化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer，CEST)是高特异性的MRS与高空间分辨率的MRI高度结合的新兴成像技术。2000年，化学交换饱和转移现象被Ward等^[1]首次发现，其基本原理见图1，在成像过程中施加预饱和脉冲（radio frequency，RF）后被饱和的可交换氢质子与周围自由水分子中的氢质子进行化学交换，可导致自由水分子信号降低，继而通过检测自由水分子的信号变化，就可间接反映生物体内的目标分子浓度以及代谢相关功能分子水平生物学信息^[2,3]。CEST作为MR新兴成像方法的重要分支，在分子成像及各种代谢功能测定方面具有研究和应用潜力，主要包括pH值测定、酶活性测定^[4]、细胞活性测定^[5]、金属离子测定^[6]以及温度测定^[7]等，可用于脑缺血^[8]、神经紊乱^[9]、淋巴水肿^[10]、骨关节炎^[11]、肌肉生理学^[12]、实体肿瘤代谢^[13]等方面疾病的诊断及治疗疗效评估，具有临床应用价值。

       血流灌注不良、糖酵解反应等因素会导致实体肿瘤组织内乳酸的生成增多，肿瘤细胞膜上的氢离子转运蛋白异常表达，诱导细胞外酸化，最终表现为肿瘤酸性微环境异常，即肿瘤细胞外pH (pHe）梯度与正常组织相反^[14]。实体肿瘤的酸性微环境是导致肿瘤的增殖、转移、侵袭等恶性病理生理学行为以及放化疗抵抗的重要因素^{[15,16,17,18]}。因此，在体、无创、实时动态，并且精准地监测肿瘤细胞外pH (pHe）值能为肿瘤微环境相关的机制研究，为肿瘤诊断及治疗疗效监测提供全新的技术方法和分子功能水平评估手段。在CEST MR成像中，外源性引入的MR对比剂是成功实现pH值精准定量的必须前提、关键内容和技术核心^{[19,20,21,22]}。然而，实体肿瘤细胞外pH (pHe）值一般在6.5~7.2，在这个狭窄的pH值范围内，评估肿瘤细胞外酸性微环境存在巨大的挑战，因而对pH敏感CEST MR成像对比剂提出了更高的要求^[23]。本综述从基础研究及临床应用需求出发，对目前已研发的pH敏感CEST MR对比剂展开述评，讨论现有对比剂在本领域开展应用情况以及各自优缺点，以期为新型pH敏感CEST MR对比剂的设计、制备、研发及应用提供理论依据和数据支撑。

点击查看大图

图1  化学交换饱和转移原理：施加预饱和脉冲使溶质质子（蓝色）在特定共振频率处饱和（以酰胺质子为例：8.25 ppm)。饱和后的溶质质子以ksw的交换率与未饱和的水分子质子（黑色）进交换。经过一段时间(tsat)后，可观察到降低的水信号
Fig. 1  Chemical exchange saturation transfer (CEST) principles: Solute protons (blue) are saturated at their specific resonance frequency in the proton spectrum (here 8.25 ppm for amide protons). This saturation is transferred to water (4.75 ppm) at exchange rate ksw and nonsaturated protons (black) return. After a period (tsat）, this effect becomes visible on the water signal.

1　内源性pH敏感抗磁性CEST MR成像对比剂

       内源性抗磁性CEST MR成像对比剂（diaCESTagents，0~4 ppm）成像中与pH相关的酰胺质子转移（amide proton transfer，APT) CEST MR成像是通过检测组织内源性非结合蛋白和多肽上的酰胺质子的化学交换，从而反映生物学水平相关的问题。组织内源性酰胺质子的磁共振频率为3.5 ppm，离水峰较远，有利于选择性饱和；并且该质子具有较长的T1和T2弛豫时间常数，体内浓度为5.0~8.0 mmol/L，在CEST MR成像的信号积累和成像灵敏度的提高有绝对的优势^[24]。由于酰胺质子的缓慢化学交换率(35~60 Hz）使其可以被碱催化，即随着pH值的增高APT CEST信号增强。相反，氨基质子（磁共振频率2.75~3.0 ppm）的化学交换率快，可达数千赫兹，即随着pH值的增高APT CEST信号降低^[25]。有研究者利用酰胺和氨基氢质子的相反的pH敏感性特点，通过内源性胺和酰胺浓度-独立检测（amine and amide concentration-independent detection，AACID）法，即内源性酰胺质子和氨基质子CEST信号比值测定法评估了肿瘤pH值^[22]。肿瘤酸中毒主要影响细胞外的pH值，而内源性CEST测量则是细胞内外共同的pH值。因此，内源性pH敏感抗磁性CEST MR成像有助于酸性肿瘤的定位，但对肿瘤细胞外酸中毒检测并不敏感，不足以定量肿瘤细胞外的pH值^[26]。

2　外源性pH敏感抗磁性CEST MR成像对比剂

       为了改善内源性CEST MRI成像在肿瘤pH值测定中的不足，研究者提出酸性CEST MR成像（acidoCEST MRI)，它采用外源性对比剂来检测肿瘤细胞外的pH值。由于外源性抗磁性CEST MR成像对比剂(0~10 ppm）不能进入细胞内，可准确测定肿瘤细胞外的pH值。目前临床上广泛使用的X射线对比剂碘类对比剂因其独特的物理化学性质（高亲水性和惰性），具有极高的安全性，且具有可交换氢质子的酰胺基团，因此也被用于CEST MR成像。

2.1　碘帕醇

       碘帕醇在化学结构上存在含有活泼氢质子的酰胺基团(CEST信号峰分别在4.2 ppm和5.5 ppm）和羟基基团（CEST信号峰在1.8 ppm)。其中两个酰胺质子池的交换速率与溶液pH值相关，通过测定不同pH溶液的不同化学位移(4.2 ppm和5.5 ppm）的CEST信号峰比值，可获得较准确的生理范围内的pH值。在双侧肾脏的pH值测定中^[27]，利用碘帕醇在肾脏中的排泄及聚集，通过鼠尾静脉注射碘帕醇（碘：0.75 g/kg)后进行CEST MR成像，分别在两个化学非等效的酰胺质子池的共振频率(4.2 ppm和5.5 ppm）处获得ST％图谱，进而用比值测定法得到小鼠双侧肾脏的pH图。即便碘帕醇的T1和T2值随pH值和浓度变化很大，在4.7 T磁场环境下仍能以0.1单位的精度测量6.0~7.5的pH值^[28]。碘帕醇pH值测定的准确性在肺纤维化小鼠模型中也得到了证实。在该研究中，通过设计一种CEST MR成像专用的呼吸门控方案，测定了肺损伤引起的细胞外pH (pHe）变化^[29]。

2.2　碘比醇以及其他碘类对比剂

       上述碘帕醇通过比值测定法测定两个非等效酰胺基可交换氢质子池的CEST信号比值实现pH值测定^[1]，但是只有少数的CEST MR成像对比剂^{[30,31,32,33,34,35,36]}满足这个条件。此外，这种方法的一个基本要求是两个CEST信号峰共振频率之间要有一定的化学位移差异，这种差异必须足够大才有利于施加选择性预饱和脉冲。Longo等^[21]研究表明，质子交换率依赖射频预饱和脉冲(B1)功率，因此，比值测定法也可适用于只有一种可交换氢质子的分子。该研究中应用只有一种可交换氢质子的碘类对比剂碘比醇（图2A)，选择性施加不同功率的射频脉冲(1.5/6 μT)，用比值测定法得到不同脉冲功率下的CEST信号比值以检测感兴趣区域的pH值（图2B、图2C)。这种比值测定法在pH值测量以及非浓度相关性方面，与碘帕醇或碘普罗胺相比具有更高的灵敏度和准确性。此外，碘比醇的可交换活泼氢质子与自由水之间的化学位移差(5.6 ppm）远大于含有两个可交换活泼氢质子基团之间的化学位移差(1.2 ppm，碘帕醇）。因此，碘比醇在较低场强下具有更大的应用优势，同时为其他只有一种可交换氢质子的CEST MR成像对比剂的设计、制备、研发及应用提供了理论依据和数据支撑。但两种饱和功率的比值测定法需要获取两组CEST MR成像图像，这将会延长扫描总时间，因此可能会对其临床转化带来不便。

       其他碘类对比剂有碘氟醇、碘普罗胺、碘美普尔、碘海醇以及碘克沙醇等，它们在4.3 ppm或5.6 ppm处也有CEST信号峰^[21,37]。临床上使用的X射线碘类对比剂在CEST MRI pH测定方面突显了其应用潜力。主要有以下几个原因：(1)化学结构包含可交换氢质子的酰胺质子，并且其4.0~6.0的共振频率即便在3.0 T低场强下也有应用优势；(2) pH敏感CEST MR成像碘类对比剂，通过比值测定法可以实现肿瘤细胞外pH值的测定；(3) FDA批准的非离子型显影剂，渗透性接近血浆，毒副反应小，生物安全性大，肌体的耐受性好，有望成为临床pH敏感CEST MR成像对比剂。但仍存在一些问题，如排泄快、肿瘤组织中滞留率低、对CEST MR成像时间窗要求高^[38]以及少部分患者出现的恶心、呕吐和荨麻疹等不良反应^[39]。

点击查看大图

图2  A：碘比醇化学结构。B：碘比醇不同饱和脉冲功率下的ST％以及RPM曲线，7 T, 310 K。C：小鼠T2加权解剖相以及不同饱和脉冲功率MRI-CEST图、pH图
Fig. 2  A: Iobitridol chemical structure. B: Iobitridol MRI-CEST contrast (ST%) at three representative RF saturation powers at 7 T, 310 K and RPM curves provide pH-sensitive measurements. C: T2WI anatomical image; CEST contrast difference map at 1.5 μT and at 6 μT; corresponding pH map. Reproduced with permission copyright © 2014, J Am Chem Soc.

2.3　其他pH敏感性抗磁性CEST对比剂

       Yang团队^[40]报道的CEST MR成像对比剂咪唑-4-5-二羧基酰胺(I45DCs)化学位移达9 ppm，表现出了良好的pH敏感性。但迄今为止，仅被用于测量肾脏的pH值，尚未报导用于测量肿瘤的pH值。近年来，学者们还发现了水杨酸和邻氨基苯甲酸的衍生物的pH敏感性^[41,42]，这些新兴的CEST MR成像对比剂具有较大的共振频率（约12 ppm)，有利于低场强下CEST信号的获得。此外，超微小尺寸的NaGdF4@PLL纳米点（Nanodots，NDs)也被研发为一种新型pH敏感性MR成像对比剂，化学位移3.7 ppm处有pH敏感性CEST信号峰，同时具有良好的T1对比效果[6.42 mmol/(L•s)]^[43]，但NaGdF4@PLL纳米点未能提供感兴趣区域的准确pH值。

3　外源性pH敏感顺磁性CEST MR成像对比剂

       抗磁性CEST MR成像对比剂的主要不足之处是化学位移较小，在低场强下敏感性较低。顺磁性CEST MR成像对比剂（paramagnetic CEST contrast agents，ParaCEST agents)，如镧系金属复合物或其他金属阳离子复合物，其特性是化学位移离水峰较远^[44]，且在配位水分子或靠近配位金属阳离子的化学基团上存在pH敏感性的可交换氢质子。为了探索顺磁性CEST MR成像对比剂的pH敏感性，很多学者研究镧系元素(Ln=Eu，Dy，Ho，Er，Tm，Yb）与大环DOTAM-Gly配体的复合物^[45](图3A)。这些复合物有两组不同共振频率的可交换氢质子，分别为pH敏感性酰胺类氢质子和直接金属配位的水分子。在这些含有镧系元素的复合物中，Yb-DOTAM-Gly在pH值5.5~8.1范围内敏感性最高。然而，如果想实现非浓度相关的pH值测量，需要使用Eu-DOTAM-Gly和Yb-DOTAM-Gly两种复合物的混合物来建立比值测定法。但由于两种复合物不同的药代动力学以及生物学分布，不能同时混合注射。因此，这种方法在体内尚未得到验证。为了解决这一问题，Delli Castelli等^[46]提出了基于同一分子中酰胺基（pH敏感)和水（pH不敏感）的饱和转移比值测定方法。Yb³⁺-HPDO3A复合物由于存在两个平衡的非对映异构体^[34](图3B)，在其顺磁中心附近的同一个羟基有不同的共振频率(77 ppm和91 ppm)，可用于比值测定法测定pH值。在7.0 T磁场强度下，其pH敏感范围在6.5~8.0，且在小鼠黑色素瘤肿瘤细胞外pH值测定中得到了验证^[32]。pH敏感性Tm³⁺-HPDO3A复合物由于具有两个非对映异构体羟基氢质子，分别在71 ppm和185 ppm处有共振峰，研究表明在较低场强下(～1.0 T)仍可以实现pH值测定^[47]（图3B)。Pagel的团队报道的Yb³⁺DO3A-oAA复合物，通过瘤内注射也得到了肿瘤细胞外的pH值，Yb³⁺DO3A-oAA复合物具有两组酰胺基和芳基胺的可交换氢质子，其与近端羧酸盐配体形成的分子内氢键可降低氨基氢质子交换速率，从而可以产生第二个CEST信号^[48] (图3C)。Sherry和同事开发了一种以铕(europium，Eu）为基础的对比剂，由于酚残基的去质子化所产生的负电子的离域，该对比剂中与金属配位的水分子的共振频率受环境pH值的影响。例如，pH值由6.0变化到7.6时（温度298 K)，配位水分子的氢质子共振频率从50.5 ppm变为54.5 ppm。在9.4 T MRI设备上，通过检测配位水分子的CEST信号共振频率即可估测待检测样本的pH值，而不需要比值测定方法^[49](图3D)。但目前还没有被证实用于测量肿瘤pHe。另一种方法是利用非交换氢质子获得pHe图，这种方法被称为"冗余位移生物传感器成像"(biosensor imaging of redundant deviation in shifts，BIRDS)，它利用大环螯合物与顺磁性金属镧系离子的非交换质子的位移来生成pHe图^[50]（图3E)。BIRDS方法的最新应用是使用TmDOTP-来研究大鼠两种胶质瘤模型中肿瘤的pHe差异，在侵袭性更强的肿瘤中，肿瘤pHe值显示更酸^[51]。但该方法的缺陷是为了使对比剂在肿瘤内富集，需要肾结扎术来阻止药物的通过肾脏清除。此外，只有在非常高的磁场（11.7 T)条件下才能检测到较小的位移。Aime研究团队将顺磁性钆(Ⅲ）复合物加载到脂质体中，其弛豫特性也受到溶液pH值的影响。在这个体系中，两亲性金属螯合物的螯合基团的质子化可改变金属螯合物的配位性质，在不同的pH环境下在脂质体内具有不同分布特性，根据这一特性可测定溶液pH值^[52] （图3F)。

       顺磁性CEST MR成像对比剂与抗磁性CEST MR成像对比剂相比，灵敏度更高，且不受水分子的直接饱和作用的影响，也不受内源性半固体蛋白成分的CEST信号影响。但是，为获得感兴趣区域较准确的CEST信号，需要注射足够大的浓度，因此其生物安全性还需要进一步验证。除此之外，为了饱和较大化学位移的可交换氢质子，需要给予高强度的射频预饱和脉冲功率。所以，该CEST MR成像对比剂离临床转化还有一定的距离。

点击查看大图

图3  pH敏感顺磁性CEST MR成像对比剂的化学结构。A：Ln-DOTAM-Gly^[41]，B：Ln-HPDO3A^[32,44]，C：Yb-DO3A-oAA^[45]，D：Eu³⁺ complex^[46]，E：Ln-DOTA-4AmP8^[47]，F：Gd-DO3Asa^[49]
Fig. 3  Chemical structures of paraCEST MRI contrast agents used for measuring pH. A: Ln-DOTAM-Gly^[41], B: Ln-HPDO3A^[32,44], C: Yb-DO3A-oAA^[45], D: Eu³⁺ complex^[46], E: Ln-DOTA-4AmP8^[47], F: Gd-DO3Asa^[49].

4　小结与展望

       从开始研究CEST MR成像至今的短短20年间，CEST MR成像迅速发展成为MRI的重要方法之一。而CEST MR成像中关于组织pH值的监测是当今CEST MR成像研究的热点及难点。因组织pH值变化与炎症、缺血、癌症和肾脏疾病等多种疾病的病理改变相关，从而病变区域pH值被认为是潜在的生物学标志。至今，已有许多关于监测肿瘤细胞外pH值的研究，也有不少新的成像方法和技术被研究者提出。其中CESTMR成像技术因其高pH敏感性、高空间分辨率在测定组织或肿瘤区域的pH值方面具有独到的优势。CEST MR成像的pH值测定准确性取决于磁场条件、扫描序列、数据处理方法等，但其核心是所使用的pH敏感CEST MR成像对比剂的灵敏度、高效性以及安全性。其中外源性抗磁性pH敏感CEST MR成像碘类对比剂最有望成为该成像技术临床使用对比剂，并为评估肿瘤生物学行为、反映肿瘤酸中毒与侵袭性之间的关系以及监测抗癌治疗疗效提供新的成像方案。与此同时，一些技术问题如磁场条件、磁场受干扰因素、时间分辨率以及临床转化等问题也随着这一成像技术的发展而被研究者们提出。笔者认为继续开发更有效的CEST MR成像方法、提高所使用CEST MR成像对比剂的特异性以及采用qCEST等先进的分析方法剔除磁场或组织内源性干扰因素可以改善这种成像技术以达到临床所需的优质水平。相信在不久的将来，CEST MR成像无创性检测肿瘤细胞外pH值有望为临床众多肿瘤患者提供更高的应用价值。