质量具有十分重要的临床意义