胆管癌是一种具有胆管细胞分化特征的上皮性肿瘤，分为肝内型与肝外型^[1]。肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，EHCC)的预后差，根治性手术是其治疗的主要方式，但术后3年复发率约为54%^[2]，5年生存率约为40%^[3]。对于晚期或不可切除的患者，局部和全身化疗是主要的治疗手段^[4]。肿瘤的发生、发展伴随着血管生成，血管生成影响胆管癌患者的治疗策略及预后^[5]，微血管密度(microvessel density，MVD)是反映新生血管生成量的指标，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是血管生成的关键因子^[6]。DWI为临床广泛应用的MRI功能成像技术，通过测量活体组织中水分子的扩散能力，可以反映组织学的细微结构变化^[7]。目前已有DWI评估肿瘤血管生成的报道^{[8, 9]}，但在EHCC的MVD和VEGF的研究相对较少。笔者通过分析表观扩散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)值与MVD、VEGF、分化程度及肿瘤位置的关系，探讨DWI技术在EHCC术前评估中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

       回顾性分析2011年8月至2017年12月88例行肿瘤切除，经术后病理证实且术前2周行上腹部MRI检查(包括DWI序列)的EHCC患者。其中男48例，女40例，年龄29～84岁，平均(57.5±10.3)岁。本研究经过西南医科大学附属医院医学伦理委员会批准(批准文号：KY201963)，免除受试者知情同意。

       纳入标准：(1)接受根治性切除术或胰十二指肠切除术且病理明确为EHCC的患者；(2)检查前未行手术或放化疗；(3)临床、病理及术前MRI资料均完整。

       排除标准：(1)非肝外胆管起源的肿瘤；(2)图像模糊影响ADC值测量者。

1.2 扫描设备及参数

       使用飞利浦(Philips Achieva，Holland) 3.0 T超导MR，体部16通道Torso线圈。所有患者禁食4～8 h，行屏气训练，屏气差者采用呼吸触发扫描。各成像序列均应用敏感性编码技术(sensitivity encoding，SENSE)。扫描序列主要包括轴位双回波化学位移T1WI、轴位T1高分辨各向同性容积检查、轴位呼吸触发快速自旋回波脂肪抑制T2WI、轴位DWI、冠状位T2WI、MR胆胰管成像及3期动态增强扫描。DWI序列采用呼吸触发单脉冲快速自旋回波-平面回波成像，b值=0、800 s/mm²，TR取最短(shortest)，TE 70 ms，矩阵128×256，FOV 375 mm×300 mm，层厚7 mm，层间隔1 mm，平均信号激励次数4次。扫描范围：膈顶至十二指肠水平部下缘。

1.3 图像分析及ADC测量

       图像由2名具有5年以上工作经验的放射科医师采用双盲法在飞利浦MR工作站(R2.6.3.1)进行后处理。首先通过各序列明确病灶位置，然后在放大且清晰的DWI (b=800 s/mm²；图1A)中找出病灶区域勾画ROI，ROI尽可能包含多的肿瘤实性部分，注意避开邻近扩张胆管、血管及坏死区域，再将ROI复制到对应ADC图(图1B)中自动计算出ADC值，测量3次取平均值。两位医师测量的平均值作为病灶最终的ADC值。ROI平均面积约77.04 mm²。

点击查看大图

图1  A：在清晰放大的DWI (b=800 s/mm²)中确定病灶的ROI (白色圆圈)；B：将DWI中的ROI (白色圆圈)复制到对应层面的ADC图中，自动计算出ADC值
图2  男，79岁，肝外胆管癌，低分化。A：DWI (b=800 s/mm²)病灶呈高信号；B：ADC轴位病灶呈低信号，ADC值为1.099×10^-3 mm²/s；C：免疫组化：VEGF阳性表达( ×200)；D：病灶MVD丰富( ×200)

1.4 病理资料

       根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Carcer，AJCC)，EHCC可分为高、中、低分化^[10]。所有病理标本经免疫组织化学染色，使用Weidner法计数MVD^[11]。MVD计数：于低倍镜( ×40)下观察并选取肿瘤血管最密集区，然后在高倍镜( ×200)下计数3～5个血管最高密度区的微血管数，取均值表示为MVD。VEGF表达分级：于显微镜下( ×100)观察切片并明确阳性细胞分布密集处，然后换高倍镜( ×200)选择3个视野，其中胞质呈棕黄色或棕褐色判定为阳性细胞，然后计算阳性细胞百分数。未发现阳性细胞即未表达(－)，阳性细胞数在0～25%即低表达(+)，25%～50%即中度表达(++)，＞50%即高表达(+++)，其中前两者被视为表达阴性，后两者被视为表达阳性。标本分析由2名具有5年以上工作经验的病理科医师独立完成，对于定性资料，如有差异经讨论达成一致意见；对于定量资料，则取平均值作为最终值。

1.5 统计学方法

       以Kappa系数评估2名病理科医师观察VEGF表达的一致性。以组内相关系数(intraclass correlation coefficient，ICC)评价2名病理科医师测量MVD计数的一致性。ADC值与MVD的相关性采用spearman等级相关分析。ADC值在不同VEGF表达、肿瘤位置的差异性检验采用Mann-Whitney U检验。ADC值在不同分化程度间的差异性检验采用非参数Kruskal-Wallis H秩和检验，并进行组间两两比较。绘制受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线以评估ADC值区分VEGF表达、高及低分化组的效能。所有数据采用SPSS 25.0软件分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

       EHCC典型MR-DWI表现为不同程度高信号，而ADC图上为低信号(图2)。

       2名病理科医师观察VEGF表达的Kappa值=0.814 (P＜0.05)，测量MVD计数的ICC=0.965 (P＜0.05)，说明观察者间具有较好的一致性。

       88例病灶ADC值的中位值为1.308 (0.925～1.951)×10^-3 mm²/s，平均MVD为56.49±28.05，两者间存在显著负相关性(rs=-0.726，P＜0.05)。

       VEGF表达阴性46例，阳性42例，不同VEGF表达EHCC病灶的ADC值见表1。VEGF表达阴性组与阳性组的ADC值差异有统计学意义(U=406.50，P＜0.05)。ADC值＜1.291×10^-3 mm²/s预测VEGF表达阳性的AUC为0.790(图3)，敏感度、特异度分别为71.43%、78.26%。

       88例EHCC中，高分化31例，中分化38例，低分化19例，高、中、低分化组ADC值随分化程度降低逐渐减小(表1)，组间差异有统计学意义(χ²=72.51，P＜0.05)，组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ADC值＞1.319×10^-3 mm²/s预测高分化癌的AUC为0.986 (图4)，敏感度、特异度分别为96.77%、89.47%，ADC值＜1.184×10^-3 mm²/s预测低分化癌的AUC为0.998(图5)，敏感度、特异度分别为100%、97.10%。

       88例EHCC中，肝门部胆管癌42例，远端胆管癌46例，ADC值在不同肿瘤位置的差异无统计学意义(U=935.50，P＞0.05)。

点击查看大图

图3  ADC值预测VEGF阳性表达的ROC曲线(AUC=0.790)
图4  ADC值预测高分化肝外胆管癌的ROC曲线(AUC=0.986)
图5  ADC值预测低分化肝外胆管癌的ROC曲线(AUC=0.998)

点击查看表格

表1  不同VEGF表达、分化程度和肿瘤位置间EHCC的ADC值

3 讨论

       DWI为MRI的功能成像技术，可以通过非侵入的方式获取活体组织中水分子的运动情况，提供有关病理及生理改变的信息^[7]。DWI的定量ADC值反映水分子扩散受限程度，主要受肿瘤细胞影响，与肿瘤中的细胞密度呈负相关^[12]，原理是肿瘤细胞增殖旺盛，排列紧密，导致扩散受限。除了细胞密度，细胞大小、细胞外成分(如胶原纤维、细胞外基质)及一些细胞内因素(如核浆比、胞浆黏滞性)、血流等也会对ADC值产生影响^{[13, 14]}。因此，肿瘤微观结构上的差异可以通过DWI信号及ADC值表现出来。

       血管生成对胆管癌的生长、转移至关重要，大量新生血管为肿瘤提供了丰富的营养支持并排出代谢废物。MVD、VEGF与肝门部胆管癌浸润、转移及预后相关，MVD值高、VEGF阳性表达患者的生存率更低^[15]。关于ADC值与血管生成的关系，国内外研究对部分实体瘤进行了分析。Cong等^[8]回顾性分析52例食管癌患者，发现VEGF表达与ADC值之间存在负相关(r=-0.321，P＜0.05)，鲍志国等^[9]收集160例乳腺癌患者，发现ADC值与MVD及VEGF均呈负相关(r=-0.568，P＜0.05;r=-0.522，P＜0.05)。与上述报道不同，最近的一篇Meta分析^[12]纳入14篇不同肿瘤ADC值与VEGF相关性分析的研究，发现部分报道结果相互矛盾，所有肿瘤的合并相关系数r=0.02，因此认为DWI在检测肿瘤血管生成的微观结构方面不够敏感，但该分析也指出部分报道的不同结果可能是由肿瘤类型的差异引起的，此外，不同扫描仪及DWI序列可能对ADC值有影响，可能导致偏差。由于肿瘤具有异质性、复杂性，不同肿瘤的血管生成可能存在一定差异，这也可能是引起上述结果相互矛盾的因素，因此不同肿瘤可能需要单独分析。本研究纳入88例EHCC患者，发现ADC值与MVD呈负相关(rs=-0.726，P＜0.05)，VEGF表达阳性组ADC值明显低于阴性组(P＜0.05)，结果与王余等^[16]一致。此外，根据ROC曲线，本研究得出预测VEGF表达阳性的ADC诊断阈值为1.291×10^-3 mm²/s，AUC为0.790。MVD值较高及VEGF表达阳性者ADC值较低可能与以下因素有关：丰富的新生血管使肿瘤增殖活跃，细胞排列紧密、密度增加；VEGF增加肿瘤血管通透性，蛋白质和其他大分子从血管进入肿瘤间质，导致间质压增高^[17]；肿瘤血管扭曲、紊乱，直径不均匀，血管的结构异常使肿瘤血流效率低下，此外，生长的肿瘤细胞以及肿瘤中的高间质液压力可能会压迫血管，导致血管塌陷，从而进一步减少流量^{[17, 18]}。以上因素均可能导致细胞内或细胞外的水分子扩散受限，从而使ADC值减低。

       分化程度是影响胆管癌患者总生存时间的独立风险因素，低分化癌预后较中、高分化癌预后差^[19]。随着分化程度降低，肿瘤恶性程度增加，肿瘤细胞增殖加快，细胞密度、核浆比增加，细胞内、外间隙变窄，抑制水分子扩散运动，导致ADC值减低。本研究结果显示，高、中、低分化组ADC值随分化程度降低逐渐减小，组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与既往研究结果一致^{[16,20, 21]}。此外，ROC曲线显示，预测高及低分化癌的ADC诊断阈值分别为1.319×10^-3 mm²/s和1.184×10^-3 mm²/s，AUC分别为0.986、0.998。EHCC的生长部位(肝门部胆管和远端胆管)可能对术后生存率有一定影响^[22]。本研究中肝门部胆管癌42例，远端胆管癌46例，分析结果显示，ADC值在不同肿瘤位置的差异不具有统计学意义(U=935.50，P＞0.05)，提示EHCC的生物学行为不一定与其生长部位有关。

       本研究的局限性：手动勾画EHCC病灶的ROI可能存在误差；尽管ROI选择肿瘤的最大层面，但DWI图像与病理切片不一定完全对应；EHCC相对罕见导致本研究样本量相对较小。

       综上所述，MR-DWI有希望判断EHCC病灶MVD、VEGF的表达及分化程度，对治疗方案的选择以及术前评估有重要的临床意义。