肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为我国第四位常见恶性肿瘤及第三位致死肿瘤。世界报道的HCC病例中，我国占约55%，因HCC而死亡患者中，有45%～50%亦发生在我国，因而严重威胁着我国人民的生命和健康^[1,2]。肝细胞癌是富血供肿瘤，具有强大的诱导肿瘤血管生成能力，血管越丰富，患者预后越差^[3]。因此，肿瘤新生血管已成为抗HCC药物作用的靶点之一，对于巴塞罗那肝细胞癌分期晚期或复发的HCC患者，抗血管生成为重要治疗手段^[4]。我国传统医学中的一种产品化的中药——华蟾素能够用于抗中晚期恶性肿瘤血管生成的治疗^{[5, 6]}。肿瘤血管生成一直是肿瘤生长和转移的关键，且与预后密切相关，目前评价肿瘤内血管生成公认的“金标准”是病理学上通过穿刺或手术获得组织标本并通过血管免疫组化染色及定量测量得到的肿瘤微血管密度(micro-vessel density，MVD)，但该法属于有创检查，而且容易受取材部位、操作者水平等的影响出现偏移。随着磁共振磁敏感加权成像(susceptibility-weighted imaging，SWI)和特殊对比剂超微超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)技术的发展，肿瘤内血管亦能被定量或者半定量评估^{[7, 8]}，使得无创且客观地评价肿瘤内血管量成为可能。因此本研究的目的是通过USPIO增强三维磁敏感加权成像(three dimensional-susceptibility-weighted imaging，3D-SWI)来活体评价华蟾素抗裸鼠原位HCC肿瘤内大血管生成的有效性。

1 材料和方法

1.1 动物模型制作

       本实验研究经过复旦大学附属中山医院实验动物管理委员会批准(批准日期：2017年4月10日)。

       建立裸鼠原位HCC-LM3模型：首先无菌条件下将HCC-LM3细胞(5×10⁶/0.2 mL/site)注入周龄为4～6周且体质量为23～25 g的1只雄性BALB/C裸小鼠(购自中国科学院上海药物研究所)左中外侧腋下皮肤下后饲养。当肿瘤生长到长径超过1 cm，将肿瘤取下并切成1 mm³大小的瘤块若干分别接种入16只雄性BALB/C裸小鼠肝左叶包膜下后饲养21天。随后，荷瘤裸小鼠被随机分成2组，分别为华蟾素治疗组和生理盐水对照组，每组8只。其中华蟾素治疗组荷瘤裸鼠每天腹腔注射华蟾素注射液(安徽华润金蟾药业股份有限公司，规格5 mL×10支/盒) 0.2 mL，生理盐水对照组荷瘤裸鼠每天腹腔注射0.9%的生理盐水0.2 mL，共干预20天。

1.2 磁共振扫描

       干预后的第21天，所有荷瘤裸鼠用3%戊巴比妥钠按40 mg/kg的剂量经腹腔麻醉后，俯卧位固定于专用动物架上，行3.0 T MRI (MAGNETOM Skyra；西门子医疗，埃朗根，德国)扫描，使用8通道小动物线圈(晨光，上海，中国)。先行常规磁共振扫描，序列和参数如下：横断位T2WI快速自旋回波序列(重复时间/回波时间4000/65 ms；视野100 mm；翻转角150°)，冠状位T2WI快速自旋回波序列(重复时间/回波时间4000/70 ms；视野100 mm；翻转角150°)和横断位T1WI快速自旋回波序列(重复时间/回波时间480/11 ms；视野100 mm；翻转角131°)，扫描时间分别为1 min 56 s、2 min 28 s和2 min 4 s。

       3D USPIO增强横断位SWI序列参数为：重复时间/回波时间205/10 ms；矩阵200×320；层厚1 mm；层间距0.2 mm；体素0.2×0.2×1 mm³；视野120 mm；翻转角20°；带宽380 Hz/Px；扫描时间，5 min 25 s。使用自动校准部分并行采集技术，加速因子2。所有荷瘤裸鼠用8 mg/kg剂量的USPIO (铁晶粒尺寸为6.1 nm，水合粒径最大至20 nm，上海交通大学生物工程学院Med-X研究所提供)用4.5号静脉输液针经荷瘤裸鼠尾静脉以0.1 mL/s的速率团注。注射完毕后经过5 min，等待USPIO在血液中稳态分布后，行SWI扫描。原始图像扫描结束后在线获得SWI后处理图像，包括幅度图、相位图、最小密度投影图和SWI图。

1.3 磁敏感加权图像评价

       所有评价均在后处理获得的SWI图像上进行^{[7, 8]}。荷瘤裸鼠的图像分别由具有14年和18年肝脏MRI诊断经验的放射科副主任医师在西门子后处理工作站上进行评价。该2名副主任医师均不知具体荷瘤裸鼠分组和病理情况。他们先浏览常规MRI图像，包括T1WI、T2WI，目的是观察有无明显的肿瘤内出血。然后，该2名副主任医师在USPIO增强SWI上对肿瘤内磁敏感信号(intratumoral susceptibility signal，ITSS)计数后进行评分，一个月后经验为18年的副主任医师进行ITSS的第二次评价。ITSS被定义为SWI图像中肿瘤连续层面上均可追踪到的上下延续的低信号沙砾或点状结构，或一个层面上呈前后、左右分布的线样或弧形结构、沙砾或点状结构以及点状与线样或与弧形相混合^[8]。这些结构在常规MRI序列上不可确切显示。SWI上肿瘤内较大颗粒状低信号，同时T2WI低信号，和/或T1WI上高信号，并且不能前后层面追踪，可能是出血成分，在计数和评分时需不计入在ITSS内。不连续模糊或淡片状的低信号结构也需排除。在肿瘤中心层面进行ITSS评分，采用0～5分法：0分，无ITSS；1分，1～5个；2分，6～10个；3分，11～15个；4分，16～20个；5分，等于或大于21个ITSS。

1.4 肿瘤体积测量

       肿瘤体积在USPIO增强SWI序列上进行。荷瘤裸鼠肿瘤于该序列上以相对高信号为主，肝脏则为低信号，因此两者能够清楚地区分开来。由一名具有10年MRI使用经验的主管技师将该序列导入西门子syngo.via VB10 软件，在肿瘤的每一个层面沿着肿瘤边缘用手绘模式描绘出肿瘤边界，然后自动计算获得肿瘤体积。

1.5 组织学检查

       荷瘤裸鼠MRI扫描结束后，立即处死，剥离肿瘤连同肝脏组织放入10%的缓冲甲醛溶液中，固定24 h以上。依据SWI层厚，切取肿瘤中央约1 mm的组织包埋在石蜡中再切成3 μm厚度的薄片用于组织学检查。行苏木精伊红(hematoxylin eosin，HE)染色观察肿瘤组织及细胞一般形态及结构情况。行免疫组织化学抗CD31染色(一抗，Abcam，剑桥，英国)观察肿瘤内血管情况。肿瘤MVD获取方法：所有抗CD31染色切片使用Aperio ScanScope和Leica SCN400 (Leica生物系统；伊利诺伊州，美国)全景扫描后存储为大约500～700 MB大小的Aperio scn文件，接着传输到电脑，使用SlidePath Gateway Client软件(Leica生物系统)在3840×2160像素的屏幕分辨率下进行血管计数^[9]。具体步骤：由一名具有5年从事肝癌研究经验的医师在不知荷瘤裸鼠具体分组和影像学结果的情况下，首先在全景图低倍放大(4×和10×)的条件下浏览切片，分别找到5个抗CD31染色阳性血管最密集区域(热点)；然后将每个热点相应的区域放大到最高倍(40×)条件下，选取血管数量最多区域分别进行人工血管计数，取均值，获得该肿瘤的MVD。

1.6 统计分析

       根据前期研究ITSS治疗前后的数值^[7]，在遵循“3R”——替代(replacement)、减少(reduction)、优化(refinement)的原则下，按照https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/research/sample-size-calculations-iacuc估算实验动物样本量。

       统计学处理采用SPSS 18.0 (IBM，纽约，美国)软件完成。计量数据用(均数±标准差)表示；等级资料用中位数(P25，P75)表示。Mann-Whitney U检验用于评估两组USPIO增强SWI图像上ITSS评分、肿瘤体积以及病理切片的肿瘤MVD。Spearman等级相关检验用于分析ITSS评分与MVD和肿瘤体积的相关性。相关程度通过相关系数(r)来判断：0≤|r|＜0.2不相关；0.2≤|r|≤0.4低度相关；0.4＜|r|≤0.6中度相关；0.6＜|r|≤0.8高度相关和|r|＞0.8极度相关。通过计算Kappa值获得观察者间和观察者内ITSS评分一致性评价。所有P均为双尾，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

       入组裸鼠原位HCC-LM3模型样本量估算：α取0.05、β取0.2，即以80%的概率达到P＜0.05的统计显著性所需的动物数量为16只，即华蟾素治疗组和生理盐水对照组各8只。

       荷瘤裸鼠干预过程中，华蟾素治疗组死亡3只(3/8，37.5%)，生理盐水对照组死亡1只(1/8，12.5%)。华蟾素治疗组荷瘤裸鼠死亡原因分别为肝弥漫性出血和肿瘤腹腔弥漫性转移。生理盐水对照组荷瘤裸鼠死亡原因为肿瘤腹腔弥漫性转移，在后续存活荷瘤裸鼠取瘤过程中发现生理盐水对照组1只亦出现肿瘤腹腔弥漫性转移。其余荷瘤裸鼠均未发现肿瘤腹腔弥漫性转移和肝脏弥漫性出血。

       肝脏成像序列在12只存活荷瘤裸鼠中顺利完成，获得图像没有明显的伪影(华蟾素治疗组5只，生理盐水对照组7只)。所有荷瘤裸鼠HCC肿瘤呈类圆形或类椭圆形，在TIWI上呈稍低信号，T2WI上呈稍高信号，SWI由于肝实质吸收USPIO后信号下降呈低信号，肿瘤表现为相对高信号。肿瘤内出血表现为点、片状T1WI高，T2WI、SWI低信号影。生理盐水对照组中1只荷瘤裸鼠、华蟾素治疗组中2只荷瘤裸鼠肉眼可见肿瘤内出血灶，于评估ITSS时这些出血灶未计入在内。

       华蟾素治疗组肿瘤ITSS评分显著低于生理盐水对照组(表1，图1)。华蟾素治疗组肿瘤体积与生理盐水对照组相比未见明显差异(表1)。华蟾素治疗组肿瘤MVD显著低于生理盐水对照组(表1，图2)。

       2组12只荷瘤裸鼠ITSS评分与肿瘤MVD高度正相关(r=0.647，P=0.022)；与肿瘤体积高度正相关(r=0.645，P=0.023)。2组12只荷瘤裸鼠肿瘤的ITSS评分观察者间和观察者内Kappa值分别为0.745 (P=0.0002)和0.750 (P=0.0001)。

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图1  HCC USPIO增强SWI显示生理盐水对照组 (A)和华蟾素治疗组(B)裸鼠原位肝细胞癌肿瘤内ITSS (白箭)评分分别为5和4，华蟾素治疗组(B)肿瘤ITSS明显少于生理盐水对照组(A) 图2　CD31免疫组化染色显示生理盐水对照组(A)和华蟾素治疗组(B)裸鼠原位肝细胞癌肿瘤内微血管(棕色)，华蟾素治疗组(B)肿瘤微血管数明显少于生理盐水对照组(A)，图像放大40倍
Fig. 1  Intratumoral susceptibility signal intensity (ITSS) (white arrows) in the cinobufacini treated and saline control tumors on USPIO-enhanced SWI. In the treated tumors, ITSS is scored as grade 4 (B), and in the saline control tumors, ITSS is scored as grade 5 (A). Fewer ITSSs are noted in the treated tumors(B) than the saline control group (A). Fig. 2　Anti-CD31 immunohistochemistry staining shows brown tumor vessels of saline control group (A) and cinobufacini treated group (B) (magnification×40). Fewer tumor vessels are noted in the treated group (B) than the saline control group (A).

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表1  生理盐水对照组与华蟾素治疗组主要指标比较
Tab. 1  Comparison of main indexes between cinobufacini treated group and saline control group

3 讨论

       通过活体USPIO增强SWI MRI成像，本实验研究发现裸鼠原位HCC-LM3模型经华蟾素治疗后ITSS显著减少，并且所有荷瘤裸鼠HCC-LM3的ITSS评分与病理MVD正相关。与生理盐水对照组相比，华蟾素治疗组肿瘤体积在未见明显缩小的情况下，ITSS和MVD均减少，因此本实验发现华蟾素能够早期抑制HCC肿瘤内大血管生成。

3.1 USPIO增强SWI MRI成像评估HCC肿瘤内血管的可行性

       肿瘤细胞的增殖离不开肿瘤血管的生成。经过一段时间，肿瘤内“早期”血管生成和“晚期”血管形成共存，分别对应“微血管”与“大血管”^{[10, 11]}，两者在肿瘤功能血管网中均必不可缺。评估抗肿瘤血管生成是否有效，不但是微血管，监测肿瘤内大血管也至关重要。然而，与正常组织的血管不同，肿瘤血管在形态学上和生物学上均不成熟，因而血管通透性较正常血管也高^[12]。大分子对比剂USPIO颗粒体积较大，不容易从血管壁扩散至细胞外间隙，我们的前期研究显示USPIO增强SWI MRI中的ITSS能较好地反映裸鼠原位HCC肿瘤内大血管的情况^[8]，并能够活体无创监测HCC大血管经靶向药物抗血管生成的疗效^[7]。因此，代表肿瘤内大血管的ITSS是一种有效反映肿瘤内血管的影像学指标。目前，SWI ITSS半定量评估已成功用于胶质瘤分级，Bhattacharjee等^[13]经过改良使用定量法ITSS血管容积(ITSS vasculature volume，IVV)排除了肿瘤内出血的影响，进一步提高了胶质瘤的分级的敏感度及特异度。Deguchi等^[14]研究发现ITSS还可用于预测中枢神经系统原发性淋巴瘤治疗前对化疗的反应。本实验研究中使用顺磁性大分子对比剂USPIO进行SWI MRI增强，较常规SWI更容易识别肿瘤内ITSS，进一步提高半定量评估的准确度。通过本实验，我们发现USPIO增强SWI MRI新技术可以作为一种有效评价华蟾素抗肿瘤内大血管的新方法，值得进一步开发和研究。

3.2 华蟾素抑制肝癌血管的生成。

       目前，治疗HCC靶向抗血管生成的药物主要为仑伐替尼或索拉非尼。然而有研究指出这些药物的运用并没有明显改善一部分患者的预后情况，还产生了耐药性^[15,16]。我国传统医学中重要组成部分——中药，被用于抗恶性肿瘤血管生成的治疗历史悠久^[17]。例如白花蛇舌草、蝎毒多肽、羟基红花黄色素A、β-榄香烯和华蟾素等多种药物被用于抗HCC血管生成^[18]。其中，华蟾素是一种成药，有研究显示华蟾素联合三氧化二砷能够抗裸鼠人肝癌移植瘤的血管新生，降低肿瘤的MVD^[19]。也有研究指出华蟾素的主要成分——蟾毒灵，能够通过介导经典血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路来加强索拉非尼抗HCC血管生成作用^[18]。本实验研究亦观察到与生理盐水对照组相比，华蟾素治疗组肿瘤体积在未见明显缩小的情况下，ITSS和MVD均减少，证实了华蟾素能够早期抑制HCC肿瘤血管生成。

3.3 华蟾素协同多激酶抑制剂治疗肝癌的潜能

       华蟾素与靶向药多激酶抑制剂在抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等方面具有协同作用。Wang等^[18,21] 研究发现，华蟾素主要活性成分蟾毒灵联合索拉非尼通过靶向调节mTOR/VEGF信号通路，协同抑制肝癌细胞VEGF分泌进而抑制肿瘤血管生成；通过促进索拉非尼诱导的肝癌凋亡相关蛋白Bax，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8的活化，蟾毒灵亦协同索拉非尼抑制肝癌细胞的增殖和促进肝癌细胞凋亡。华蟾素在上述方面表现出来的潜能值得我们今后利用USPIO增强SWI MRI等新技术对其联合靶向药物抗HCC血管形成的协同机制进行进一步深入的活体可视化研究。

3.4 限制性及不足

       本实验研究中，我们发现华蟾素治疗组荷瘤裸鼠的死亡率为37.5%，高于生理盐水对照组，经解剖发现死亡的主要原因是肝脏的弥漫性出血，生理盐水对照组中，虽有一只荷瘤裸鼠有弥漫性腹腔肿瘤转移，但未见肝实质弥漫性出血。经分析华蟾素注射液具有活血化瘀的作用，它的副作用之一就是血小板减少，使用后出血的风险增加^[20]。该结果提示在今后华蟾素抗恶性肿瘤的治疗过程中可能需要监测实验室凝血指标，并适当地增加升血小板的药物。也提示在未来使用华蟾素干预的动物实验中需要扩大样本量或设计相应预案来保证实验的可行性。

       本实验研究具有几方面局限性。首先，裸鼠HCC肿瘤组织切片与SWI的扫描层面可能不完全匹配；由于肿瘤血管异质性，此切面获得MVD也不能完全代表观察肿瘤层面的大血管情况。第二，由于病理组织学技术上的困难，我们目前无法将ITSS在病理上与HCC大血管进行直接比对。此外，免疫组化CD31染色切片上通过在切片最高倍数放大的基础上进行人工MVD计数，也会产生偏移，今后会通过软件测量来增加结果的可靠性。第三，USPIO在SWI上具有放大效应^[22]，所以对ITSS评价只能进行人工半定量分析，而不能直接反映肿瘤大血管的真实数目。第四，虽然荷瘤裸鼠肿瘤内肉眼可见的出血灶在常规MRI序列上已被排除，但肿瘤内微出血和USPIO被巨噬细胞吞噬均有可能影响ITSS评分的准确性。第五，本研究实验动物较少，但因为是动物实验研究，又有肿瘤的病理学结果做对照，本着对动物伦理的遵循和实验动物的有效利用，即“3R”原则，我们认为通过12只裸鼠HCC-LM3模型样本量得出的实验结果具可靠性。第六，本研究未进行治疗前的基线测量，原因在于根据前期研究裸鼠原位HCC-LM3肿瘤的ITSS在21天的时候变化差异不大^[7]。最后，即使细胞株相同，人体HCC与动物模型HCC仍不完全一致，华蟾素的治疗效果也可能会不同，以后需要进一步的临床研究。

       综上所述，通过USPIO增强SWI MRI成像研究，华蟾素能够抑制裸鼠原位肝细胞癌肿瘤内大血管的生成。