阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的主要病理改变是神经细胞外Aβ蛋白聚集形成的淀粉样斑块和神经元内tau蛋白过度磷酸化聚集形成的神经纤维缠结。目前应用MR技术在体显示淀粉样斑块的技术主要分两类，一类是应用Aβ蛋白来标记对比剂，靶向结合淀粉样斑块对其进行显影。有研究成功应用Aβ1-40标记的钆喷酸葡胺显示小鼠脑内的淀粉样斑块^[1]，但该技术的弊端是标记后的对比剂分子较大，必须破坏血脑屏障后才能进入脑组织，并且具有一定毒性，所以只用于动物实验或是脑组织尸检研究。另一类是通过探测淀粉样斑块内及周围的铁沉积来显示斑块，并且通过定量分析铁沉积来间接反映斑块数量，这种技术可以敏感地探测到由铁沉积造成的斑块周围弛豫信号改变，无需引入对比剂及破坏血脑屏障，可以直接进行活体显像^[2,3]。

       目前，可用于定量检测脑组织铁含量的磁共振方法有探测弛豫信号变化的弛豫率增高信号(field-dependent R2 increase，FDRI)及探测相位信号变化的磁敏感技术等^[4,5,6,7,8]。三维增强磁敏感成像(3D-enhanced susceptibility weighted angiography，ESWAN)是一种改良的磁敏感技术，它采用梯度回波的自由感应衰减和回波采样序列进行三维图像采集，消除了水等异常信号对铁沉积信号的影响，并且应用了高通滤波等后处理技术，去除了由于场强不均造成的噪声伪影，增强铁沉积区域的相位改变，可以更敏感地探测到铁信号^[9]。本研究应用ESWAN来探测小鼠脑内铁沉积，用平均相位值（mean phase value，MPV）表示，并研究其与铁蛋白及淀粉样斑块分布的相关性。

1　材料与方法

1.1　动物模型

       APPswe/PSEN1de9基因突变型小鼠（购自美国Jackson Laboratory，简称为APP/PS1转基因小鼠，该转基因小鼠由中国医科大学实验室购买，实验室繁育，每一只小鼠确定携带基因后方进行MRI扫描及组织学检测）及年龄匹配的非转基因野生型小鼠（C57BL/6）各5只，均为雌性，按照6月龄、12月龄、18月龄分组。实验动物麻醉采用腹腔内注射异戊巴比妥钠(2％戊巴比妥钠40 mg/kg)，麻醉后进行MR成像及组织学检测。

1.2　MR扫描

1.2.1　图像采集

       采用GE Signa HDxt 3.0 T超导MR扫描仪，四通道相阵控小动物线圈，行常规T2WI、T1WI进行图像定位及ESWAN序列扫描。设备参数：冠状位T2WI，采用快速自旋回波序列（fast spin echo，FSE）序列，TR=4680 ms，TE=85 ms，矩阵＝288×256，NEX=4，层厚＝1.5 mm，间距= 0.3 mm；冠状位T1WI，采用FSE序列，TR=480 ms，TE=min full，矩阵＝256×192，NEX=8.0，层厚= 1.5 mm，间距=0.3 mm；ESWAN采用高分辨率的三维扰相梯度回波（3D-spoiled gradient recalled echo，3D-SPGR）序列，自动TR=7.1 mm，回波链长度＝14，层厚＝1.5 mm，矩阵＝288×256，激励次数4次，接受带宽＝31.25 Hz。

1.2.2　图像后处理

       ESWAN原始扫描数据传至Advantage Workstation 4.4(Sun Microsystems，Santa Clara，Calif)，应用研究软件Functool 9.4.05a(GE Healthcare)进行去噪及滤波处理（64×64）后，同时得到强度图和相位图，应用T2加权图像进行定位，勾画皮质区、海马区及丘脑区作为感兴趣区（region of interest，ROI）（如图1所示），将ROI镜像复制至ESWAN相位图和强度图，读取MPV。

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图1  APP/PS1转基因小鼠脑MPV测量ROI示意图。A、B为对照组磁矩图及相位图，C、D为AD组磁矩图及相位图。P为皮质区，H为海马区，T为丘脑区
Fig. 1  The ROI selection of MPV measurement of APP/PS1 transgenic AD rat brain MR scan image. A, B are the magnetic moment diagram and phase diagram of the control group, C, D are the magnetic moment diagram and phase diagram of the AD group. Region P: Cortical area, H: Hippocampal area, T: Thalamic area.

1.3　免疫组织化学染色

       MR检查后小鼠开胸从左心室插管至升主动脉，先灌注0.9％生理盐水30 ml，随后灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液30 ml，取脑后将其置于上述固定液中12 h。然后将脑组织置于70%、80%、95％及100％的酒精梯度脱水，浸蜡，组织块包埋后行石蜡切片，片厚约为50 μm。

       切片脱蜡后用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗，山羊血清封闭室温下30 min后甩掉，淀粉样斑块显色滴加Aβ蛋白(1~40)抗体作为一抗，铁蛋白显色滴加铁蛋白抗体作为一抗，4℃孵育过夜；第2天用0.01 ml PBS 3次清洗后滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC），37℃孵育30 min；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色15~20 min，镜下控制反应时间，充分水洗；苏木素复染，流水冲洗。常规脱水，透明和封片。用PBS代替一抗，排除二抗的非特异性染色，结果为阴性。

       在NIKON光学显微镜下对动物左侧丘脑区、海马区及皮质区进行观察并采集图片。每只小鼠检测3张相同部位切片，应用NIS-Elements软件对图像进行观察分析，每张切片检测3个视野(10×objective)。计数每个视野所有的Aβ、铁蛋白染色斑块个数，及阳性染色斑块所占总面积百分比。

1.4　统计学分析

       应用IBM SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。每个感兴趣区内转基因小鼠与对照组小鼠的MPV采用独立样本t检验；采用ANOVA方差分析检验每个感兴趣区内各月龄组小鼠的MPV及组织学斑块统计结果的差异性；相同感兴趣区MPV与斑块数量、斑块面积百分比相关性分别应用Pearson相关分析检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　免疫组化结果

       转基因小鼠中，Aβ蛋白阳性斑块与铁蛋白阳性斑块均呈深褐色（见图2），Aβ蛋白斑块染色较深，并且部分较大斑块在中心可观察到深染的类圆形核心；铁蛋白斑块染色较浅，斑块内染色均匀。在转基因小鼠组中，同一ROI内小鼠的Aβ蛋白斑块与铁蛋白斑块数量和范围差异均具有统计学意义（见表1）。

       视野内斑块数量的计数结果显示，18月龄的APP/PS1小鼠脑内感兴趣区内Aβ蛋白斑块与铁蛋白斑块数量都明显高于前两组，并且斑块范围也较其他组增大（见图3、图4）。在6月龄组，所有的ROI内没有观察到铁蛋白的沉积，在部分小鼠海马区和皮质区观察到少量淀粉样斑块沉积。在相同的ROI内，淀粉样斑块与铁蛋白斑块在数量与范围上都分别具有相关性（相关系数见表2）。

       对照组中，仅在18月龄组内观察到少量Aβ蛋白斑块与铁蛋白斑块，6月龄及12月龄组小鼠脑内未观察到上述斑块的沉积。

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图2  海马区淀粉样斑块（A）与铁蛋白斑块（B）免疫组化染色(×　400)
图3  APP/PS1小鼠Aβ40免疫组化染色图像(×　100)。A～C为4 m小鼠脑皮质区、海马区及丘脑区图像；D~F为10 m小鼠上述3个部位图像；G~I为16 m上述3个部位图像。深棕色为阳性染色斑块，即老年斑
图4  APP/PS1小鼠铁蛋白免疫组化染色图像(×　100)。A~C为4 m小鼠脑皮质区、海马区及丘脑区图像；D~F为10 m小鼠上述3个部位图像；G~I为16 m上述3个部位图像。浅棕色为阳性染色斑块，即铁蛋白集中局域
Fig.2  Amyloid plaques (A) and ferritin plaques (B) immunohistochemical staining (× 400) in the hippocampus.
Fig.3  APP/PS1 mouse Aβ40 immunohistochemical staining (× 100). A—C show 4 m mice brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Dark brown is a positive staining for plaques (senile plaques).
Fig.4  APP/PS1 mouse ferritin immunohistochemistry staining (× 100). A-C show the 4 m mouse brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Light brown is a positive stain (the concentration of ferritin).

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表1  模型组不同年龄组APP/PS1小鼠皮质、海马、丘脑区MPV及方差分析结果
Tab.1  Results of MPV and variance analysis of cortex, hippocampus and thalamus in APP/PS1 mice of different age groups

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表2  模型组感兴趣区平均相位值与组织学参数的相关性
Tab.2  The correlation coefficient between the average value of the area of interest and the histological parameters

2.2　ESWAN结果

       转基因组小鼠脑内皮质区(t=-2.201 ， P=0.045)与海马区(t=-2.524 ，P=0.024)的MPV差异均有统计学意义，而丘脑区的MPV差异无统计学意义(t=-2.094 ， P=0.055)。对照组小鼠各区域内MPV组间差异均无统计学意义。18月龄的转基因小鼠皮质区及海马区的MPV要明显低于对照组，而丘脑区两组的MPV未见明显差异（见图5）。转基因组小鼠相同感兴趣区不同年龄组的MPV值差异具有统计学意义，并且平均相位值由低年龄组向高年龄组递减，比较转基因小鼠组不同感兴趣区的MPV的均值可见，皮质区的MPV在各月龄组均最低（见表1）。转基因小鼠脑内相同的感兴趣区MPV与组织学分析所得铁蛋白的数量和范围分别具有显著相关性（见表2及图6）。模型鼠中，脑内MPV值与铁沉积、Aβ斑块的数量及其所占面积百分比呈正相关。

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图5  不同月龄模型鼠脑内皮质、海马、丘脑内MPV、铁蛋白及Aβ斑块分布
Fig. 5  Distribution of MPV，ferritin and Aβ protein patch in the cortex, hippocampus and basal ganglia in transgenic mice.

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图6  脑内MPV值与铁蛋白、Aβ斑块相关性分析
Fig. 6  The correlation of MPV, ferritin and Aβ protein patch in brain.

3　讨论

3.1　APP/PS1基因突变型小鼠

       本研究应用的模型组小鼠为APP/PS1基因突变型小鼠，它可以同时表达人鼠嵌合型APP基因与人类早老素1基因，这两种基因都出现在家族性AD患者中^[10]。研究表明，PS1基因的转入可以使鼠脑内形成老年斑的时间缩短，以往研究报道APP/PS1双转基因小鼠模型在5~7个月就出现老年斑，并且表现出空间学习能力降低和记忆力的减退^[11]，而本研究动物模型6 m组部分小鼠脑内可观察到淀粉样斑块，这与以往研究是相符合的。并且随着年龄的增长模型组小鼠脑内Aβ斑块的数量逐渐增加，尤其是在皮质区及海马区域内，这也与Izco等^[12]和Ferguson等^[13]的研究符合。

3.2　ESWAN技术的优势

       以往应用MR在体定量研究小鼠脑内铁含量的技术多为计算组织的FDRI，大量研究证明FDRI与铁含量成线性相关，可以定量分析组织内铁含量^[14,15,16]。但是这种技术要收集同一受试体至少两个场强的弛豫率，然后计算获得FDRI，因此在变换场强的操作中不可避免地会产生系统偏倚，影响信号的准确性。并且应用弛豫率信号反映铁含量时，不可避免地会受到水等影响弛豫率物质的影响，这就降低了FDRI的特异性^[17]。本研究应用的ESWAN技术，主要分析的是顺磁性物质铁存在造成的周围磁场相位信号的改变，根据公式Δψ（phase)=-rΔBTE(r为磁旋比，ΔB为组织间的场强变化，TE为回波时间)和ΔB=cVΔxB0(c为铁含量，V为体素体积，并且Δx是铁存在导致的分子间磁敏感差异性)，可以推出在相同的TE条件下，相位信号与铁含量呈负相关，获取感兴趣区的相位信息只需要一次扫描就可完成，并且由上述公式可以看出，相位信号受其他物质影响较小，因此在反映组织内铁含量时有较好的特异性。然而磁敏感加权成像图像常伴有磁敏感伪影，这种伪影主要生成于原始图像中的相位图像，磁敏感伪影出现在不同磁化率组织的交界面上，主要是由于磁化率的不同导致局部磁场变化，造成质子自旋失相位，产生相位差异，经傅里叶重建之后图像变形，部分信号丢失^[18]。本研究结果显示ESWAN技术测量得到鼠脑感兴趣区平均相位值与铁蛋白的数量与斑块范围均呈现相关具有统计学意义，进一步验证了上述理论，说明相位值的变化与铁沉积具有相关性。

3.3　APP/PS1转基因小鼠脑内铁沉积与相位值

       本研究发现AD模型组小鼠的皮质区与海马区的MPV值随月龄增长而降低，这说明铁沉积随月龄增大持续增多，而在对照组小鼠的MPV值组间差异并没有统计学意义，Gao等^[9]应用MR弛豫时间技术研究相同模型小鼠脑内铁沉积时，只在丘脑区域得到了类似结论，而在皮质区及海马区模型组与对照组都没有发现明显的随年龄变化的铁沉积规律，这有可能与该研究应用的MR技术对组织水造成的弛豫时间改变敏感，而皮质和海马周围都存在大量脑脊液（结构比邻蛛网膜下间隙与侧脑室），造成这两个区域铁沉积分析特异性差所致。而在健康人脑铁随年龄变化的研究^[19]与AD患者脑铁沉积研究中都有与本研究相似的规律报道^[18]。在APP/PS1转基因小鼠的研究中发现，18 m组各感兴趣区的相位值明显低于6 m与12 m组，提示在老龄APP/PS1转基因小鼠脑内铁沉积可能是持续进行的。人类脑铁沉积在正常情况下，某些特定部位（基底节区、海马等）也有与正常鼠脑相似的规律，即在正常人30岁左右处于停滞状态^[19,20,21]，但是在AD病理状态下，铁沉积表现出与疾病发展明显程度相关^[17]。

       本研究还显示不同部位的相位值存在差异，转基因小鼠皮质区MPV最低，说明该区域脑铁含量明显低于海马区与丘脑区。皮质区与海马区被公认为老年斑沉积范围及数量较多的区域，以往研究已证实随着年龄和病程的进展其斑块分布与铁沉积具有相关性，但是对于丘脑区的研究仍存在争议。Westland等^[3]认为在丘脑区的铁沉积可能与微出血等病理状态相关，在该区域内并没有表现出明显的AD淀粉样斑块相关的铁沉积，Dhenain研究除了在丘脑区发现大量低信号斑块外并没有在皮质和海马区发现铁沉积相关的低信号斑块。但是在本研究中却得到了与其相反的结论，结合铁蛋白免疫组化结果发现，在皮质区与海马区，发现随年龄增长出现大量与淀粉样斑块相关的铁蛋白沉积，并且测量到MPV值明显降低，更支持了铁沉积的存在。在丘脑区，尤其是月龄较高的转基因小鼠脑组织内，本研究同样发现了与淀粉样斑块相关的铁蛋白阳性斑块，证明丘脑区的淀粉样斑块与铁沉积是具有相关性的。笔者认为与前人研究产生这一矛盾结论的主要原因可能是Dhenain研究所应用的MR技术无法有效鉴别丘脑区低信号斑块的成分组成，如钙等其他会影响弛豫时间改变及信号改变的物质，而ESWAN技术可以针对性地对铁进行显示，并且进行相应的定量测量。

4　结论

       本研究显示APP/PS1转基因小鼠脑内皮质区、海马区及丘脑区的铁沉积持续进行，并且与淀粉样斑块的形成具有相关性，ESWAN技术平均相位值的改变与铁沉积具有明显相关性，为在体定量研究脑组织铁沉积提供了新的方法。