直肠癌(rectal cancer，RC)是最为常见恶性肿瘤之一，根据美国2017年癌症报告，结直肠癌占男性和女性恶性肿瘤9%和8%，具有较高的病死率，为男性和女性癌症相关死亡的第二位和第三位^[1]。近年来，随着对直肠癌发病机制和分子特征的深入研究，认识到直肠癌患者KRAS基因状态与抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)单抗疗效具有相关性^[2]。KRAS基因突变可导致EGFR信号通路持续激活，加速肿瘤细胞增殖，从而使抗EGFR药物治疗无效^{[3, 4, 5]}，但是抗EGFR单抗治疗对KRAS基因野生型的RC有效^[6]，因此，RC的KRAS基因表型对临床肿瘤患者的个性化治疗有重要意义。目前临床上对KRAS基因状态的明确主要依赖组织标本的免疫组化或基因分析，组织标本获得主要通过有创方法获得，而且基因检测费时、价格昂贵。近年来，伴随计算机技术和人工智能算法的进步发展起来的影像组学在疾病的检出、分类和定量评估取得一定的进展，成为研究热点^{[7, 8]}。有研究表明，基于MRI或CT的影像组学对RC的淋巴结转移和治疗反应能达到较高的诊断效能^{[9, 10, 11]}。本研究旨在评估多参数MRI对于RC的KRAS基因突变的预测效能，从而建立无创、便捷、在体评价直肠癌KRAS基因突变的影像学生物学标记，为临床治疗方案选择和个性化治疗提供一种在体无创可反复获得的方便的技术手段。

1 材料与方法

1.1 一般资料

       本研究经过暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院伦理委员会批准(批准文号：LL-KT-201801118)，免除受试者知情同意。在医院信息系统(hospital information system，HIS)中检索2019年4月至2010年12月间160例经手术病理证实RC且术前3个月内行直肠MRI检查患者。纳入标准：(1)术前在我院行MRI检查，且诊断为直肠癌；(2)在我院行手术治疗，且术后诊断为直肠癌、有明确病理分期和KRAS基因表型检测结果；(3)检查前肠道准备充分；(4)在术前MRI与手术间未接受放疗、化疗等任何治疗手段。排除标准：(1) MRI检查前接受放化疗等治疗后的患者；(2)肠道准备不充分、MR图像上病灶显示不明显。最后104例纳入本研究，其中男63例，女41例，年龄(60.68±12.74)岁。

1.2 MRI检查

       检查前一晚嘱患者少吃产渣食物，检查当日禁食，检查前2 h开始分次缓慢口服20%甘露醇2000 mL (250 mL加1750 mL水)，患者排便2～3次后开始检查，检查前10 min肌注654-2 (10 mg)。全部患者在3.0 T MR系统(Magnetom Skyra，Siemens Healthcare，Erlangen，德国)采用包含直肠轴位和矢状位高分辨T2WI和直肠轴位DWI和盆腔的动态增强的直肠MRI方案。高分辨率T2加权成像参数如下：重复时间(TR) 3000～4200 ms；回波时间(TE) 83～101 ms；层厚3 mm；视野(FOV) 220～280 mm；矩阵，(381×448)～(435×512)。DWI采用rosolve技术获得高空间分辨率扩散加权图像，参数：TR 5800～7030 ms；TE 61 ms；层厚3 mm；FOV 220 mm×230 mm；矩阵116×116；b值分别为0和1000 s/mm²。ADC图采用单指数模型由MRI系统自动根据0和1000 s/mm²两个b值生成。使用钆喷酸葡胺对比剂(Gadopentetate Dimeglumine Injection，生产厂家：北京北陆药业股份有限公司)进行直肠轴位T1 vibe多期动态增强序列，参数：TR 4.2 ms；TE 2 ms；翻转角12°；层厚2 mm。

1.3 组织病理学分型

       肿瘤的手术切除标本经常规病理学检查处理后，制作成石蜡包埋组织样品，切片后取蜡块中部含肿瘤细胞部分立即进行KRAS基因突变检测。

1.4 肿瘤分割和影像组学特征提取

       将DICOM格式图像从PACS下载到PC。由1名有经验的放射科医生采用开源的ITK-SNAP手工逐层勾画RC病灶，获得全肿瘤的感兴趣区(region of interest，ROI)。勾画过程中，以DWI为参照，根据病灶的边界，分别在直肠轴位高分辨T2WI、动态增强动脉期T1WI (contrast-enhanced T1WI，CE-TIWI)和ADC图上画出肿瘤ROI。采用开源的Pyradiomics根据原始图像和经过ITK-SNAP处理后的图像提取RC的107个影像组学特征，包括14个形态特征(shape-based)，14个灰度相关矩阵特征(gray level dependence matrix，GLDM)，24个灰度共生矩阵特征(gray level co-occurrence matrix，GLCM)，18个一阶统计特征(first order statistics)，16个灰度游程矩阵特征(gray level run length matrix，GLRLM)，16个灰度区域大小矩阵特征(gray level size zone matrix，GLSZM)，5个邻域灰度差矩阵特征(neighborhood gray-tone difference matrix，NGTDM)。

1.5 统计学处理

       采用SPSS 23.0统计学软件和R语言4.2.2版本(http://www.Rproject.org)进行统计学处理，P＜0.05认为差异有统计学意义。应用t检验、χ²检验或Mann-Whitney秩和检验分析性别、年龄、CEA、CA125、CA199、EMVI、T分期等临床病理特征和影像组学特征与KRAS基因突变的相关性。将104例患者按0.7∶0.3的比例随机分为训练集和验证集。为消除不同特征尺度的影响，在训练集和验证集分别对特征进行归一化(normalization)。在训练集中对单因素分析有统计学意义的变量采用LASSO (least absolute shrinkage and selection operator)回归算法和5折叠交叉验证进一步特征选择和构建影像组学信号(radiomics signatue)预测直肠癌KRAS基因突变。影像组学信号在训练集和验证集中对KRAS基因突变的预测效能采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线下面积(area under the curve，AUC)，并采用DeLong法进行比较。详细过程见图1。

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图1  直肠癌MRI特征提取及构建KRAS基因突变预测模型
Fig. 1  MRI feature extraction of rectal cancer and construction of KRAS gene mutation prediction model.

2 结果

2.1 临床病理特征

       104例直肠癌患者中，检测存在KRAS突变(突变型组)有62例(59.6%)，其中女22例、男40例；KRAS为野生型(野生型组) 42例(40.4%)，其中女19例、男23例。KRAS突变型组和野生型组临床病理特征见表1。两组间临床病理特征(年龄、性别、病理学T分期、EMVI、CEA、CA125、CA19-9)差异均无统计学意义(P＞0.05)。

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表1  104例直肠癌患者临床特征
Tab. 1  Clinicopathological chracteristics of the 104 patients with RC

2.2 影像组学信号的建立和预测模型的验证

       321个影像组学特征经单因素分析发现有16个特征有统计学意义(P＜0.05；表2)；在训练集中LASSO回归筛选出7个特征λ系数(压缩系数)非零特征(包含4个CE-T1WI和2个ADC图的特征；表3)。构建的影像组学信号KRAS突变型高于野生型(1.19±0.63与0.53±0.53，t=3.94，P＜0.001) (图2)。在训练集和验证集的ROC分析中，AUC分别为0.81 (95% CI：0.70～0.92)、0.77 (95% CI：0.63～0.91)，分别精确为0.78、0.71，敏感度均为0.76，特异度分别为0.83、0.67，两者间差异无统计学意义(P=0.60) (图3)；其中ADC特征中的一阶偏度的λ系数最大为3.36。

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图2  不同KRAS突变状态的直肠癌患者的MRI图像。图2A～D：男，51岁，KRAS突变型，A、C为CE-T1WI像，B、D为ADC图像；E～H：男，60岁，KRAS野生型，E、G为CE-T1WI图像，F、H为DWI图像
Fig. 2  MRI images of rectal cancer patients with different KRAS mutation status. Figure A—D: Male, 51 years old, KRAS mutant. Figure A, C are CE-T1WI images. Figure B, D are ADC images. Figure E—H: Male, 60 years old, KRAS wild type. Figure E, G are CE- T1WI images. Figure F, H are DWI images.

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图3  影像组学信号在训练集与验证集中预测KRAS基因突变的ROC曲线。训练集曲线下面积(AUC)为0.81，验证集AUC为0.77
Fig. 3  ROC curve of radiomics signature for prediction of KRAS gene mutation in training and validation sets. ROC under training sets is 0.81, ROC under validation sets is 0.77.

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表2  单因素分析筛选的16个有统计学意义影像组学特征
Tab. 2  Sixteen statistically significant imaging features selected by univariate analysis

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表3  在训练集中LASSO回归筛选的7个λ系数非零影像组学特征和其临床意义
Tab. 3  Seven radiomic features with λ coefficiences other than zero selected by LASSO regression for prediction of KRAS gene mutation and their clinical meanings

3 讨论

       本研究中，检测直肠癌患者KRAS突变约59.6%，经过单因素分析结果显示直肠癌KRAS突变状态与部分直肠癌CE-T1WI及ADC特征相关，其中包括10个CE-T1WI特征、6个ADC特征。Xu等^[12]和Yeo等^[13]研究结果也表明，扩散加权磁共振成像和动态对比增强成像的MR影像特征与直肠癌的KRAS突变状态相关。年龄、性别对于直肠癌KRAS突变的差异无统计学意义，与姜雪琴等^[14]的研究结果一致；此外，病理学T分期、EMVI、CEA、CA125、CA19-9等临床特征对于直肠癌KRAS突变的差异亦均无统计学意义。

       经过单因素分析筛选出来的16个有统计学意义的特征再经过LASSO回归降维，7个特征λ系数不为0，包含5个CE-T1WI纹理特征(灰度大区域分布、灰度尺寸区域不均匀标准化、灰度区域强度差异、相邻灰度色调差异矩阵强度、形状短轴长度)和2个ADC图纹理特征(一阶偏度、形状伸长率)，其中突变型KRAS患者的CE-T1WI纹理特征灰度大区域分布、灰度区域强度差异、形状短轴长度和ADC图纹理特征形状伸长率均高于野生型KRAS患者，而CE-T1WI纹理特征灰度尺寸区域不均匀标准化、相邻灰度色调差异矩阵强度和ADC图纹理特征一阶偏度则低于野生型KRAS患者，国内也有研究结果显示部分形态特征在KRAS突变状态方面表现出显著差异^{[14, 15]}。本研究的结果与Cui等^[16]的研究结果均显示在KRAS突变与高阶放射学特征形状短轴长度、灰度区域强度差异和灰度大区域的值越高表示更多的肿瘤异质性和更高的KRAS突变风险。

       进一步通过测试集和验证集进行内部验证预测KRAS突变，获得测试集和验证集的ROC曲线，AUC值分别为0.81、0.77，且测试集和验证集的差异无统计学意义，也表明了本研究所构建的预测模型具有可靠性和可重复性。7个与KRAS突变相关纹理特征中的ADC纹理特征一阶偏度的λ系数最高为3.36，对影像组学信号贡献最大。突变型KRAS患者的ADC特征的一阶偏度低于野生型，虽然KRAS突变型和野生型的RC的ADC值均为正偏态，而且突变型的偏态值低于野生型，但归一化值突变型高于野生型，说明相对野生型，突变型偏度较高RC更多，即肿瘤细胞更趋向不均匀。作为可以在体观察和定量评价水分子扩散状态的MR重要成像技术，DWI在病变检出、良恶性肿瘤鉴别及治疗反应评估起着重要作用。由于人体内水分子扩散是非高斯分布，基于多指数模型DWI的参数(如DKI或IVIM)或ADC值组织直方图特征在预测RC的KRAS突变有较高的诊断价值^[12，17]。有研究表明KRAS突变的肿瘤组织的ADC值更低，这是可能是因为KRAS图像与血管生成的速率及肿瘤血管化之间可能有关，高度血管化的肿瘤通常更具侵袭性，导致肿瘤生长更快，并具有更高的转移潜力，导致肿瘤组织的ADC值降低^{[18, 19]}。本研究结果与Cui等^[16]采用组织直方图观察ADC值分布特征表明KRAS突变型RC的ADC值的四分位数和中位数均低于野生型。另外一个λ系数较高的特征是灰度大区域分布，主要反映ROI的纹理粗糙程度，值越高，说明纹理越粗糙。本组资料观察到，KRAS突变型的RC的CE-T1WI上灰度大区域分布高于野生型，说明KRAS突变型RC强化更不均匀。进一步采用LASSO回归特征选择，基于CE-T1WI的5个特征和ADC的2个特征的λ系数不为0，并以此构建影像组学信号KRAS突变型高于野生型(1.19±0.63与0.53±0.53，t=3.94，P＜0.001)，预测KRAS基因的AUC在训练集和验证集分别为0.81、0.77，显示预测性能良好。

       本研究仍存在以下几点不足：首先，本研究是一项回顾性研究，入选患者为手术治疗的患者，因此，存在一定的病例选择偏倚；其次，本研究样本量较小，而且为单中心的研究，没有在外部验证集中检验模型的泛化能力；再次，由于采用手工勾画肿瘤ROI，部分序列图像上病灶较难显示，从而导致病灶勾画欠精准；另外，目前的影像组学特征有一定的局限性，可能不包含与KRAS基因表型相关的重要的数字特征。近年来进行影像学研究的深度学习预测模型，通过神经网络算法探索数字医学图像与疾病的临床表型的相关性有望克服这一缺陷^{[20, 21]}。

       总之，本项研究初步通过影像组学深度挖掘多参数MRI特征，观察到多个组学特征与RC的KRAS基因表型具有相关性，有助于为KRAS基因突变的预测提供无创的生物学标记。