磁共振成像在脑血管性疾病的诊断和预后评价上具有其他成像方式无法比拟的优势。弥散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI）对细胞毒性水肿极其敏感^[1]，而血管源性水肿则反映在T2WI上，影像半暗带可由DWI/T2WI不匹配区域所定义，同一层面上DWI和T2WI均为高信号的区域定义为梗死区^[2,3]。影像半暗带具有重要的临床指导意义，根据T2-液体衰减反转恢复序列（fluidattenuated inversion recovery，FLAIR）和DWI不匹配征象可识别发病时间小于4.5 h的缺血性脑卒中患者^[4]。

       缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）指轻度的缺血预刺激能够使靶器官拮抗后续强烈的缺血损伤，这种诱导性保护作用如果发生在不同的远隔器官之间，则称为远端缺血预处理（remote ischemic preconditioning，RPC)。肢体远端缺血预处理(limb remote ischemic preconditioning，LRP）则是目前最常用的预处理方法之一^[5]，LRP具有明确的缺血保护作用^[6,7,8,9,10]，本次研究在前期工作基础上^[11]对LRP预处理后影像半暗带上的改变做进一步统计和分析。此外，HMGB1作为一种至关重要的促炎症因子，可以作为脑梗死的治疗靶点^[12]，因此本次研究对HMGB1的表达和转录进行检测，以初步探讨LRP的神经保护作用是否能够通过调节HMGB1来实现。

1　材料与方法

1.1　动物及分组

       成年清洁级（许可证号：SCXK（沪）2007-0005）雄性SD大鼠（260 ～330 g，2.5~3.0月龄) 63只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，随机分为三组：(1)缺血组29只，根据脑水肿的发生、半暗带的存在时间窗设计检测时间点：1、3、6和24 h，完成这些时间点的MRI检测，保证每个时间点有5只以上的数据用于统计分析，其中24只大鼠在完成MRI后用于提取脑组织匀浆和RNA用于检测对应时间点（1，3，6，24 h)的蛋白表达和基因转录，5只用于24 h的TTC (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）染色用于检测最终梗死面积。(2) LRP组29只，具体分组情况同组（1)。(3）假手术组5只，假手术大鼠标本用于作为Western Blot的对照以及PCR定量的参照标本。大鼠饲养于专用动物房内，环境保持清洁，室内温度20~25℃，室内湿度50%～60%。本研究已经过医院伦理委员会审查，审查编号（2018-A19)。

1.2　大鼠脑缺血模型的制作及LRP方法[9,11,13,14,15]

       大鼠在模型制作前24 h停止供食但仍正常给水。大鼠麻醉应用异氟烷进行气体麻醉：初始麻醉诱导流量为5%，维持流量为2%～3%。手术全程应用恒温垫将大鼠体温维持在（37±2)℃。缺血组大鼠建模方法：(1)为排除下肢切口对实验的影响，脑缺血组大鼠先进行右下肢股动脉暴露90 min，而后缝合伤口；(2)沿着正中线切开大鼠颈部皮肤，分别分离出右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，将预先浸泡过2％肝素的线栓（直径0.26 mm）自颈外动脉近端近分叉处插入至线栓标记线处，1 h后将线栓拔出，缝合切口。LRP预处理方法参照Landman等^[9]所述，先分离右下肢股动脉，用动脉夹将股动脉夹闭15 min，松开动脉夹恢复后，再灌注15 min，反复操作3个循环，而后进行脑缺血建模（方法同前）。应用激光多普勒血流仪监测大鼠脑血流灌注，以保证建模的有效性，脑血流量下降至75％以上为建模有效。需保证最终成模的大鼠数量达到以上的分组要求。假手术组只进行相同的外科操作而不进行任何血管夹闭。

1.3　MRI检测及数据分析

       采集大鼠建模后1、3、6、24 h的MRI数据，所用MRI场强为3.0 T (GE，Discovery MR 750)，所用线圈为小动物专用四通道线圈（WK602，Magtron Inc)，采集T2-FLAIR、DWI图像。大鼠俯卧，采集冠状位图像，中心点为大脑中央，扫描基线垂直于前脑尖端与中心点连线。T2-FLAIR参数：TR 8450 ms，TE 145 ms，FOV 10 cm×10 cm，矩阵256×256，回波链32，翻转角111°，带宽62.5 kHZ，层厚2 mm，间隔0 mm，10层。DWI (b=1000 s/mm²）参数：TR 3000 ms，TE 83.7 ms，FOV 10 cm×10 cm，矩阵128×128，带宽166.7 kHZ，层厚2 mm，间隔0 mm，10层。由1名经验丰富的高年资影像医生分别在T2-FLAIR和DWI上勾画出高信号区并记录面积，重复测量2次，取两次平均值。参考刘丽梅等^[3]方法，将1 h、3 h、12 h、24 h DWI上呈高信号，而相应时间点相同层面上T2FLARI呈正常信号的区域定义为影像半暗带（graphic penumbra)，测量各组影像半暗带的大小，计算公式如下。

       △半暗带＝SDWI/S1-ST2/S2

       其中S1为DWI序列健侧脑面积，S2为T2FLAIR序列健侧脑面积。

1.4　梗死体积的测量

       大鼠建模完成后24 h，行10％水合氯醛腹腔注射麻醉后将四肢固定，用100 ml 4℃预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS)(pH7.4）进行心脏灌注置换血液后，快速断头、取脑，置于-20℃冰箱速冻20 min后置于切片模具内自额叶由前向后作冠状切片（间隔2 mm)，共计切片5片；切片当即放入2%TTC染液37℃孵育30 min，4％多聚甲醛固定过夜；相机拍照后用于梗死面积测量。应用Image pro plus图像分析软件(Version 6.0，Media Cybernetics）对5张TTC染片扫描图像描边采集，分别测量患侧梗死总面积及健侧半脑面积，结果以梗死总面积／健侧半脑面积的百分比表示，单只大鼠每个层面重复测量三次，取平均值后代入公式计算。

1.5　行为学评分

       LRP组和脑缺血组大鼠建模24 h后进行行为学评分，采用5级4分法^[16]评分：无任何神经功能缺损症状记为0分；轻微神经功能缺损（如大鼠被提尾悬空时出现病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直)记为1分；中度局灶性神经功能缺损（出现向瘫痪侧旋转征象）记为2分；重度局灶性神经功能缺损（出现向病灶对侧跌倒的征象）记为3分；无自发活动及意识水平下降记为4分。

1.6　Western Blot

       10％水合氯醛腹腔内注射(300 mg/kg)麻醉大鼠后，4℃预冷的PBS缓冲液行心脏灌注冲洗，快速冰上断头取脑，分离出左右半脑，加入常规的放射免疫学沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液研磨，匀浆，离心收集蛋白样品。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA）法对蛋白进行定量。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）一聚丙烯酰胺凝胶电泳后转聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。经漂洗和封闭后，加入兔抗大鼠HMGB1抗体（1︰1000；Abcam Inc，AB18256）抗体孵育，内参为兔抗大鼠β-actin (1︰1000 ；immunoway，YT0099)，加入辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（北京中杉，ZB-2301)，加入底物显影后，经凝胶成像系统显像（chemidoc MP，Bio-rad）进行灰度统计分析。

1.7　荧光定量PCR

       10％水合氯醛腹腔内注射（300 mg/kg)麻醉大鼠后，快速取脑，入液氮研磨，采用Trizol法提取RNA。PCR步骤参照QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit (Qiagen）说明书进行，在StepOne Plus荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上实现PCR定量检测。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HMGB1F ：TTGTCCACACACCCTGCATA，HMGB1R ：AATTGATCACTCCTTGCTTTGCT。利用各组2^-ΔΔCt进行数据处理分析，获得LRP组及脑缺血模型组相对于sham组的定量。

1.8　统计分析

       所有结果均以±s表示，应用SPSS 22.0进行方差分析。本次所分析数据均为计量资料。LRP组与脑缺血组之间梗死面积、行为学之间的比较采用独立样本t检验；sham组、LRP组与脑缺血组三组之间的HMGB1蛋白及PCR定量比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.1　LRP诱导后脑梗死灶缩小

       针对缺血性脑卒中模型，LRP具有明确的神经保护作用，表现在脑缺血模型大鼠的脑梗死体积的缩小(68.04±13.24与29.02±23.62，P<0.001)（图1)。

点击查看大图

图1  TTC染色结果比较。A：黑色框内为梗死灶；B：两组病灶总面积/健侧半脑总面积的比例对比。n1=n2＝5；**＊：表示相对缺血组，P<0.001
图2  LRP能够改善神经行为学评分。n1=n2=25；***：表示相对缺血组，P<0.001
图3  LRP显著减小脑缺血病灶，并延长影像半暗带的存在时间
Fig. 1  Comparison of TTC staining. A: Infarcts were shown with black frame. B: The ratio of total lesion area to the healthy hemisphere area was compared between the two groups. n1=n2=5. ***: P<0.001, vs. ischemia group.
Fig. 2  LRP improved neurological behavior. n1=n2=25. ***: P<0.001, vs. ischemia group.
Fig. 3  LRP significantly reduced the lesion induced by cerebral ischemia and prolonged the existent time window of graphic penumbra.

2.2　LRP改善脑缺血后神经行为学评分

       脑缺血模型组大鼠具有较高的行为学评分2.60± 0.65 (25只），LRP组大鼠的行为学评分仅1.52±0.65 (25只），较脑缺血模型组明显减轻(P<0.001)(图2)。

2.3　LRP能够延长影像半暗带的存在时间

2.3.1　T2-FLAIR及DWI图像展示

       如图3所示，在1 h的检测点，脑缺血组出现了DWI高信号，LRP组大鼠在缺血后6 h才出现DWI高信号。在6 h检测点上，脑缺血组大鼠T2-FLAIR上的病灶范围与DWI上的基本一致，但在LRP组，DWI上的病灶范围依然大于T2-FLAIR上的病灶（图3；表1)。

点击查看表格

表1  两组大鼠T2-FLAIR及DWI图像上的病灶体积比较(±s)
Tab. 1  Comparison of lesion volume on T2-FLAIR and DWI images between two groups (±s)

2.3.2　影像半暗带测量结果

       29只脑缺血组大鼠均在1 h时间点就出现DWI病灶（1.00±0.00) h，而LRP组有20只大鼠在3 h出现DWI病灶，余下9只大鼠在6 h才出现，平均时间为(3.93± 1.41) h，明显延迟于脑缺血模型组(t=11.18，P<0.001)。T2FLAIR序列上，脑缺血模型组有20只在3 h时间点上出现肉眼可见的高信号，余下9只在6 h出现病灶，平均时间为：(3.93±1.41) h；LRP组大鼠只有6只在3 h出现病灶，余下23只大鼠在6 h才出现，平均时间为(5.38±1.24) h，较脑缺血模型组明显延迟(t=4.15，P<0.001)。

       如表2、图4所示，在缺血后1 h和3 h，LRP组由于在DWI及T2-FLAIR上无病灶或病灶很小，所显示的影像半暗带明显小于脑缺血组(P<0.001)。随着时间的延长，缺血模型组T2-FLAIR上梗死病灶面积迅速扩大，至6 h已基本接近DWI，影像半暗带迅速缩小，至24 h已基本消失，但LRP组此时仍然存在着影像半暗带（图4)，明显大于脑缺血组(P<0.001)。

点击查看大图

图4  两组大鼠影像半暗带变化趋势的比较
图5  HMGB1的Western blot及PCR结果。HMGB1蛋白在缺血后表达升高(A)，在LRP组表达被抑制（B)，C为PCR结果。＃：表示相对sham组，P<0.05；##：表示相对sham组，P<0.01；###：表示相对sham组，P<0.001；*：表示相对缺血组，P<0.05；**：表示相对缺血组，P<0.05；***：表示相对缺血组，P<0.05；n=3/组
Fig. 4  Comparison of change trend of graphic penumbra between two groups.
Fig. 5  Western blot and PCR results of HMGB1. HMGB1 protein expression was increased after ischemia (A), and inhibited by LRP (B). C showed the PCR results. #: vs. sham, P<0.05. ##: vs. sham, P<0.01. ###: vs. sham, P<0.001. *: vs. ishcmia, P<0.05. **: vs. ishcmia, P<0.05. ***: vs. ishcmia, P<0.05. n=3/group.

点击查看表格

表2  两组大鼠影像半暗带的变化比较(±s)
Tab. 2  Comparison of image penumbra between two groups (±s)

2.4　LRP抑制缺血后HMGB1的表达

       Western blot结果显示脑缺血组和LRP组大鼠的HMGB1表达水平均较sham组明显升高(P<0.01)。脑缺血模型HMGB1的蛋白表达量在缺血后随着时间延长而增高，经过LRP后，HMGB1的表达受到抑制（图5A、B)，其中在1 h和24 h具有统计学差异(P<0.05)。荧光定量PCR结果显示LRP组和脑缺血组大鼠的HMGB1转录水平均较sham组不同程度升高，在脑缺血模型大鼠中以24 h为著，1 h次之；LRP组缺血后1 h、24 h的HMGB1转录水平均较脑缺血模型组降低，以1 h为著，具有统计学差异(P<0.01)，但在6 h时间点，LRP组转录水平较脑缺血模型组升高(P<0.05)。

3　讨论

       LRP具有明显的拮抗脑缺血的神经保护作用，课题组前期已证实了LRP能够延缓脑缺血大鼠DWI上病灶的出现^[11]，此次研究中，我们进一步对LRP对脑缺血大鼠影像半暗带的影响进行了分析，并且检测LRP诱导后HMGB1蛋白表达和转录水平的动态变化。

       LRP能够延缓病灶的出现，延长脑卒中的治疗时间窗，最终减小梗死面积并且明显改善行为学缺陷，该结果再一次证实了LRP的巨大潜在临床价值。目前已有不少研究将RPC扩展到人体临床应用上，并且得到了肯定的结果^[17]。在本次研究中采用的预处理方式参考Landman等^[9]的研究，这种预处理方法已在许多动物实验中应用，但对于人体中RPC的诱导方式和时间窗仍需要大量的研究确定。本次研究结果显示LRP能够延长影像半暗带的存在时间，在临床工作中，T2-FLAIR/DWI不匹配对判定脑梗死患者的发病时间窗具有重要诊断价值^[18]，它是指导临床进行溶栓治疗的可靠指针^[19]，由此表明LRP能够延长治疗时间窗，使脑梗死患者拥有更多的治疗时间。但同时，预处理作为一种干预方式，它与后续的其他治疗方式如溶栓治疗之间能不能协作、如何协作等等，均是在实现其临床应用前需要明确的问题。

       尽管目前LRP被证实具有明确的缺血保护作用，但脑梗死的发生具有不可预测性，想要促进LRP的临床转化，首先需要全面了解其发挥神经保护作用的核心机制，除此之外，如何拓展LRP的临床应用也是需要研究者进一步探讨的问题，现今已有临床研究将LRP应用于手术前的缺血预防，这是LRP实现临床应用的一大进步。针对心肌缺血再灌注损伤，远端缺血处理的保护作用被证实具有双时相性：缺血早期2~4 h^[20,21]以及缺血后24 h^[22,23]，但在中枢神经系统中，缺血预处理是否具有同样的双相时间窗尚不明确，MRI显像尽管能够显示病灶的动态演变，但对内在"因"的研究仍需要微观分子机制进行阐述。本次实验结果提示LRP能够延长半暗带的时间窗，说明LRP能够延缓核心坏死区的进展，而炎症则是该进程中至关重要的机制，因此我们选择检测参与调控细胞存活与死亡的炎性核心因子HMGB1。HMGB1能够调节NF-κB、p53等转录因子，通过与包括RAGE、TLR2/4在内的多种受体的结合而激活多条信号转导通路^[24]，介导多种炎性介质的释放调控机体固有免疫应答，同时还参与调控细胞免疫应答^[25]。我们的结果显示脑缺血后HMGB1的蛋白表达及转录水平均明显增高，这与之前的研究结果一致^[26]，而LRP则能够抑制缺血后HMGB1的表达和转录，并且在不同的时间点有所差别，该结果不仅提示LRP能够通过调控HMGB1从而抑制缺血导致的炎性损伤，同时也提示LRP的神经保护作用也可能存在时相期，早期和晚期的保护机制不全相同。

       在此次研究中，我们只检测了HMGB1的蛋白表达和基因转录水平，仅做了最初步的探讨，LRP对HMGB1下游转录因子产生怎样的影响，LRP对HMGB1活化水平的影响等，这些问题均亟待解决，在今后工作中仍需要更加深入地进行拓展和研究。