膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以关节软骨破坏为主要病理表现，以进行性关节疼痛、功能受限为临床特征的慢性疼痛性疾病^[1]。KOA好发于中老年人，具有高发病率和高致残率的特点。流行病学调查显示，截止2018年，我国成人KOA总患病率约为15%，年龄大于60岁者达50%，大于75岁者则高达80%^[2]。随着全球人口老龄化的加剧，到2040年在亚洲65岁以上KOA的患病率估计增长为现在的两倍^[3]，患者生活质量和生产力的下降造成了严重的个人和社会负担。目前还没有获批准的能减缓KOA病情相关的结构进展的疗法，因此，保守治疗的主要目标是提供症状缓解、改善关节功能，并推迟手术干预。KOA的药物治疗，如一线非甾体抗炎药^[4]，关节腔内药物注射从皮质类固醇到透明质酸和生物制品，虽均能短期内缓解疼痛改善KOA患者症状，但长期或频繁使用具有明显的副作用^[5]。臭氧水关节腔冲洗配合穴位注射治疗KOA能明显减轻患者的疼痛，改善患者的关节功能，具有临床疗效确切、安全可靠的特点^[6]。与其他药物相比，臭氧水疗法能明显改善KOA患者的预后、且无毒副作用，引起了越来越多医疗工作者的广泛关注。臭氧水疗法以其显著的临床疗效和安全优势在国内部分地区得到推广并受到了患者的一致认可，但是由于臭氧水对KOA患者镇痛作用的中枢机制尚不明确，严重限制着臭氧水疗法在临床上更广泛的推广应用。

       静息态功能磁共振成像(resting state functional magnetic resonance imaging， rs-fMRI)因其具备分辨率高、无创伤、无辐射等优点被广泛用于研究慢性疼痛的中枢机制^{[7, 8]}，也为臭氧水对KOA镇痛作用机制的研究提供了新的技术手段。本研究选用臭氧水疗法的优势病种KOA作为研究对象，采用fMRI技术提取KOA患者脑功能变化特征，同时运用ReHo分析方法研究KOA患者臭氧水治疗前后的脑功能变化，探讨臭氧水治疗KOA镇痛作用的中枢调节机制，为臭氧水治疗KOA的临床镇痛效应寻找理论依据。

1　材料与方法

1.1　一般资料

       收集2018年6月至2019年10月来河南中医药大学第三附属医院就诊的膝骨性关节炎患者18例。所有的患者均处于膝关节慢性疼痛发作期。采用臭氧水治疗前后自身对照的原则。本研究通过河南中医药大学第三附属医院伦理委员会批准，所有被试均被告知相关事项并签署知情同意书。

       纳入标准：(1)符合膝骨性关节炎患者的中、西医诊断标准；(2)年龄40～70周岁，右利手；(3)患者入组前1个月内未接受规律治疗；(4)膝关节疼痛持续或反复发作的时间超过3个月；(5) VAS评分≥4分；(6)无镇痛药物、烟、酒等长期使用或成瘾史；(7)患者本人签署或者直系家属代签知情同意书。

       排除标准：(1)合并有其他风湿类、骨关节炎类等伴有疼痛症状的疾病；(2)关节内骨折急性期及患肢有血管神经损伤史者；(3)合并有严重心脑血管疾病、肝肾疾病、血液系统疾病及恶性肿瘤患者；(4)膝关节周围皮肤有破损者；(5)膝关节严重内翻、外翻畸形及关节腔消失者；(6)妊娠或哺乳期妇女；(7)过敏体质及臭氧水过敏者；(8)有MRI检查禁忌者；(9)伴有焦虑、抑郁等精神、神经类病患者；(10)在扫描中发现患者头颅有明确病变或者头颅解剖结构严重不对称。

1.2　研究设备及材料

       德国西门子3.0 T磁共振成像设备；医用臭氧水制备仪(济南三氧科技有限公司制造，SYZ-80A)；3M 1100子弹型防噪耳塞；10 ml和60 ml注射器；无菌手套。

1.3　治疗方案

       患者仰卧位，膝下垫枕，髋关节外展外旋，膝关节屈曲135～145º。由助手进行常规消毒后，操作者戴无菌手套，铺无菌洞巾。以KP1为穿刺点。10 ml注射器抽取1％和0.9% NaCl注射液各1 ml作为穿刺液，于KP1处穿刺进针，皮下注射局麻药后，继续进针，当针尖有落空感时，提示进入关节腔。由助手持60 ml注射器从臭氧水制备仪中抽取20 μg/ml的臭氧水，缓慢注入关节腔。尽量使臭氧水充满整个关节腔隙，患者自觉有明显憋胀感时，将臭氧水全部抽出。反复冲洗3遍。KP1 (knee point 1)定位：以右膝为例，髌底中点为12点，顺时针方向于1点半处定为穿刺点，将其命名为KP1 (图1)。每周治疗1次，共治疗3次。

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图1  KP1点定位
图2  KOA患者臭氧水治疗前后VAS评分变化
Fig. 1  Point positioning of KP1.
Fig. 2  Changes in VAS scores of KOA patients before and after ozone-water treatment.

1.4　静息态fMRI扫描

       分别对每个受试者在治疗前和治疗3周后进行结构像和静息态磁共振扫描。扫描前，佩戴头套固定以防止头动，隔音耳塞以排除噪声干扰。扫描过程中，要求患者保持清醒，睁眼，尽量不进行任何思维活动。扫描参数设置见表1。

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表1  fMRI成像的扫描参数设置
Tab. 1  Scanning parameter settings of fMRI imaging

1.5　观察指标

       疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)：分别于治疗前后采用VAS评分对患者膝关节疼痛程度进行评价。VAS评分由一条100 mm的水平线组成，最左边写着“没有疼痛”，最右边写着“可能最严重的疼痛”。要求患者在这条线上做一个垂直标记，以显示最能代表他们在过去一段时间所经历的疼痛的位置。

       0 mm：没有疼痛；10～30 mm：轻度疼痛(疼痛不影响工作及生活)；40～60 mm：中度疼痛(影响工作及生活)；70～90 mm：重度疼痛(影响睡眠，甚至不能入睡或者睡眠中痛醒)；100 mm：可能最严重的疼痛，无法忍受。

1.6　数据处理

       采用DPARSF (Data Processing Assistant for Resting-State fMRI) 软件包进行数据预处理。步骤如下：(1)去除时间点数据：剔除最初10个时间点的数据图像；(2)消除间隔扫描导致的时间相位差进行时间校正；(3)头动校正；(4)空间标准化；(5)空间平滑：降低空间噪音，提高信噪比，消除受试者脑结构间差异的目的；(6)去线性漂移：降低因机器工作升温或者受试者适应带来的基线漂移；(7)滤波：对所有信号进行低频滤波(0.01 Hz＜f＜0.08 Hz)处理，去除如心跳、呼吸等低频噪声和磁共振扫描仪自身的高频噪声对受试图像的影响。

       ReHo分析：对预处理后的fMRI数据进行线性漂移和滤波处理。为保证标准化，将单个元素的ReHo值除以总的脑ReHo值的平均值。最后，采用高斯平滑来降低空间标准化过程中产生的空间噪声和误差。在最终的空间图像中，每个单独元素的对应值反映了该区域大脑功能活动的标准化的ReHo程度，然后对标准化的ReHo图进行统计学分析。

1.7　统计学分析

       临床疗效指标使用SPSS 25.0进行数据统计分析，计量资料若符合正态分布，组内比较采用配对ｔ检验；不符合正态分布或方差齐的计量资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。使用REST工具软件进行高斯随机校正的磁共振数据集分析结果(单个个体P＜0.01，连续体素值P＜0.05，蒙特利尔神经科学研究所坐标Z＞2.326)符合校正后的P＜0.05被定义为有统计学意义。最后得出臭氧水治疗前后KOA患者有显著差异脑区ReHo值，并将ReHo值的变化与VAS评分变化进行Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　VAS评分

       18例KOA患者臭氧水治疗前后的VAS评分进行统计分析，结果显示，与治疗前相比，KOA患者VAS评分显著降低(P=0.000)，说明臭氧水能明显减轻KOA患者的疼痛症状(表2；图2)

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表2  KOA患者臭氧水治疗前、后的VAS评分比较
Tab. 2  Comparison of VAS scores of KOA patients before and after ozone-water treatment

2.2　KOA患者臭氧水治疗前后ReHo值变化

       与臭氧水治疗前相比，KOA患者大脑右侧枕上回、右侧枕中回、右侧楔叶、右侧角回ReHo值增高；右侧中央沟盖、右侧岛叶、右侧颞上回、右侧颞横回、右中央前回、左侧补充运动区、右侧补充运动区ReHo值降低(表3；图3)。

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图3  KOA患者治疗前后ReHo图变化。暖色区域代表ReHo值增高，冷色区域代表ReHo值降低
Fig. 3  Changes of ReHo before and after treatment in KOA patients. Warm areas represent increased ReHo values and cool areas represent decreased ReHo values.

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表3  KOA患者臭氧水治疗前后ReHo变化(18例)
Tab. 3  Changes of ReHo in KOA patients before and after ozone-water treatment (n=18)

2.3　KOA患者治疗前后脑区ReHo变化VAS评分变化的相关性分析

       提取臭氧水治疗前后KOA患者发生显著变化脑区ReHo值，再将变化的ReHo与VAS评分进行相关性分析，结果显示，右岛叶(r=0.657) ReHo变化与VAS变化呈负相关，即臭氧水治疗后随着VAS评分的下降，右脑叶的局部一致性逐渐升高(P=0.003)。未发现其他脑区ReHo变化与VAS评分变化的相关性(图4)。

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图4  右岛叶ReHo变化与VAS评分变化呈负相关
Fig. 4  Changes in ReHo in the right insula were negatively correlated with changes in VAS score.

3　讨论

3.1　rs-fMRI的出现为疼痛脑机制的研究提供了技术支持

       rs-fMRI作为一种无创、实时、直观的新方法，在慢性疼痛研究中得到了广泛的应用^[9]。与任务态的fMRI相比，rs-fMRI的优势在于提供了更全面的大脑功能结构信息^[10]。此外，ReHo的数据分析方法不需要确定用于分析的基于假设的感兴趣种子区域，使我们能研究整个大脑内在的激活模式。在检测人脑功能中不可预测的和复杂的自发血流动力学反应方面极具敏感性，是评价静息状态脑活动的有力而可靠的指标。ReHo假设给定体素在时间上类似于其邻居的体素，反映了局部自发神经元活动的局部一致性。ReHo值的增高或降低是局部脑区自发活动一致性增高或降低的反映，也是对疾病影响以及情感认知调控机制的提示^[11]。

3.2　KOA慢性疼痛相关的脑机制的研究为本实验奠定了理论基础

       近年来，研究人员利用rs-fMRI发现了KOA脑功能改变，为KOA患者疼痛发病的中枢机制提供了证据参考^[12]。基于脑功能连接度的分析，肖阳等^[13]以伏膈核为种子点，发现慢性疼痛的KOA患者相较于正常人连接增强的脑区有双侧伏膈核与双侧前扣带回、左侧尾状核和右侧颞极，而双侧伏膈核与右侧背外侧前额叶、左侧次感觉区、双侧角回功能连接减弱，且患者疼痛评分随着中伏膈核与右侧背外侧前额叶及左侧次感觉区功能连接增强或减弱而发生相应的改变。从而推测中枢多巴胺系统相关脑区伏膈核与认知控制、情绪调节、感觉加工相关脑区及默认网络功能连接的异常可能是KOA患者疼痛发生的机制之一。基于体素的形态测量学分析，研究发现与健康对照组相比膝关节疼痛的KOA患者，大脑灰质体积显著下降，几乎是年龄相关的2倍，其主要涉及的脑区包括双侧眶额叶皮质、右侧前额叶皮质以及中央前皮质和中央后皮质，结果表明，优先涉及前额叶皮质的慢性疼痛状况可能被认为是一种“认知状态”，对慢性疼痛的情绪和认知功能应给予高度重视^[14]。Pujol等^[15]发现致敏KOA患者在通常涉及疼痛区域以及之外的区域激活，延伸到听觉、视觉和腹侧感觉运动皮质。此外，KOA患者中有一部分具有中枢介导的疼痛敏感化可能是由于棘上介导的抑制减少，伤害性信号的易化，并与疾病发展的预后密切相关^[16]。已有的结果证明，疼痛的KOA患者大脑在几个脑区都显示出局部连接和活动异常。这些大脑区域中的大多数，如额叶、顶叶、颞叶、顶叶、小脑、丘脑、岛叶和边缘系统等，都属于“疼痛矩阵”，它被定义为随着疼痛程度的增加而表现出可靠激活的区域，它们广泛参与疼痛发生的认知、情感。

3.3　臭氧水对KOA患者镇痛作用的脑机制的阐明填补了臭氧水中枢镇痛机制的空白

       KOA以慢性疼痛为主要临床表现，是慢性疼痛的良好载体，国内外学者以KOA为疼痛模型，运用静息态功能磁共振技术对各种干预方法镇痛作用的中枢机制进行了深入研究和探讨^{[17, 18]}。Yue等^[19]研究扑热息痛治疗KOA患者疼痛的脑功能机制中发现，扑热息痛的镇痛作用的发挥与感觉皮层和缘上回中BOLD信号的激活减少有关。Liu等^[20]通过研究发现，不同的运动方式可以通过调节背外侧前额叶皮质起到改善KOA患者疼痛的作用。医用臭氧水是臭氧和生理盐水发生充分混合作用产生的一种无色、透明、略带腥臭味液体，因其具有显著抗炎镇痛作用而被广泛应用于KOA^{[21, 22]}的治疗，并取得显著的疗效。近年来，臭氧水对疼痛控制的外周作用已经得到一定的认识。研究表明，臭氧水可抑制患者关节液内多种炎性因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和受体，抑制磷脂酶A2和P物质等致痛物质的释放，起到抗炎镇痛作用^[23]。然而，臭氧水对KOA镇痛作用的中枢机制尚属空白，研究臭氧水抗炎镇痛如何作用于中枢神经系统，将有助于臭氧水中枢机制的阐明，为臭氧水疗法在临床更广泛的推广应用奠定坚实的基础。

       本研究显示，臭氧水治疗后KOA患者的VAS评分较治疗前显著降低(P＜0.05)，差异具有统计学意义，进一步证明了臭氧水能明显改善KOA患者的疼痛症状，疗效确切。此外，臭氧水治疗后，KOA患者右侧枕上回、右侧枕中回、右侧楔叶、右侧角回ReHo值增高，说明臭氧水治疗后患者对疼痛感觉的调控能力增强。臭氧水治疗后，右侧中央沟盖、右侧岛叶、右侧颞上回、右侧颞横回、右侧中央前回、左侧补充运动区、右侧补充运动区ReHo值降低，说明臭氧水治疗调整了患者的疼痛感受、注意和认知处理能力。以上表明臭氧水治疗可能是通过调节颞叶、顶叶、额叶、枕叶等脑区的功能达到治疗KOA的作用。石爱军等^[24]发现KOA疼痛患者双侧额叶、顶叶、颞叶、等脑区ReHo值广泛异常，本研究结果显示臭氧水正是通过调整这些脑区的ReHo活动来达到镇痛的目的，与石等研究具有一致性。

       岛叶位于大脑皮层与基底节区的中间地带，作为边缘系统的一部分，参与疼痛网络的组成，其前部与疼痛的情绪和注意力处理有关，主要负责痛觉情绪部分的传递，是内侧痛觉系统的重要组成部分，而后部则是编码疼痛强度的关键区域。综上，岛叶作为痛觉情感和感觉辨别的信息整合部位，慢性疼痛时岛叶会发生可塑性的改变^[25]。相关性分析结果显示臭氧水治疗后，右岛叶(r=-0.657)ReHo变化与VAS变化呈负相关。从而进一步推测岛叶可能是臭氧水治疗KOA的关键脑区。分析臭氧水镇痛作用的发挥正是通过调控慢性疼痛疾病患者疼痛信息的处理，改善情绪功能、认知功能损害的病理状态。

3.4　问题与展望

       本研究在臭氧水镇痛作用中枢机制方面尚处于一个前期初探阶段，在试验设计和数据挖掘等方面都存在一定不足。本研究我们只采用了KOA患者治疗前后自身对照的方法，尚未排除安慰剂等因素对本试验结果的影响，后续的研究中如果能够加入安慰剂对照组或者空白对照组，将使得研究成果更具有说服力。综上所述，本研究旨在通过比较臭氧水治疗前后脑功能ReHo的变化及其变化与临床疼痛VAS评分的相关性，探讨臭氧水对KOA患者镇痛作用的中枢机制。以期我们的研究结果能为臭氧水疗法在KOA治疗中的临床应用提供可视化参考的同时，促进臭氧水疗疗在临床上更广泛的推广应用，为广大KOA患者解除病痛。