糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者发生外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）的风险较高，经皮腔内血管成形术和手术旁路效果较非糖尿病患者差，围手术期发病率和死亡率增加，截肢率高^[1]。严重肢体缺血（critical limb ischemia，CLI）是糖尿病外周动脉疾病的最晚期阶段，下肢骨骼肌肉血供不足萎缩坏死，患者截肢或死亡的风险极高^[2]。

       纹理分析（texture analysis，TA）是通过CT和MR的灰度级和（或）像素强度研究病变组织异质性的图像后处理技术，可对人眼观察不到的变化引起的图像异质性进行量化^[3]。研究结果^[4]显示动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI) K^trans可用于量化糖尿病组下肢血管病变的目鱼肌、胫骨前肌微血管通透性的变化。柳伯玉等^[5]研究结果显示基于DCE-MRI K^trans可用于评估糖尿病骨骼肌微血管渗透性改变，基于K^trans图的灰度共生矩阵纹理特征参数可识别糖尿病早期骨骼肌微结构变化。本研究采用DCE-MRI定量参数评价兔糖尿病合并严重肢体缺血的骨骼肌微血管通透性，同时探讨基于DCE-MRI K^trans的纹理分析能否反映骨骼肌早期细微结构变化。

1　材料与方法

1.1　兔糖尿病合并严重肢体缺血模型的建立

       动物实验经武汉大学人民医院伦理委员会审查通过。武汉大学动物实验中心提供健康新西兰雄性大白兔24只，空腹2.0~ 3.0 kg，平均(2.7±0.3)kg。实验动物由武汉大学人民医院实验动物中心饲养，室温控制在25℃。24只兔适应性饲养一周后，测量空腹血糖，24只兔血糖在正常水平且无明显差异[(5.5±0.5) mmol/L］。

       24只兔禁食、水8 h后，将四氧嘧啶(Sigma公司)用生理盐水配制成5％溶液，按照100 mg/kg于30 s内由耳缘静脉摄入实验组兔体内，24 h内用血糖仪（强生PEB003006P)每小时监测末梢血糖一次。单次外周血糖测量值大于14 mmol/L或两次测量大于11 mmol/L被认定为造模成功^[4]。

       随机将兔分为实验组12只、假手术组12只。2周后对实验组兔行经耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥钠(1 mL/kg）麻醉。自股动脉起始部（腹股沟韧带处）结扎股动脉。假手术组取右侧腹股沟处做约3 cm斜行切口，随即缝合。使用数字化X线透视摄影系统SONIALVISION G4(SHIMADZU，JAPAN)，经髂总动脉入路插入肝素浸泡的3 F微导管，头端置于骼总动脉内，手动注射碘佛醇（320 mgI/mL，江苏恒瑞医药股份有限公司，中国）20 mL，所有动物处置均遵循实验动物伦理原则。

1.2　MRI设备及成像技术

       在造模成功后1、2、3周，实验组、假手术组兔经耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉。麻醉后将兔仰卧位，足先进固定于8通道膝关节专用相控阵线圈，采用3.0 T超导MR机（Discovery MR750 Plus，GE Healthcare)行右侧大腿股外侧肌，常规轴位FSE-T1WI、FSE-T2WI和右侧大腿股外侧肌DCE-MRI扫描。

       DCE-MRI采用肝脏快速容积采集（liver acquisition volume acceleration，LAVA）序列及阵列空间敏感编码技术（array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)。在基线扫描2个动态时相之后通过双筒高压注射器（Medrad Spectris Solaris EP Mobile Mount MR Injection System)经兔耳缘静脉团注欧乃影(钆双胺，GE Healthcare，上海），注射剂量为0.2 mmol/kg，流率为1.0 mL/s，随后同样流率注射0.9％生理盐水5 mL冲管。

1.3　DCE-MRI定量参数分析

       将DCE-MRI原始数据导入Omni-Kinetics (GE Healthcare)软件进行分析。选择股骨中段层面的图像，手动勾画ROI，避开皮下脂肪层、筋膜软件自动计算出容量转移常数（volume transfer constant，K^trans)、血管外细胞外间隙容积分数（extravascular extracellular volume fraction，Ve）及速率常数（rate constant，Kep)，每个ROI测量3次取平均值（图1、图2)。

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图1  A~ D分别为第3周实验组增强T1WI、K^trans、Kep、Ve图
图2  A~ D分别为第3周假手术组增强T1WI、K^trans、Kep、Ve图
图3  红色区域为右侧股外侧肌ROI区
图4  黑色箭所指棕黄色颗粒为CD31标记的微血管
图5  黑色箭所指为迁移至外周血的EPCs
图6  A：糖尿病兔行下肢单侧股动脉结扎术后立即造影，细箭头所指为结扎未再通股动脉；B：糖尿病兔行下肢单侧股动脉结扎术第3周造影，细箭头所指为结扎未再通股动脉，粗箭头所指显示侧枝循环形成
图7  基于K^trans纹理参数诊断糖尿病合并严重肢体缺血模型的ROC下面积
Fig. 1  A-D showed the enhanced T1WI, K^trans, Kep and Ve of the experimental group at week 3, respectively.
Fig. 2  A—D showed the enhanced T1WI, K^trans, Kep and Ve of the sham group at week 3, respectively.
Fig. 3  Showed the red area was the ROI area of the right lateral femoral muscle.
Fig. 4  The brown-yellow particles indicated by the black arrowsare are CD31-labeled microvessels.
Fig. 5  Indicate the EPCs migrating to peripheral blood.
Fig. 6  A: Showed angiography after ligation of unilateral femoral artery of lower extremity in rabbits immediately, and the thin arrow indicated ligation without recanalization of femoral artery; B: Showed the angiography of unilateral femoral artery ligation in lower extremity in rabbits at the 3rd week, and the thin arrow indicated ligation without recanalization of femoral artery, the bold arrow shows the formation of collateral circulation.
Fig. 7  Shows the ROC area of the diabetic model with critical limb ischemia diagnosed based on K^trans texture parameters.

1.4　图像纹理分析

       采用Omni-Kinetics (GE Healthcare）软件，实验组和假手术组第3周选择股骨中段层面的图像，手动勾画ROI（如图3)计算选定ROI的纹理特征参数。ROI应尽量包全股外侧肌，并保存选定的ROI，提取出每个选定ROI包括直方图（Histogram)、灰度游程矩阵（gray-level run-length matrix，GLRLM)、灰度共生矩阵（gray-level co-occurrence matrix，GLCM)，共63个纹理特征参数值。

1.5　组织病理学检查

       在所有兔完成MRI检查后，采用空气栓塞法处死所有兔，取股骨中段大腿股外侧肌肉，采用环保型GD固定液（主要成分为甲醛溶液、冰醋酸和无水乙醇）固定，石蜡包埋，垂直肌纤维走行作4μm厚薄切片，行CD31免疫组化染色。在光学显微镜（OLYMPUS BX51)下观察切片并拍片（如图4)，采用Image Pro-plus 6.0软件对图像进行分析。CD31免疫组化染色切片在镜下选取3个200倍视野的相同面积区域拍照，取平均值，根据这些区域的微血管数目计算毛细血管密度。任何与邻近微血管及其他结缔组织分离的棕黄色内皮细胞或细胞团可作为单根微血管。

1.6　外周血EPCs计数检测

       将所有兔经耳缘动脉取血。取结晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5％的结晶紫溶液，用时用PBS溶液1∶5稀释成0.1％的结晶紫染液。将生长状态良好的各组内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs)，用胰酶消化制成细胞悬液，吹打均匀，计数。取灭菌的EP管，用200 μL的无血清培养基分别配制成含有2.5×10⁴个细胞悬液。上室接种细胞：将上述制备的细胞悬液吹打均匀后加入Transwell小室中。Transwell板中加入500 μL含10% FBS的完全培养基，将小室放入板中，37℃下于CO2(含量5%）培养箱中培养24 h。染色：将小室取出，用PBS洗去培养基，结晶紫染色10 min；自来水将表面的结晶紫洗除干净，用棉签将上室中的细胞擦除干净，于倒置显微镜下对非细胞接种侧拍照（如图5)。在镜下选取3个200倍视野的相同面积区域计数，取平均值。

1.7　统计学分析

       采用SPSS 22.0软件进行统计分析，先对K^trans、Ve、Kep及病理学参数行正态性检验及方差齐性分析，符合正态分布及方差齐者以±s表示，不符合正态分布的用中位数（上、下四分位数）表示。采用独立样本t检验（数据满足正态分布和方差齐性检验）或Mann- Whitney U检验（不满足正态性或方差齐性时）比较同一时间点糖尿病组、对照组股外侧肌K^trans、Ve、Kep值的差异。对不同时间点K^trans、Ve、Kep值差异比较采用重复测量的方差分析。造模成功后第3周筛选出的基于K^trans纹理参数执行ROC并记录为AUC值来评估有价值的纹理参数的诊断效能。实验组、假手术组股外侧肌微血管密度（microvessel density，MVD)(CD31）及外周血EPCs计数差异比较采用独立样本t检验（数据满足正态分布和方差齐性检验）或Mann-Whitney U检验（不满足正态性或方差齐性时）并采用Pearson相关性分析评估K^trans、Ve、Kep渗透参数及有意义的纹理参数与MVD (CD31)、外周血EPCs的相关性，所有统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

       糖尿病兔行下肢单侧股动脉结扎术后立即股动脉造影与结扎术后第3周造影相比，第3周造影显示闭塞股动脉远端侧枝循环形成（图6)。

       实验过程中实验组兔因麻醉意外、身体健康状况差死亡2只，剩余10只。对照组因麻醉意外死亡1只，剩余11只。

       K^trans值在实验组各时间点差异具有统计学意义(F=5.800，P<0.05)，而在假手术组差异无统计学意义(F=0.533，P>0.05)，实验组股外侧肌K^trans第3周较第1周降低(P<0.05)，提示K^trans值可评估糖尿病合并严重下肢缺血的骨骼肌肌肉的微血管渗透性变化，并可提示病程长短，其他时间点两两比较均无统计学意义(P>0.05)。Ve、Kep在实验组、假手术组各时间点差异具无统计学意义(F值分别为0.991、0.497、0.620、0.671，P均>0.05)。见表1。

       第3周，与假手术组相比，实验组股外侧肌CD31免疫组化染色显示肌纤维间微血管增多，实验组与假手术组MVD平均值分别为（216.100±74.248)/mm²、(46.634±32.119)/mm²，差异统计学有意义(t=-7.257，P<0.05)，提示糖尿病合并严重下肢缺血会引起MVD数量的变化。中位数分别为38.000(34.500，40.750)/mm²、49.000(38.500，49.000)/mm²，差异有统计学有意义(Z=-2.228，P<0.05)，提示糖尿病合并严重下肢缺血会引起外周血EPCs数量的变化。

       下肢缺血造模成功后第3周，Pearson相关分析结果显示实验兔外周血EPCs与K^trans呈正相关性(r=0.598，P<0.05)，实验兔股外侧肌MVD与K^trans无相关性(r=-0.319，P>0.05)，提示K^trans可反映外周血EPCs的功能。实验兔外周血EPCs与Kep无相关性(r=0.287，P>0.05)，实验兔股外侧肌MVD与Kep呈负相关性(r=-0.410，P<0.05)，提示Kep可评估股外侧肌MVD。

       将第3周基于K^trans原始63个特征分别进行降维、建立模型和进行模型诊断，经相关性分析选择特征，提取的纹理参数为最小像素值（MinIntensity)、区间5(Quantile5)、区间10(Quantile10)、三维最大径(Maximum 3D Diameter)。造模成功后第3周，基于K^trans纹理参数执行ROC并记录为AUC值为0.882(敏感性：0.667，特异性：0.833)，见图7。

       下肢缺血造模成功后第3周，Pearson相关分析结果显示实验兔患肢股外侧肌MVD与Quantile5、Quantile10呈负相关性(r值分别为-0.418、-0.407，P<0.05)，提示Quantile5、Quantile10可评估股外侧肌MVD。外周血EPCs计数与MinIntensity、Quantile5、Quantile10呈正相关性(r值分别为0.428、0.463、0.479，P均<0.05)，提示MinIntensity、Quantile5、Quantile10可评估外周血EPCs。

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表1  实验组、假手术组各时间点K^trans、Ve、Kep值比较
Tab.1  Comparison of K^trans, Ve and Kep values at each time point between the experimental group and the sham operation group

3　讨论

       本研究采用基于DCE-MRI渗透性参数及纹理分析评价四氧嘧啶诱导兔糖尿病合并严重肢体缺血早期骨骼肌变化，研究结果显示糖尿病合并严重肢体缺血兔股外侧肌在第2、3周K^trans值较假手术组降低，实验组股外侧肌K^trans第3周较第1周降低，第3周外周血EPCs与K^trans呈正相关，基于K^trans的纹理参数MinIntensity、Quantile5和Quantile10与外周血EPCs、股外侧肌MVD有相关性。

       微血管渗透性是糖尿病合并严重肢体缺血骨骼肌早期病变病理生理机制之一^[6]。K^trans是指血管内对比剂扩散到血管外的速率，血管通透性越高对比剂扩散到血管外的速率越高，反映糖尿病严重下肢缺血骨骼肌微血管渗透性。本研究首次发现实验组内股外侧肌K^trans第3周较第1周降低，笔者认为这与骨骼肌形成的侧枝循环无法完全代偿所需微血管灌注所致。在第2、3周实验组K^trans较假手术组降低，显示K^trans可以评估糖尿病严重下肢缺血骨骼肌微血管渗透性病变。

       各种机制导致的骨髓造血干细胞来源的EPCs功能失调在糖尿病血管并发症中的作用尤为关键^[7,8]。本研究发现在第3周实验组外周血EPCs较假手术组减低，其可能机制为在高血脂、高血糖的环境下，促炎型巨噬细胞（M1型）释放IL-1β和IL-12等致炎细胞分子延缓糖尿病患者伤口的愈合，而抗炎型巨噬细胞（M2型）的功能被减弱，产生的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）减少，并减低了对内皮细胞的黏附力，导致EPCs迁移数量变少^[9,10]。本研究显示EPCs与K^trans呈正相关，提示外周血EPCs计数与微血管渗透性有相关性，有多项研究^[11,12]试图通过改善外周血EPCs血管生成能力及增加其数量改善具有后肢缺血的糖尿病大鼠的血管生成并增加血流量。实验第3周实验组MVD较假手术组增多，股动脉造影观察到骨骼肌侧枝循环形成，可能是在高血糖的环境下，缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1)α的水平及内皮细胞对其的活性反应虽然减低，但血管内皮细胞受损引起的缺氧可通过激活HIF-1 α相关途径来改善缺血后的血运重建过程^[13]。本研究首次发现在糖尿病引起的严重肢体缺血模型，基于DCE-MRI的定量微血管渗透性参数K^trans与MVD无相关性，其结果产生的病理生理机制可能是在高糖环境下血管内皮细胞对缺氧产生的VEGF不敏感，形成的新生血管较少，导致血管通透性极低，以至于不足以引起K^trans发生相应的改变，但另一个微血管渗透性参数Kep与MVD呈负相关性，因此糖尿病合并严重下肢缺血肌肉病变MVD影响了骨骼肌微血管渗透性。本研究中Ve在横向和纵向研究中均无明显差异(P>0.05)，笔者认为糖尿病合并下肢缺血是一个慢性代谢性疾病，本实验动物模型研究仅观察至造模成功后3周，Ve值可能尚未出现明显变化。上述实验结果显示，DCE-MRI微血管渗透性参数可以作为糖尿病合并严重下肢缺血骨骼肌病变严重程度的敏感的影像学生物标志物。

       MRI纹理分析是一种包含若干技术来量化图像强度或模式变化的新兴方法。当其应用于肌肉MRI时，则是一种评价肌肉病变分布格局细微差别的潜在工具^[14,15,16]。本研究首次发现MinIntensity、Quantile5、Quantile10、Maximum3D Diameter这4个纹理特征参数在兔糖尿病合并严重下肢缺血模型中诊断效能最高。MinIntensity、Quantile5、Quantile10属于直方图(Histogram)参数，描述总体纹理特征，即感兴趣区内的灰度频度分布情况，在第3周实验组MinIntensity、Quantile5、Quantile10值均低于假手术组。Maximum 3D Diamete属于灰度游程矩阵（gray-level run-length matrix，GLRLM）参数，可以依据体素排列灰度范围矩阵计算得出，反映区域内强度的变化或同质区域的分布情况^[17]。Maximum 3D Diameter增加，表明实验组K^trans图纹理的复杂程度及不规则性减低。本研究将MinIntensity、Quantile5、Quantile10、Maximum3D Diameter结合得出AUC值高达0.882，提示纹理分析可检验糖尿病合并严重下肢缺血骨骼肌微结构的变化。Skoch等^[14]通过MR图像的纹理特征评估区分正常人和糖尿病患者小腿肌肉，证实纹理分析可用于客观描述肉眼检查看不到的肌肉微结构变化。本研究发现造模成功后3周，实验组患肢股外侧肌MVD与纹理参数Quantile5、Quantile10呈负相关，外周血EPCs与MinIntensity、Quantile5、Quantile10呈正相关，说明纹理分析可以评估骨骼肌早期细微结构变化。

       本研究存在的不足：本实验是对兔糖尿病合并严重肢体缺血模型进行研究，与糖尿病合并下肢缺血患者的临床自然病程有所不同。本实验未作肌纤维平均横截面积及毛细血管数／肌纤维数等病理指标，后期实验将加以研究。本实验研究样本量较少，后续会进一步扩大样本量；ROI仅选取了大腿股外侧肌肌肉，不能完全反映下肢动脉供血区域肌肉纹理特征改变。

       综上所述，DCE-MRI渗透参数可反映肌肉微血管的渗透性，基于K^trans纹理分析参数可鉴别骨骼肌早期细微结构的变化，有利于医生第一时间发现和排查糖尿病是否合并严重肢体缺血，降低病患截肢率和致死率。