恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康、降低患者生活质量，是世界第二大致死原因，已成为全球性公共卫生问题。据全球肿瘤流行病统计数据预测显示，至2030年，每年将有1300万人死于癌症^[1]。自20世纪70年代以来，中国恶性肿瘤病死率上升了142.85%^[2]。肿瘤细胞会通过特殊的代谢途径产生不利于正常体细胞生存生长的细胞外微环境，同时会上调各种基因表达和蛋白生物合成以增加其侵袭性和转移扩散能力，导致实体瘤对放疗、部分化疗等传统癌症治疗方法产生耐受性^[3]。准确诊断肿瘤的病理状态对其早期确诊、正确疾病管理、进行个体化治疗至关重要。肿瘤细胞外酸性微环境是实体瘤的特征之一，pH调节机制是肿瘤细胞存活的重要组成部分，其逆转可阻止原发肿瘤的增殖和转移，能够非侵入地量化肿瘤细胞外pH的工具有极大的可能性进行临床转化应用。磁共振成像技术由于其非侵入性、无放射性损伤、高空间分辨率和深组织穿透性等前提，具有较高的病理成像潜力，已作为常规辅助检查技术广泛应用于临床。近年来，科研人员致力于以磁共振成像方法作为技术核心，研究肿瘤组织无创在体、实时动态、定性定量pH检测的全新评估手段，以提供肿瘤组织代谢相关以及分子功能水平的生物学信息。本文从肿瘤酸性微环境的形成机制及其病理生理学意义出发，对目前现有的磁共振pH成像技术及方法展开评述，并针对其在本领域的优缺点及临床应用现况或临床转化的机遇与挑战进行探讨，以促使新型磁共振pH成像技术方法及pH敏感磁共振分子成像探针的设计开发提供理论依据，并为其临床应用前景及效用评估提供数据支持。

1 肿瘤细胞外酸性微环境

       与正常体细胞不同，肿瘤细胞的细胞内pH (intracellular pH，pHi)大于7.2，细胞外pH (extracellular pH， pHe)为6.7～7.1，这种特殊的肿瘤pH梯度称为“反向pH梯度”，细胞外酸性环境是实体瘤的特征之一。Warburg效应表明，即使有充足的氧气支持线粒体呼吸，肿瘤细胞也能够将葡萄糖转化生成乳酸^[4]，这种有氧糖酵解的代谢特征低能耗但可快速产生热量。为避免细胞内酸中毒，肿瘤细胞会上调部分质子泵的表达及活性将质子及乳酸释放至胞外环境，质子泵包括Na⁺/HCO3^-共转运体(Na⁺/HCO3^- cotransporter，NBC)^[5]、液泡H⁺-ATPases (V-ATPases)^[6]、Na⁺/H⁺交换体(Na⁺/H⁺ exchanger，NHE)^[7]、单羧酸转运体(monocarboxylate transporter，MCTs)^[8]、碳酸酐酶(carbonic anhydrases，CA)^[9](图1)。

       实体瘤恶性微环境已成为癌症患者死亡的主要原因^[10]。实验表明，与pH为7.4相比，在pH为7.0的条件下进行48 h细胞培养，裸鼠静脉注射人黑色素瘤细胞后肺转移的发生率约增加1倍^[11]，这是由于酸性的细胞pHe限制了HCO3^-的缓冲作用，调节细胞外基质的动力学活性，进而激活酸激活蛋白酶，促进肿瘤细胞的侵袭和转移扩散^[12]。此外，酸性环境有助于肿瘤化学抵抗、阻碍机体对肿瘤的免疫排斥、降低部分弱碱性抗肿瘤药物的治疗作用^[13]。综上所述，肿瘤细胞外pH的无创在体、定性定量、实时动态的监测在其临床诊断、指导治疗、疗效监测中起重要作用，目前已研发出部分具有pH检测作用的技术和方法，为精准医疗提供了全新研究方向。

点击查看大图

图1  肿瘤反向pH梯度及质子转运体和通道在肿瘤pH调节中的作用
Fig.1  Tumor reversed pH gradient and major ion channel membrane transporters regulating ion fluxes to maintain pH in tumor cells.

2 现有肿瘤组织pH检测技术及方法

       传统测定组织酸碱度的方法主要包括：微电极法，测量结果较为精准但有创；荧光光谱法，可污染组织细胞^[14]；正电子发射断层分子成像，可快速观察机体整体情况但成本昂贵且有辐射；磁共振技术，凭借高空间分辨率、无放射损伤、无创实时在体等优异性能，具有广阔的肿瘤组织pH检测临床应用潜力。

3 磁共振pH成像技术

       磁共振pH成像技术是采用磁共振成像方法来分辨pH值不同的组织之间成像强度差异，其技术原理基于以下两点：(1)pH依赖以及非pH依赖共振之间的化学位移差异来测量组织pH；(2)使用pH敏感的对比剂改变弛豫，进而评估肿瘤细胞外环境的pH变化。磁共振波谱和磁共振波谱成像技术可准确无创地进行在体pH值测量^[15]，最常用的³¹P谱技术即根据组织代谢产物磁共振频谱中无机磷和磷酸肌酸化学位移的差值，与参考曲线进行比较计算组织的pHi值^[16]，但其时空分辨率较低，需维持组织长时间的生理稳定状态，临床应用受限。而MRI技术可以解决上述问题，成为目前肿瘤组织pH测量的主要方法。同时，随着磁共振分子成像技术的发展，可在活体状态下研究及评估肿瘤酸性环境的代谢相关功能分子水平机制^[17]。¹H磁共振成像技术已广泛应用于临床，为减少机体因质子含量丰富所产生的背景信号，许多pH成像技术研究集中在探索除¹H原子外的其他核磁共振原子，以下将介绍¹³C、¹⁹F、¹H磁共振pH成像技术的研究进展。

3.1 13C-MR成像

       除质子外，肿瘤组织pH值也受碳酸氢盐缓冲系统控制。¹³C-碳酸氢盐和¹³CO2的pH依赖化学平衡可以使用Henderson-Hasselbalch方程来计算：

       pH＝pKa＋log10[HCO3-][CO2]

       其中，pKa是离解常数，在机体内为6.17，超极化¹³C标记的碳酸氢盐和CO2信号与各自分子浓度对应，通过这些信号的比值可以进行pH值估计。¹³C通过质子去耦合和动态核极化(dynamic nuclear polarization，DNP)^[18]增加¹³C频谱的敏感性并使其分子信噪比提高。通过构建专门的射频线圈、开发新脉冲序列进行¹³C的信号采集，可以将DNP技术应用于肿瘤pH值的检测^[19]。Ferdia等^[20]通过研究得出，化学位移成像显示动物体内存在超极化的碳酸氢盐信号，其中主动脉检测到的含量最高，而在肿瘤内主要发现了超极化的¹³CO2，逐体素分析证实，与周围正常组织相比，肿瘤pHe呈酸性，此技术称为pH mapping，即对比剂介导的、使用DNP生成增强的碳酸氢盐比值成像。Hundshammer等^[21]应用超极化的[1,5-[13]C2]偶氮酸(ZA)及其衍生物[1,5-[13] C2,3,6,6,6-D4]右旋酸(ZAd)作为新型细胞pHe MRI探针，利用DNP技术对MRI信号进行了10000倍以上的增强，大鼠皮下MAT B Ⅲ腺癌在体实验表明，ZA能够测量并区分肿瘤血管内外pH。此外，ZA的氘化显著延长其纵向弛豫时间并增加灵敏度，可用于动态监测体内pH变化。然而，由于对¹³C线圈的要求较高以及通过DNP产生超极化分子的技术难度较大，阻碍了这种有前景技术的临床应用，因此研究产生超极化分子的其他途径有助于该技术方法早期应用于临床。目前科研工作者正致力于建立一种提供高信噪比和空间依赖性的临床工具，以允许超极化¹³C-DNP pH mapping与磁共振分子成像结合起来，达到磁共振成像提供肿瘤组织相关的高质量质子加权图像，超极化¹³C代谢MR显示相应的生化和pH值信息的目的^{[22, 23]}。同时，开发新型MRI序列进行快速图像采集以及设计接收器线圈来改进信号检测将允许该技术达到亚毫米空间分辨率，对肺癌、乳腺癌、结肠癌等实体瘤进行高分辨率pH成像。

3.2 19F-MR成像

       ¹⁹F天然丰度为百分之百，具有较高的旋磁比，最外层的7个电子使其化学位移对局部环境十分敏感。氟元素仅存在于机体骨骼与牙齿中，使¹⁹F探针有益于肿瘤细胞的识别和追踪，赋予其进行MRI核素成像的巨大潜力。目前已有研究使用氟化维生素B6衍生物来研究兔心肌细胞内外pH^[24]。¹⁹F MRI功能纳米探针的开发近年来受到了广泛的关注，其中pH敏感的¹⁹F MRI探针尤具吸引力。大多数pH响应性¹⁹F MRI纳米探针是含叔胺的氟化聚合物纳米颗粒，随着pH值的变化，这些聚合物链可以通过三级氨基的质子化和去质子化而膨胀或收缩，进而导致¹⁹F-MRI信号的激活或消失。Guo等^[25]设计了一种pH响应¹⁹F MRI纳米探针，命名为FNPs-PEG，实验结果显示当pH值从7.4降低到5.5时，¹⁹F MRI的信号强度显著增强，并且荷瘤鼠在体实验可采集到较强的¹⁹F信号，说明该探针有望作为启动¹⁹F MRI pH成像的对比剂。随着研究进展开发出了多功能¹⁹F纳米探针进行双模或多模态肿瘤细胞对比pH成像^[26]，或使用pH敏感的¹⁹F探针进行双核或多核素对比增强成像并采集相应信号用于组织pH检测^[27]。氟化探针毒性较低，具有一定的生物安全性，有利于临床转化，但由于¹⁹F-MRS及¹⁹F-MRI的检测灵敏度相对较低，因此应改进扫描时间、脉冲序列或线圈设计来提高检测灵敏度并获得高分辨率图像。共包埋其他显像剂和药物或联合其他技术方法进行¹⁹F-MR肿瘤pH成像，可为多模态成像和诊疗一体化研究开辟新的方向，具有广阔的临床应用前景。

3.3 氢质子磁共振波谱成像

3.3.1 化学交换饱和转移磁共振成像

       化学交换饱和转移(chemical exchange saturation transfer，CEST)成像技术通过饱和特定的可转移质子使其与水中质子进行交换，其对比度受pH、可交换位点浓度、温度等调节可交换质子化学环境因素的影响，因此可以通过观察水信号的改变进而间接获得pH值空间或时间分布的对比成像^[28]。

       CEST成像主要分为以下三类：抗磁性CEST (diamagnetic CEST，DIACEST)、顺磁性CEST (paramagnetic CEST，PARACEST)和酰胺质子转移(amide proton transfer，APT)。DIACEST对比剂是包含胺和羟基等化学基团的有机物质，Wolff和Balaban^[29]首次证实，在RF脉冲饱和情况下可进行DIACEST成像。PARACEST对比剂是镧系元素和有机螯合物的复合物，Pagel团队^[30]开发了一种新型PARACEST对比剂Yb-DO3A-oAA，它具有两个pH值响应CEST中心、不同MR频率和不同的pH依赖性，可在不饱和辐射下进行量化、减轻SAR值影响。APT技术可以选择组织内源性蛋白质及多肽的酰胺质子作为饱和目标，通过测量水信号的变化，间接获得交换率计算组织pH^[31]，其空间分辨率良好但其时间分辨率较低，目前主要应用于阿尔茨海默症^[32]的研究。

       碘类对比剂具有可交换的氢质子酰胺基团，由于其极高的生物安全性，已被用于MRI-CEST pH mapping的临床试验。Longo等^[33]使用碘比醇(仅含有一套酰胺质子且CEST作用强烈依赖于pH的对比剂)选择性施加不同功率的射频脉冲并通过比值测定法获得不同脉冲功率下的CEST信号可检测感兴趣区的pH值。通过实验获得其1.5μT(a)和6μT(b)的RF饱和脉冲下的ST图像，通过计算处理获得其不同pH下的pH map(图2A)。该团队进一步对肿瘤细胞pHe进行成像，并在异种移植乳腺肿瘤的小鼠模型中获得了成功(图2B)。此外，碘帕醇已被用于提供卵巢癌或乳腺癌患者的肿瘤pHe成像^[34]。以上成功的实验结果为进一步研究CEST MR pH成像铺平了道路，确认了肿瘤pHe mapping在诊断和疗效监测的临床效用。通过开发新型CEST MR成像技术、提高对比剂的灵敏性及安全性、减少磁场条件以及扫描序列或组织内源性干扰因素的限制，CEST MR成像技术有望提供准确的pH测量和多种生物体功能信息，并早期应用于临床肿瘤组织pH值监测。

点击查看大图

图2  A：30 mmol/L碘比醇溶液在不同pH下的CEST-MR图像；B：异种移植瘤小鼠静脉注射碘比醇(剂量为4 gI/kg b.w.)的CEST-MR图像
Fig. 2  A: CEST-MR images of 30 mmol/L iobitridol solution titrated at different pH values; B: CEST-MR images of xenografted-tumor bearing mouse following iobitridol i.v. injection (dose 4 gI/kg b.w.).

3.3.2 MRI对比增强

       pH响应性顺磁性钆对比剂GdDOTA-4AmP5-中膦酸盐侧臂质子化形成的氢键可进行氢交换，但其测量结果高度依赖于每个成像体素中的试剂浓度，难以直接获得溶液pH值^[35]。Gillies等^[36]先后注射同剂量的GdDOTA-4AmP5-和GdDOTP5-(后者pH不响应)对脑胶质瘤的小鼠肿瘤组织进行了pH成像：假设两种药物具有相同的药代动力学和组织生物分布，pH不敏感钆剂的分布可以用来预测pH敏感钆剂的浓度，通过对比灌注后二者的最大信号强度图的差异得到pH图，但因其费时且这些常规的对比剂特异性差，其临床应用潜力有限。

       MRI传统对比剂的灵敏度和特异性的相对不完美促使人们寻找并研发靶向性和生物安全性更高的磁共振分子成像探针，以肿瘤组织的细胞外酸性环境为激活信号，在肿瘤区域中激活的纳米级pH敏感性对比剂应运而生^[37]，并在体内外实验研究中展示出了其巨大的潜能与优势。Mi等^[38]设计了一种pH响应的、可迅速放大磁共振信号的纳米对比探针PEGMnCaP，他们使用pH敏感的磷酸钙纳米颗粒封装具有缩短肿瘤周围氢质子T1弛豫时间的Mn²⁺。在酸性环境下，纳米包壳裂解释放Mn²⁺，选择性地与蛋白质结合并快速增强实体瘤T1信号值，精确地成像肿瘤及响应其细胞外酸性环境的病理状况。结肠癌皮下荷瘤鼠的在体实验结果显示，pH响应的纳米探针不仅能够对肿瘤部位进行特异性成像，而且还可以对肿瘤组织的pH进行监测。但它们也存在着弛豫率低，体内清除率过快且增强效果在成像结果中不明显等缺点。随着技术的发展，构建具有高弛豫效率、良好生物相容性、高靶向性和低毒性的pH响应磁共振分子成像探针最有助于解决肿瘤生物学基本问题、评估肿瘤酸中毒与侵袭性之间的关系以及监测新型抗癌疗法的效果。

4 展望

       肿瘤的发展与转移是复杂的、多程序和多步骤的，而每一关键过程都与其酸性微环境相关。新型的磁共振成像技术及高pH响应磁共振分子成像探针研发将在在体可视化肿瘤生物学行为、反映肿瘤酸中毒与侵袭性等机制和表征方面发挥重要作用。与治疗药物的临床转化极富挑战性不同，新型诊断技术方法与相关设备的设计研发无疑是目前最具临床应用潜力、可提供早期精准以及个体化治疗方案的临床转化研究热点。在过去10年中，虽然已经解决了部分成像技术的局限性如空间和时间分辨率低、pH敏感性不足和临床应用可行性等问题，然而磁共振pH成像相关领域技术方法和成像系统平台还有待于突破，如：减少磁场状态及条件对成像结果的干扰、优化和提高信噪比，解决时间空间精准匹配，缩短扫描时间、完善相关配套MR硬件设施，开发具有强大图像数据处理软件甚至研发多核素同步成像的磁共振设备等，以促使肿瘤酸性微环境磁共振pH成像技术成为一种实时在体、具有临床应用前景的新型无创诊断工具，与此同时加强研发pH敏感成像相关分子成像探针及纳米递送系统等设计，促使肿瘤诊疗一体化的研究与发展。相信在不久的将来，磁共振pH成像技术将为肿瘤患者提供最具诊断价值、指导相应临床治疗方案制订、监测治疗疗效以及预后随诊的优先级临床实践影像学检查诊断技术方法。