糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种全身慢性代谢性疾病，在体内高糖刺激下，骨髓微环境改变，促使骨髓间叶组织向脂肪组织转化，抑制成骨细胞形成，导致骨髓内脂肪堆积^[1]。骨髓脂肪细胞是骨髓造血微环境和能量代谢的调节器，糖尿病脂肪堆积和脂质代谢紊乱会导致骨髓脂肪生成增加及骨髓细胞组成的改变^[2]，骨髓微环境平衡失调，与骨质疏松症和脆性骨折的风险等改变密切相关^[3]，是临床上糖尿病患者致死、致残的主要原因^[4]。

       维生素D是一种脂溶性物质，对于脂肪的分化有着调节作用^[5]；其储存和代谢的主要场所位于脂肪组织，糖尿病肥胖患者会使得血清1-25 (OH) D3不足^[6]。维生素D对于调节骨髓微环境，可改善骨髓脂肪堆积及促进骨强度^[7]；有研究表明维生素D的补充可以限制糖尿病患者皮下脂肪的再增加，但对于已生成的脂肪组织尚无改善作用，并且能促进胰岛素释放、改善胰岛素的抵抗^[8]；同时，维生素D刺激皮下脂肪细胞活化，加快体内葡萄糖的摄取，改善循环血糖浓度，对于维持体内钙、磷平衡及骨微环境代谢稳态有调节作用^[5，9]。

       定量非对称回波的最小二乘估算法迭代水脂分离序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)结合了快速三维多回波梯度回波成像序列和增强的图像重建技术改善了局部脂肪的检出，通过数据模型重建、整合水和脂肪多回波的复数数据来估算器官内脂肪含量(fat fraction，FF)^{[10, 11]}。IDEAL-IQ序列扫描具有简单、快速、重复性好等特点，其中在后处理工作站上可直接计算出腰椎感兴趣区骨髓脂肪含量百分比，为在活体糖尿病骨髓脂肪含量改变的定量研究中表现出了巨大临床价值^{[12, 13]}。同样使用IDEAL-IQ技术，胡磊等^[14]前期研究结果显示糖尿病兔腰椎体骨髓内脂肪含量较正常组明显增多。目前尚未见维生素D干预糖尿病骨髓脂肪含量的影像学研究报道，本研究旨在探讨IDEAL-IQ技术下评价维生素D对于糖尿病骨髓脂肪含量改变的价值。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

       本实验研究从2019年8月开始，2020年12月结束，武汉大学人民医院伦理委员会审查通过所有实验(第20190421号)。30只28～32周龄健康日本雄性大耳白兔，体质量3.0～3.5 kg，由武汉大学动物实验中心提供单笼饲养，室温25 ℃，30只兔适应期间自由摄食、进水，于一周后测得血糖均在正常范围[(5.5±0.5) mmol/L]。

       30只日本雄性大耳白兔按随机分为两组，其中实验组20只；造模前，将四氧嘧啶(Sigma公司)配制成5%溶液，30只兔均禁食8～12 h，不禁水；造模时，由耳缘静脉按照100 mg/kg快速注射入实验组兔体内，对照组10只给予注射同等量生理盐水。造模后每小时用血糖仪(三诺安信血糖仪)测量耳缘末梢血糖，自由进食；对于血糖＜2.0 mmol/L或出现严重低血糖表现的大白兔，如抽搐、尖叫、精神不振、不进食等表现，通过给予注射葡萄糖缓解。四氧嘧啶注射48 h后重新测量实验兔末梢血糖浓度，其中测得血糖值大于14 mmol/L或不同时间点血糖值大于11 mmol/L，可认定造模成功^[15]；若测得血糖处在正常范围内，则补加50 mg/kg四氧嘧啶，直至血糖水平达标；对于血糖水平超过30 mmol/L的严重高血糖水平，通过皮下注射长效胰岛素，将其控制在30 mmol/L以下。

       四氧嘧啶造模成功一周后，随机将20只实验兔再分为两组；其中，干预组10只每周口服维生素D (400 μg)，连续给药4周；对照组和单纯糖尿病组每周用生理盐水10 mL灌胃。

1.2 MRI设备及成像方法

       所有兔在第0、4、8、12、16周的时间点，分别从耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，在3.0 T Discovery MR750 Plus磁共振设备(GE Healthcare)上，固定于8通道膝关节专用相控阵线圈，摆放体位呈仰卧位、足先进；使用常规腰椎矢状位FSE-T2WI、FSE-T1WI及腰椎IDEAL-IQ扫描。

       矢状位T1WI扫描参数：TR 300 ms，TE Min Full，扫描层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵320×288，激励次数为2，扫描时间2 min 6 s。矢状位T2WI扫描参数：TR 2500 ms，TE 120.0 ms，扫描层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵320×320，激励次数为4，扫描时间2 min 45 s。矢状位IDEAL-IQ扫描参数：翻转角6°，TR 17.2 ms，TE 1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2 ms。带宽31.25 kHz，扫描层厚3 mm，视野18 cm×0.8 cm，矩阵192×160，激励次数为3，扫描时间5 min 37 s。

1.3 兔腰椎IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比测定

       在AW4.6后处理工作站上(GE Healthcare)，将对照组、单纯糖尿病组及维生素D干预组所有兔的IDEAL-IQ扫描图像导入，选取3组各个时间点Fat Fraction图像中兔腰椎第5～7椎体中心层面，由同一观察者勾画感兴趣，每1个椎体的ROI要避开椎体终板软骨、边缘骨皮质的干扰，重复3次，取平均值。见图1。

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图1  A～C分别为矢状位T1WI、T2WI、FF图。红色区域为勾画的腰7椎体(白色箭头)兴趣区
Fig. 1  A—C showed the T1WI, T2WI, FF, respectively. The red area was the ROI area of fat fraction of the 7^th lumbar vertebra (white arrow).

1.4 兔腰椎骨髓组织病理学检查

       完成检查后，在第16周采取空气栓塞法处死所有实验兔，取腰5、6、7椎体作为病理标本，10%多聚甲醛固定组织，脱钙两周后用石蜡包埋，垂直于椎体蜡块短轴位作4 μm切片，行HE染色。随机选取3个相互不连续的区域，由同一观察者分别于显微镜高倍镜(×400)视野下统计脂肪细胞数目，取平均值。

1.5 统计学分析

       采用统计学软件SPSS 23.0，对第0、4、8、12及16周各时间点IDEAL-IQ测量所得的3组间腰椎体骨髓脂肪含量，其中空白对照组、单纯糖尿病组、维生素D干预组各采用两两重复测量的方差分析统计。第16周IDEAL-IQ测量腰椎体脂肪含量FF与HE染色切片镜下脂肪细胞计数采用Pearson相关分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

       因麻醉意外在实验期间实验组共死亡7只，其中单纯糖尿病组剩余6只，维生素D干预组剩余7只，对照组死亡1只，空气栓塞处死2只，剩余7只。

       IDEAL-IQ测量单纯糖尿病组及维生素D干预组各组组内在造模后第16周椎体骨髓脂肪含量FF值较第0周明显增高，且两时间点测得FF值具有统计学意义(F=4.971，P＜0.05；F=3.055，P＜0.01)，两组其他时间点测得FF值不具有统计学意义(P＞0.05)；对照组椎体各时间点骨髓脂肪含量百分比差异无统计学意义(P＞0.05) (图2)。

       单纯糖尿病组及维生素D干预组两组第16周椎体IDEAL-IQ测量脂肪含量百分比与第16周对照组比较，腰椎骨髓FF%差异分别存在统计学意义(P＜0.05)。但是，同一时间点糖尿病组与维生素D干预组组间在第16周的FF值差异不具有统计学意义(t=2.390，P=0.06) (表1)。

       第16周，腰椎骨髓HE染色显示单纯糖尿病组与维生素D干预组中骨髓脂肪细胞较空白对照组相比明显增多、增大(图3)；空白对照组、单纯糖尿病组与维生素D干预组骨髓脂肪细胞数目平均值分别为12.80±5.26/mm²、21.30±6.80/mm²、19.20±5.81/mm²，单纯糖尿病组与维生素D干预组骨髓脂肪细胞数值高于空白对照组(t=-19.549，P＜0.05；t=-15.681，P＜0.05)，差异有统计学意义。但维生素D干预前后，两实验组骨髓脂肪细胞数值差异无明显统计学意义(t=-0.481，P=0.412)。

       Pearson相关性分析结果显示兔糖尿病模型成功后第16周，实验兔腰椎骨髓脂肪含量(FF)值与HE染色后的脂肪数目呈正相关(r=0.828，P＜0.05) (图4)。

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图2  空白对照组、单纯糖尿病组、维生素D干预组各时间点IDEAL-IQ椎体脂肪比的趋势图
Fig. 2  Trend chart of the proportion of vertebral bone marrow fat measured by IDEA-IQ at each time point between the simple diabetes group, vitamin D intervention group and control group.

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图3  A～C分别为第16周空白对照组、单纯糖尿病组、维生素D干预组兔腰椎骨髓HE染色(×400)。黑色箭头所指为脂肪细胞
Fig. 3  A—C showed HE staining of lumbar bone marrow of rabbits in the control group, the simple diabetes group and the vitamin D intervention group at week 16 (×400). The black arrows indicate adipocyte.

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图 4  四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型后第16周，实验兔腰椎骨髓FF值与脂肪数目呈正相关
Fig. 4  FF values of lumbar bone marrow was positively correlated with the number of adipocyte at the 16^th week in alloxan-induced diabetic rabbits.

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表1  单纯糖尿病组、维生素D干预组、对照组各时间点IDEAL-IQ椎体脂肪比的比较(%)
Tab. 1  Comparison of IDEAL-IQ values at each time point between the simple diabetes group, vitamin D intervention group and control group (%)

3 讨论

       本实验探讨基于IDEAL-IQ技术评估维生素D干预前后糖尿病骨髓脂肪含量变化，研究结果表明，在第16周单纯糖尿病组和维生素D干预组骨髓脂肪含量较对照组脂肪含量增高，其中单纯糖尿病组增高较为明显；第16周维生素D干预组组较第16周单纯糖尿病的脂肪含量差异无相关性，但维生素D干预下骨髓脂肪分数值整体呈下降趋势。

       多种MRI定量技术在评价骨髓脂肪含量方面具有独特优势，磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy，MRS)检测是一种通过充分利用化合物间的差别而无创性的光谱观察检测生物体活体组织中的各种组织新陈代谢、生化变化和对其化合物进行定量检测的科学技术^[16]。Li等^[17]研究结果表明3.0 T MRS对于低骨密度个体的椎体骨髓脂肪含量的测定具有可行性；但是，¹H-MRS技术难点是骨髓磁场谱图曲线的线宽易直接受到松质骨髓的小梁和骨髓磁场不均匀的因素影响，且扫描时间长，要求较高、后处理较为复杂而受到限制。水和脂肪的回波不对称迭代分解和最小二乘估计量化序列(IDEAL-IQ)作为一种新的MR图像脂肪含量百分比的量化方法，该方法已被用于估计多个器官的脂肪含量^[10]。相对于¹H-MRS，IDEAL-IQ技术具有用时短、可重复性高等优势，从工作站中可以对所生成的FF图上直接计算出各组织器官感兴趣区内的脂肪含量百分比。Ergen等^[18]首次采用IDEAL-IQ技术展示了定量测量女性椎体脂肪含量的可行性；Hu等^[19]前期实验首次利用IDEAL-IQ技术，揭示四氧嘧啶诱导糖尿病兔椎体终板下骨髓腔脂肪含量随着时间累积的变化，证实了IDEAL-IQ在实验动物糖尿病模型上定量评估椎体骨髓脂肪含量是可行的。

       目前很多研究都已经发现人体血清中的维生素D循环水平浓度(以人体血清中的维生素 D3水平为主要指标)可能会与2型糖尿病患者风险增加相关^[20]，同样糖尿病疾病也会导致钙、磷及维生素D水平的减低。维生素D通过刺激脂肪细胞对葡萄糖的摄取可改善钙磷平衡及骨代谢^[5]。Shab-Bidar等^[8]研究表明血清维生素D水平可与内脏脂肪含量呈负相关，但对于已经生成的脂肪组织尚无明显改善作用。长期给肥胖小鼠补充维生素D，可诱导炎症趋化因子mRNA表达水平降低，有助于肥胖小鼠体内减轻脂肪组织炎症及改善肝脏脂肪变性趋势^[21]；对于糖尿病患者的皮下脂肪的累积，补充维生素D可以有效限制皮下脂肪的再增加^[8]。本实验利用IDEAL-IQ技术快速、动态监测等特点，定量测定维生素D干预前后糖尿病兔腰椎骨髓脂肪含量值变化，为揭示维生素D影响早期糖尿病骨病中骨髓微环境中脂肪代谢的病理生理机制及未来为临床评估相关抑脂药物疗效结果提供了较为可靠的影像学证据。

       本实验结果显示，维生素D干预四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型16周后，兔腰椎骨髓脂肪含量分数值较单纯糖尿病组骨髓脂肪分数呈下降趋势，但两组间腰椎脂肪FF值无明显改变，两者差异不具有统计学意义。维生素D作用具有两重性，合理剂量的1，25-二羟维生素D3 [1，25-(OH)2D3]浓度利于髓内干细胞向成骨细胞分化、成熟，抑制脂肪细胞的累积，改善骨髓微环境平衡^[22]；超过生理剂量的1，25-二羟维生素D3浓度会改变骨髓微环境稳定，抑制成骨细胞分化，提高破骨细胞的活性，从而改变骨髓内脂肪含量。本实验维生素D按照实验动物和人类之间的剂量转换的简单实践指南^[23]，转化为兔模型生理剂量范围，推测在糖尿病16周病程中，给药4周时间中腰椎骨髓脂肪成分发生的改变，可能因为干预时间过短，或者是给药浓度较低，使得体内维生素D浓度未达到阈值或药物持续时间较短未能达到让IDEAL-IQ技术测得的宏观脂肪组织改变的表现，这可能是导致维生素D干预糖尿病骨髓脂肪含量下降趋势不明显的重要原因之一。未来的研究应更多地从维生素D干预时间及干预剂量上评价IDEAL-IQ测量兔糖尿病模型中骨髓脂肪含量分数值的变化。

       本实验的局限性：(1)本实验研究的样本量较少，维生素D对于糖尿病骨髓脂肪含量改变的变化机制仍需要大样本予以证实；(2)干预组给予维生素D的剂量及给药时间较短，对于长期、大剂量维生素D干预糖尿病骨髓脂肪改变是否存在相同效果仍需要后续研究进一步观察；(3)糖尿病动物模型的发生发展和临床患者糖尿病慢性自然病程存在差异。

       综上所述，IDEAL-IQ技术评价维生素D干预四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型骨髓脂肪含量变化是可行的，维生素D干预16周内，骨髓脂肪含量改变呈现下降趋势。