慢性呼吸系统疾病是我国居民的重要疾病负担，2019年6月《柳叶刀》杂志刊文指出中国病死率前四位的疾病依次为脑卒中、缺血缺氧性脑病、肺癌和慢性阻塞性肺疾病^[1]，其中包含两种呼吸系统疾病。2019年10月钟南山院士发文指出慢性呼吸系统疾病已成为我国严峻的公共卫生问题之一，健康中国行动规划(2019～2030年)中明确“实施慢性呼吸系统疾病防治行动”，早发现、早诊断、早治疗应成为各级医疗机构防控慢性呼吸系统疾病的重要方向^[2]。因此肺通气功能早期诊断具有重要意义。肺功能检查是目前肺通气评价的主要检查方法，但其对早期病变敏感度不高，不能对病灶准确定位。单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography，SPECT)虽能获取肺功能信息，但SPECT作为放射性核素成像，其辐射不可忽视。磁共振成像的优势之一是无辐射，能够进行多参数、多序列成像，可同时提供组织结构及功能信息等。常规MR因肺部氢质子密度低，水-气交界面的磁敏感差异以及存在心动周期、呼吸运动伪影而在肺部应用受限^[3]。随着成像技术的进步，超短回波时间成像、超极化气体成像等技术在呼吸系统疾病的应用已在国内外被广泛报道，尤其新冠肺炎在全世界流行后，我国学者应用MR评估出，康复后的患者计算机断层扫描(computerized tomography，CT)表现正常但其MR肺通气成像却检测出肺气-血交换功能减弱，这一发现是在CT评估预后解剖信息的基础上对肺功能预后信息的重要补充^[4]。尽管目前MR肺通气成像方案仍存在对比剂获取难度大、制备复杂和存储运输不便等局限。但毫无疑问，MR已逐渐成为当前肺CT成像的重要补充及肺功能成像的主要研究方法，对呼吸系统疾病的早期诊断具有重要意义^{[5, 6, 7, 8]}。

       ¹⁹F具有100%的天然丰度，核磁共振灵敏度较高，生物背景低等特点，其MR成像具有高信噪比^[9]。全氟化碳是一种能提供高浓度¹⁹F核的化合物，具有易获取、氧亲和性高和化学性质稳定等特点，并在新生儿呼吸窘迫的治疗应用上获得了美国食品药品监督管理局批准^[10]。纳米材料近年来被广泛应用于MRI研究，通过控制纳米颗粒大小能使其均匀沉积在肺深部组织的肺泡区，提高输送效果。灵活的表面修饰和高表面积体积比有利于药物负载，并能合成多功能、多模态的纳米材料，在分子和细胞水平上提供高度敏感的成像信息和治疗效果。这些特点使吸入纳米颗粒结合肺深部组织的生物标志物成为可能，从而提高局部药物浓度，放大分子信号。因此，纳米粒子在呼吸道疾病的气管内递送成像和治疗方面是极具吸引力的候选药物^[11,12]。经呼吸道雾化给药更是在临床中长期而广泛的应用^{[13, 14, 15]}。目前国内外鲜见雾化全氟化碳纳米探针多核¹H/¹⁹F磁共振(¹H/¹⁹F magnetic resonance，¹H/¹⁹F-MR)肺通气成像方面的报道，本课题组先前的研究证明了，全氟化碳纳米探针有良好的成像效果，并且经呼吸道递送全氟化碳纳米探针能提高肺癌¹H/¹⁹F-MR图像的质量^{[16, 17, 18]}。因此在前期研究的基础上，根据临床肺通气成像应用的重要需求，本研究探讨基于雾化全氟化碳纳米探针多核¹H/¹⁹F-MR肺通气成像的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

       BALB/c小鼠20只，鼠龄5～6周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分为雾化全氟化碳纳米探针组和空气组，每组10只，经不同处理后进行肺部¹H/¹⁹F-MR扫描。本研究经过哈尔滨医科大学附属第四医院动物伦理委员会批准(批准文号：2021-ZWLLSC-03)。

1.2 材料合成及表征

       应用雾化全氟化碳纳米探针进行MR肺通气成像。该纳米探针为一种负载罗丹明B磺酰基的光学和MR多模态成像探针，其合成方法参照发明专利及我课题组前期工作^[16,19]。表面活性剂二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油以及胆固醇以一定的摩尔配比混合，用有机溶剂将该混合物溶解并将其蒸干，过夜后用超声震荡的方式将其分散于水中得到表面活性剂混合物，将全氟化碳和甘油均匀分散于表面活性剂中，制成含有¹⁹F纳米粒子的乳液，将未被有效包裹的成分透析去除制备成含¹⁹F纳米粒子的磁共振纳米成像探针，本研究所用的试剂为体积浓度20%的全氟正辛基溴烷纳米探针(perfluoroctylbromide nanoprobe，PFOB NP)，氩气密封并装瓶，避光4 ℃保存。使用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Malvern Instruments Ltd，Malvern, UK)表征所合成纳米探针的流体动力学直径和Zeta电位。通过原子力显微镜(AFM，Bruker Dimension Icon)和透射电镜(FEI，ThermoFisher，Waltham，MA)测量其均匀性。通过IVIS光学成像仪(Perkin Elmer，Waltham，MA)和9.4 T MR成像仪(BioSpec 94/20 USR，Bruker)获得PFOB NP样品的光学和MR图像。

1.3 MRI扫描

       磁共振图像均使用德国布鲁克公司的9.4 T MR扫描仪(BioSpec 94/20 USR, Bruker)在¹H/¹⁹F双调谐线圈扫描下获得。雾化全氟化碳纳米探针组和空气组分别行磁共振扫描。¹H 磁共振(¹H magnetic resonance，¹H-MR)扫描采用T1-RARE序列，参数为：TR 819.257 ms，TE 12 ms，矩阵256×256，FOV 38.4×38.4 mm²,层厚1.0 mm，层数15。¹⁹F磁共振(¹⁹F magnetic resonance，¹⁹F-MR)扫描使用的序列是m-cssi-序列和m-cssi-3D序列，其中m-cssi-序列参数为：TR 4587.061 ms，TE 156 ms，矩阵64×64，FOV 38.4×38.4 mm²,层厚3.0 mm，层数5；m-cssi-3D序列的参数为：TR 4000 ms、TE 184.96 ms、矩阵60×60×40，层数1，层厚23.8 mm。在磁共振扫描的过程中连接生理监测设备监测小鼠呼吸速率和体温。

1.4 图片处理与数据分析

       MRI的图像处理及分析使用Image J。参照Ohno的方法^[20]，将5周龄BALB/c鼠肺分为上、中、下三部分，避开图像上可见的大血管影，在上、中、下肺野分别取5个ROI，测量各ROI的信号强度并取平均值。

1.5 统计分析

       用于统计分析和绘制统计图的软件为Graphpad prism 6。所量化的数值以平均数±标准差表示。递送雾化全氟化碳纳米探针后肺各区域的¹⁹F信号强度差异、各剂量间、各时间点间的¹⁹F信号强度差异均使用单因素方差分析。在方差分析后进行的多重比较均采用Tukey法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 全氟化碳纳米探针的表征

       测得所制备的全氟化碳纳米探针平均流体动力学直径为(138.2±53.51) nm (图1A)，Zeta电位为(-14±4.94) mV (图1B)，如图1C和图1E所示，透射电镜和原子力显微镜结果显示了全氟化碳纳米探针尺寸高度均匀。不同浓度的全氟化碳纳米探针样品 (图1D)光学和MR图像显示了该探针具有良好的多模态成像性能(图1F、1G)。。

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图1  全氟化碳纳米探针的表征。A：全氟化碳纳米探针的粒径分布图；B：全氟化碳纳米探针的电位分布图；C：全氟化碳纳米探针的透射电镜结果，比例尺为1.0 μm；D：全氟化碳纳米探针的数码图片；E：全氟化碳纳米探针的原子力显微镜结果，比例尺为5 μm；F：全氟化碳纳米探针倍比稀释后不同浓度样品的体外光学成像；G：全氟化碳纳米探针倍比稀释后不同浓度样品的体外¹H/¹⁹F-MR成像
Fig. 1  Characterization of perfluorocarbon nanoprobes. A: The particle size distribution diagram of the perfluorocarbon nanoprobe. B: The potential distribution diagram of the perfluorocarbon nanoprobe. C: Transmission electron microscopy results of perfluorocarbon nanoprobes (scale bar: 1.0 μm). D: Digital picture of perfluorocarbon nanoprobes. E: Atomic force microscopy results of perfluorocarbon nanoprobes (scale bar: 5.0 μm). F: Optical imaging of samples with different concentrations after multiple dilution. G: In vitro ¹H/¹⁹F-MR imaging of perfluorocarbon nanoprobes at different concentrations after dilution.

2.2 雾化全氟化碳纳米探针的活体1H/19F-MR肺通气成像

       为探索5周龄BALB/c鼠雾化全氟化碳纳米探针多核¹H/¹⁹F-MR肺通气成像的合适剂量及其进行肺通气成像的可行性。不同组实验动物分别经呼吸道递送25 μL、37.5 μL、50 μL、62.5 μL、75 μL的雾化全氟化碳纳米探针后进行¹H/¹⁹F-MR图像采集。其中递送25 μL时实验动物肺内未见¹⁹F-MR信号，其余剂量均可见¹⁹F-MR信号增强，当经呼吸道递送75 μL雾化全氟化碳纳米探针时，小鼠双肺各区域明显增强(图2A)。分别测量25 μL、37.5 μL、50 μL、62.5 μL、75 μL给药剂量下的¹⁹F-MR信号强度，发现剂量为75 μL时¹⁹F-MR信号强度最高，并且不同剂量之间的¹⁹F-MR信号强度差异有统计学意义(P＜0.01) (图2B)。考虑到研究肺通气信息应保证全肺野成像，同时小鼠耐受性有限，应尽量选取能满足全肺野成像要求的最低剂量作为实验所用剂量。而上述剂量实验中仅75 μL能实现全肺野成像，同时经呼吸道递送该剂量的组别中小鼠无死亡。因此，本实验后续MR成像所使用的剂量均为75 μL/只。

       在经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针进行¹H/¹⁹F-MR扫描后，肺各区域明显增强，雾化全氟化碳纳米探针¹H/¹⁹F-MR成像能较好地描绘肺的整体解剖轮廓(图2C)。在添加伪彩的¹⁹F三维磁共振(¹⁹F three dimensional magnetic resonance，¹⁹F 3D MR)图像(图2D)和¹⁹F 3D MR重建图像(图2E)上显示肺各区域的¹⁹F信号强度并不相同，肺门附近的强化程度最高，其次是中肺野和上肺野，肺野内带较肺野外带的强化程度高。分别量化肺各区域的¹⁹F信号强度并进行统计分析(图2G)，结果显示肺各区域的¹⁹F信号强度差异有统计学意义(P＜0.01)。其中上肺野和中肺野之间的¹⁹F信号强度差异无统计学意义(P＞0.05)，上肺野和下肺野之间、中肺野和下肺野之间的¹⁹F信号强度差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

       研究经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针的肺内代谢时间，分别在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h时间点进行¹H/¹⁹F-MR成像，发现雾化全氟化碳纳米探针进入肺内后，在48 h时间点的成像中未见强化(图2F)。对上述各时间点¹⁹F-MR信号强度进行统计分析，结果显示¹⁹F-MR增强信号自全氟化碳纳米探针递入至肺内后稳定持续约4 h，在8 h检测时间点¹⁹F-MR信号开始减弱，24 h显著减弱，48 h信号减至背景噪声水平(图2H)。

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图2  经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后所采集的¹H/¹⁹F-MR图像及¹⁹F信号强度统计图。A：递送不同剂量雾化全氟化碳纳米探针时的¹H/¹⁹F-MR图像；B：各剂量MR图像中所测得的¹⁹F信号强度统计图；C：m-cssi-3D序列采集的¹⁹F 3D MR灰阶图像(从编号1至编号18的每幅图是3D连续动态图像的分解图)；D：m-cssi-3D序列采集的¹⁹F 3D MR伪彩图像；E：m-cssi-3D序列采集的¹⁹F 3D MR重建伪彩图像；F：经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h的¹H/¹⁹F-MR图像；G：经呼吸道递送75 μL雾化全氟化碳纳米探针时，肺各区域的¹⁹F信号强度统计图；H：各时间点¹H/¹⁹F-MR图像中¹⁹F信号强度统计图
Fig. 2  ¹H/¹⁹F-MR images collected after delivering aerosolized perfluorocarbon nanoprobe through the respiratory tract and ¹⁹F signal strength statistics chart. A: ¹H/¹⁹F-MR images when delivering different doses of atomized perfluorocarbon nanoprobe. B: Statistical graph of the ¹⁹F signal intensity measured in the MR image of each dose. C: ¹⁹F 3D MR grayscale image collected by m-cssi-3D sequence (each image from number 1 to number 18 is an exploded view of 3D continuous dynamic images). D: ¹⁹F 3D MR pseudo-color image collected by m-cssi-3D sequence. E: ¹⁹F 3D MR reconstructed pseudo-color images collected by m-cssi-3D sequence. F: ¹H/¹⁹F-MR images of 0 h, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h after delivering the atomized perfluorocarbon nanoprobe through the respiratory tract. G: Statistical graph of ¹⁹F signal intensity in each area of the lung when 75 μL aerosolized perfluorocarbon nanoprobe is delivered through the respiratory tract. H: Statistical graph of ¹⁹F signal intensity in ¹H/¹⁹F-MR image at each time point.

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表1  小鼠递送雾化全氟化碳纳米探针后肺内的MR信号强度(n=3)
Tab. 1  MR signal intensity in the lungs of mice delivered with aerosolized perfluorocarbon nanoprobe (n=3)

2.3 组织水平实验

2.3.1 肺组织荧光成像实验

       通过肺组织切片验证雾化全氟化碳纳米探针在肺组织的沉积，经呼吸道递送全氟化碳纳米探针后取小鼠离体肺组织制作成冰冻切片并进行荧光成像实验，图3A显示经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后，肺组织切片可以观察到全氟化碳纳米探针沉积。

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图3  组织水平实验结果。A：经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后肺组织切片的荧光成像，其中红色荧光为全氟化碳纳米探针，蓝色荧光为细胞核，比例尺为100 μm，放大倍数10×；B：对照组和经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针组的小鼠体重变化。C：经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针各主要器官H&E染色，放大倍数为20×
Fig. 3  Organizational level experimental results. A: Fluorescence imaging of lung tissue slices after delivery of aerosolized perfluorocarbon nanoprobes through the respiratory tract. The red fluorescence is PFOB NP. The blue fluorescence is nucleus. The scale bar is 100 μm, and the magnification power is 10×. B: Changes in body weight of mice in the control group and the group that delivered aerosolized perfluorocarbon nanoprobes through the respiratory tract. C: H&E staining of the main organs of aerosolized perfluorocarbon nanoprobes delivered through the respiratory tract. The magnification power is 20×.

2.3.2 雾化全氟化碳纳米探针的生物安全性

       纳米探针的安全性是其生物医学应用的关键，因此在经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后，于48 h分别取肺、心、肝、脾、肾等组织进行H&E染色，结果显示各组织未见明显损伤和形态学改变(图3C)。经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针后，对小鼠进行体质量监测，结果显示在应用雾化全氟化碳纳米探针后，小鼠体质量无明显变化(图3B)。

3 讨论

       MR肺通气成像通过成像探针随呼吸系统内气流运动所表现出的对比增强作用描绘肺部解剖结构的同时，利用增强信号反映肺局部气流运动的信息。本研究中采用雾化的全氟化碳纳米粒子作为成像探针，经呼吸道递送后随气流运动。我们获得了双肺明显增强的小鼠肺部¹H/¹⁹F-MR图像，这说明所用的成像探针能随气流经各级支气管进入肺泡，从而在肺各区域广泛分布。

       3D磁共振成像是一种能全方位、多角度在体展示解剖、生理、病理信息的一种MR成像技术。本研究的3D MR成像中显示，主支气管、肺尖、肺底、肋膈角等处均见¹⁹F-MR信号增强，且肺各区域的强化程度不同，距离主支气管最近的肺门附近强化程度最高，中肺野和上肺野强化较高，下肺野尤其是近肋膈角处强化程度明显降低。量化肺各区域的¹⁹F-MR信号强度，发现肺各区域之间的信号强度存在差异，其中上肺野和中肺野之间的信号强度并无明显差异(P＞0.05)，上肺野和下肺野之间、中肺野和下肺野之间的信号强度有显著差异(P＜0.01)。产生这种信号差异的原因主要与呼吸系统解剖特点有关，即气流由主支气管进入肺内，随各级支气管到达肺泡，左右主支气管为一级支气管，分支为各肺叶支气管，进入肺叶后分支成各肺段支气管，直至依次再分支为小支气管、细支气管和终末细支气管等，各级支气管管径粗细不均，由上一级至下一级逐渐变细，肺野内带支气管较肺野外带支气管管径粗。因此生理情况下肺各区域的通气率分布并不均匀^[21]，其中左右主支气管位于中肺野，因此该区域通气率较其他区域高，雾化全氟化碳纳米探针更容易随气流到达该处，进而¹⁹F信号强化最明显，而近肋膈角处的下肺野外带由于其所含支气管分级较低，雾化全氟化碳纳米探针沉积较少，导致¹⁹F信号强化程度相对较弱。这表明雾化全氟化碳纳米探针不仅能使双肺增强、描绘肺部解剖信息，还可以通过¹⁹F信号强度的分布反映肺通气功能信息。在以往的研究中有学者利用雾化钆或氟化气体肺MR成像反映生理状态下的肺通气情况，其结果与本实验研究结果一致，即MR肺通气成像能描绘对比剂在肺内的分布，MR信号能反映区域肺通气信息，且肺各区域MR信号的强化程度有所差异^[22,23]。因此，雾化全氟化碳纳米探针多核¹H/¹⁹F-MR肺通气成像解决了肺部一直以来因解剖特点而MR应用受限的难题，为MR肺通气成像提供了新的成像探针，同时也拓展了经呼吸道递送纳米探针肺部成像的研究方向，为后续该方向的深入研究奠定基础。

       在本研究中，肺组织切片荧光成像观察到代表全氟化碳纳米探针的红色荧光，表明该给药方案中，雾化全氟化碳纳米探针能有效沉积于深层肺组织。H&E染色显示各器官未见异常病理损伤。这表明该探针具有良好的生物安全性，为该成像方案进一步研究和临床转化提供了数据基础。

       本文也存在一定局限性，未深入研究该种给药方案在生物体内微环境的情况，包括细胞和因子的防御性免疫反应、代谢途径和机制等。因此，在后续研究中将单独立题，充分而全面地研究所用纳米探针经呼吸道递送的代谢机制及安全性评价，为拓展该探针的研究内容和实现临床转化提供数据支持。

       综上所述，经呼吸道递送雾化全氟化碳纳米探针多核¹H/¹⁹F-MR肺通气成像能反映健康小鼠肺部解剖结构和生理情况下的肺通气信息，可以实现MR肺通气成像，并且有望在呼吸系统疾病的早期影像诊断中发挥重要作用，是国际上基于雾化全氟化碳纳米探针¹H/¹⁹F-MR肺通气成像可行性的罕见报道，为后续研究兼具精准诊疗功能和多模态肺通气成像的全氟化碳纳米探针奠定数据基础。利用多核¹H/¹⁹F-MR技术解决了单一氢质子MR肺成像的局限性难题，提出了新的MR肺通气成像探针，丰富了MR 肺通气成像策略，对慢性呼吸系统疾病早发现、早诊断、早治疗具有重要意义。