根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2016最新版中枢神经系统肿瘤的病理分类^[1]，脑胶质瘤(brain glioma，BG)分为低级别胶质瘤(Ⅰ、Ⅱ级)、高级别胶质瘤(Ⅲ、Ⅳ级)。临床上，高、低级别胶质瘤的治疗方式及预后不同，前者术后常规辅以放化疗，而后者大部分只需手术切除即可^[2]。因此，术前对胶质瘤级别的判断对临床治疗有重要指导意义。微血管密度(microvessel density，MVD)与肿瘤侵袭性及预后密切相关，有研究认为MVD与胶质瘤级别相关^[3,4]，目前主要依赖术后病理检测。动脉自旋标记(arterial spin labeling，ASL)技术可半定量测定肿瘤内部血流灌注情况，从而间接预测肿瘤微血管生成情况^[5,6]。本研究拟通过测定平均最大相对脑血流量(mean maximum relative cerebral blood flow，rCBFmax)值与肿瘤MVD之间的相关性，并与病理结果对照，来评价ASL术前对胶质瘤分级及无创性预测患者预后的能力。

1　材料与方法

1.1　一般资料

       收集我院2015年1月至2016年12月50例胶质瘤患者的资料，术前均行ASL检查，男性29例，女性21例，年龄6~72岁，平均37.2岁。根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤的病理分类^[1]，包括低级别胶质瘤(Ⅰ、Ⅱ级)30例、高级别胶质瘤(Ⅲ、Ⅳ级)20例。所有患者术前均未进行放化疗等抗肿瘤治疗，并在MR检查后1 w内手术。手术切除肿瘤组织均行MVD免疫组化表达测定。

1.2　ASL检查

1.2.1　仪器设备

       所有患者磁共振检查均符合安全原则，并签有知情同意书。采用GE Signa HDxt 3.0 T MRI扫描，8通道相控阵头线圈。

1.2.2　主要成像序列与参数

       3D-T1WI BRAVO序列：TR=8.8 ms，TE=3.5 ms，FA=15度，层厚=1.2 mm，激励次数=1，FOV=240 mm×240 mm，矩阵=256×256。3D-ASL序列：TR=4599 ms，TE=9.8 ms，层厚=4 mm，激励次数=3，FOV=240 mm×240 mm，矩阵=512×512，标记后延迟时间=1525 ms。

1.2.3　3D-ASL图像后处理

       将原始数据导入GE工作站(ADW4.6)，采用Functool软件对图像进行后处理。

1.2.4　感兴趣区选择

       由两位经验丰富的神经影像医师共同讨论，参考相关文献[7]，避开囊变、出血、坏死及钙化区，选用热点法放置感兴趣区于肿瘤实性部分并测量3次取平均值，计算方法如下：肿瘤最大相对灌注量=肿瘤最大灌注区平均值/对侧大脑半球灰质平均值×100%。

1.3　MVD表达的免疫组化检测与结果判定

1.3.1　检测方法

       采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法检测胶质瘤组织中MVD表达，其中MVD用CD31来标记。

1.3.2　主要试剂

       小鼠抗人CD31单克隆抗体、S-P超敏试剂盒及DAB试剂盒均购自中杉生物技术公司。

1.3.3　结果判定

       由两位神经病理科医师进行分析，胶质瘤分为Ⅰ~Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤。MVD的计数采用Weidner法^[8]，将切片置于40倍显微镜下确定最高血管密度区域，即热点区，再于400倍视野下计数，选择5个最高血管密度区进行微血管计数，然后求其平均值作为该病例的MVD值。

1.4　统计学处理

       用SPSS 17.0统计分析软件包处理数据，对数据进行正态检验和方差齐性检验，两样本均数比较采用Mann-Whitney检验，两变量的相关分析采用Spearman相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　肿瘤rCBFmax值与胶质瘤级别

       随着胶质瘤级别增高，肿瘤平均rCBFmax值升高。本研究中低级别胶质瘤组平均rCBFmax值(1.69±1.27)低于高级别胶质瘤组(3.18±1.46)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。肿瘤rCBFmax值与胶质瘤级别呈正相关(r=0.620，P<0.01)，见图1、图2，表1。

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图1  男，72岁，右侧颞叶胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)。A：T1WI增强图，右侧颞叶肿瘤(箭)；B：3D-ASL CBF图，肿瘤实性部分rCBFmax值为3.17；C：MVD免疫组化染色图，平均MVD值为101.4
图2  女，38岁，右侧额叶弥漫性星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)。A：T1WI增强图，右侧额叶肿瘤(箭)，增强后未见明显强化；B：3D-ASL CBF图，肿瘤实性部分rCBFmax值为1.89；C：MVD免疫组化染色图，平均MVD值为12.3
Fig. 1  Seventy-two years old man, a histologically verified grade Ⅳ glioblastoma in the right temporal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right temporal lobe tumor (arrow); B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 3.17; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 101.4.
Fig. 2  Thirty-eight years old woman, a histologically verified grade Ⅱ diffuse astrocytoma in the right frontal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right frontal lobe tumor (arrow), there was no obvious enhancement after enhancement; B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 1.89; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 12.3.

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表1  不同级别胶质瘤rCBFmax值与MVD表达关系
Tab.1  The rCBFmax and MVD differences of astrocytoma

2.2　MVD值与胶质瘤级别

       随着胶质瘤级别增高，肿瘤平均MVD值升高。本研究中低级别胶质瘤平均MVD值(25.43±13.03)明显低于高级别胶质瘤组(58.69±20.39)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)，且与级别呈正相关(r=0.698，P<0.01)，见图1、图2，表1。

2.3　肿瘤rCBFmax值与MVD相关性

       肿瘤rCBFmax值与MVD值呈正相关(r=0.723，P<0.01)，见图3。

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图3  胶质瘤rCBFmax值与MVD表达相关性的线性回归图
Fig. 3  Linear regression diagram correlation between rCBFmax value and MVD of gliomas.

3　讨论

3.1　rCBFmax值与胶质瘤级别的关系

       ASL技术是一项新兴的磁共振功能检查技术，具有无辐射、无创、可重复性、无需注射对比剂等优点，尤其适合用于老人、小孩及肾功能不全的患者^[2,9]，多项研究证实其可取代传统的动态磁敏感对比增强法对胶质瘤内部微血管灌注进行评价^[10,11,12]。众所周知，肿瘤的生长与微血管生成密切相关，肿瘤的微血管密集程度是恶性肿瘤分级的最重要标准之一。病理学是评价微血管密度的金标准，但是属于有创性检测。常规MR增强反映的是血脑屏障的破坏，不能准确显示肿瘤内部微血管丰富或密集程度，观察到的肿瘤强化部分也不能代表肿瘤恶性程度最高的部分，从而对胶质瘤术前分级存在误判。而ASL技术的主要参数rCBFmax值显示的是肿瘤微血管灌注情况，从而间接反映肿瘤微血管密集程度，对术前无创性预测胶质瘤级别准确性较高；并且由于胶质瘤的异质性，肿瘤内部微血管灌注往往不均匀，同一胶质瘤不同部位取材可能最后病理结果并不一致，笔者采用热点法^[7]所测rCBFmax值是肿瘤内部微血管最为密集之处，理论上对应胶质瘤内部恶性程度最高部分，从而更准确预测胶质瘤分级。本研究笔者选用相对灌注量而非绝对灌注量，是因为从理论上来说，虽然绝对灌注量可通过ASL方法测定，但是实际应用中有很多不稳定因素影响测值，比如组织和血液的弛豫时间不同及病理状态等。因此通过使用ASL测量的CBF值被认为是成比例，而不是等同于实际局部CBF值，所以用相对血流量来表述更为恰当。需要指出的是，之所以选择肿瘤最大灌注值，是由胶质瘤内部异质性与不均质性决定的，此处对应血管最为密集，相对病理学分级最高，此与病理学测定方法也是一致的。曲源等^[13]研究表明高级别胶质瘤的CBF值显著高于低级别胶质瘤；董卫敏等^[2]研究表明高低级别胶质瘤组最大脑血流量、对侧正常灰质脑血流量的平均值分别为2.13±1.14、0.79±0.40，差异有统计学意义；李锐等^[14]研究表明高低级别胶质瘤组rCBFmax-ASL值分别为2.57±0.16、1.16±0.05，两组间差异有统计学意义；张玉琴等^[15]研究结果为高低级别胶质瘤CBF值患侧/健侧比值分别为3.11±1.45、0.86±0.28，两组间差异有统计学意义。本研究中低级别胶质瘤组平均rCBFmax值(1.69±1.27)明显低于高级别胶质瘤组(3.18±1.46)，两组间差异有统计学意义，肿瘤rCBFmax值与胶质瘤级别呈正相关，说明肿瘤平均rCBFmax值可用于胶质瘤内部微血管灌注情况的评价，进而反映胶质瘤级别，并且随着胶质瘤级别升高而数值有增高趋势，此与上述文献报道一致^[2,13,14,15]。

3.2　MVD值与胶质瘤级别关系

       CD31是一种跨膜糖蛋白^[3]，属于免疫球蛋白超级家族成员，主要分布在脉管细胞如单核细胞、中性粒细胞细胞表面，尤其在培养的血管内皮细胞的连接处有高水平表达，与血管形成关系密切，因此可作为内皮细胞特异的标记物。病理上即可使用CD31标记的血管内皮细胞来计算MVD，从而评价胶质瘤级别。张旭标等^[4]对44例脑胶质瘤标本采用免疫组化染色法与双重免疫荧光组化染色法对血管内皮细胞标记物CD31表达进行检测，结果显示，Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤组织中CD31阳性表达率明显高于Ⅱ级病变组织。王建祯等^[3]用Northern杂交和免疫组化法检测50例胶质瘤，结果显示低级别胶质瘤和正常脑组织中阳性血管数量明显少于高级别胶质瘤组，CD31在胶质瘤中的表达水平随着胶质瘤级别的增加而增加。本研究中低级别胶质瘤平均MVD值(25.43±13.03)明显低于高级别胶质瘤组(58.69±20.39)，两组间差异有统计学意义，且与级别呈正相关。此与文献报道一致^[3,4]。

3.3　rCBFmax值与MVD值表达间关系

       本组病例结果显示肿瘤rCBFmax值与MVD值呈正相关，说明rCBFmax值反映的是微血管灌注情况，能更直观反映肿瘤内部微血管的形成情况，预测肿瘤微血管密度，为肿瘤术前分级提供参考。国内外已有文献研究ASL相关参数rCBFmax值与脑肿瘤微血管密度之间的关系^[7,16]，结果证实rCBFmax值可预测肿瘤微血管密度，可用于胶质瘤的术前分级(低级别与高级别)，此与本研究结果一致。

3.4　不足之处

       本研究的不足之处在于ASL技术图像空间分辨率较低，采集时间较长，缺乏图像上rCBFmax值测值点与病理标本的点对点对照分析，并且样本量仍偏少，未按照各级别胶质瘤来细分，有待加大样本量并以rCBFmax值来指导病理取材并进一步研究。