肌肉脂肪浸润是多种疾病的主要病理特征，比如糖尿病、衰老、肌肉和肌腱损伤等^{[1, 2, 3]}。有研究表明，肌间脂肪组织(intermuscular adipose tissue，IMAT)含量和肌力、疾病严重程度和进展程度及治疗方式选择等密切相关^{[4, 5, 6, 7]}。因此，定量评估IMAT对肌肉相关疾病的诊断和治疗意义重大。目前，定量评估肌肉脂肪浸润的方法主要有CT值测量、Goutallier分级法、磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy，MRS)、Dixon技术及相关衍生技术等。CT值测量能较准确地分割和定量大腿皮下脂肪(subcutaneous adipose tissue，SAT)和内脏脂肪，但对IMAT分割量化的准确性有待进一步提高^[7]。Goutallier分级法为一种半定量视觉评估方法，易于使用，但主观性较强，观察者间可靠性较差^[8]。MRS能够非侵入性定量测量细胞内脂质含量，但对设备及操作人员要求较高，图像后处理烦琐，临床应用受到一定限制。定量非对称回波的最小二乘估算法迭代水脂分离序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least squares estimation quantification sequence，IDEAL-IQ)所测得的质子密度脂肪分数与MRS一致性较好^{[9, 10, 11]}，但基于IDEAL-IQ扫描所获得的质子密度脂肪分数图的软组织分辨率及空间分辨率较低，增大了对大腿阔筋膜的辨识难度，且临床工作中并非所有的MRI扫描仪都能够进行IDEAL-IQ或其他多点式Dixon扫描。因此，骨骼肌脂肪浸润的准确定量仍是临床上的一大难题。T1WI作为临床常规序列，本研究使用ImageJ在MRI T1WI图像上分割大腿SAT、肌内脂肪(intramuscular fat，IntraMF)和肌间脂肪(intermuscular fat，InterMF)，并探究该方法定量结果的准确性和稳定性，以期在日常临床工作中即可完成对肌肉脂肪浸润的准确定量。

1 材料和方法

1.1 研究对象

       2019年1月至2020年7月于昆明医科大学第一附属医院前瞻性收集28名志愿者，包括14名2型糖尿病患者(男女各7名)，14名与T2DM组年龄匹配的健康志愿者(男女各7名)。年龄43～62 (52±5.4)岁，BMI 19.83～31.14 (23.9±3.0) kg/m²。收集受试者的空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、身体质量指数(body mass index，BMI)。本研究经昆明医科大学伦理委员会批准(伦理编号：2018-L-86)，全体受试者均签署了知情同意书。

1.2 MR扫描

       所有志愿者均在GE 3.0 T (Discovery 750W，美国) MR扫描仪上进行左侧大腿中部区域的扫描，采用体部16通道相控阵线圈。线圈中心在大腿中部位置，志愿者双腿并拢，脚尖向上，在受试者左侧小腿部放置泡沫垫以最大限度减少扫描过程中产生的运动伪影。扫描序列包括：轴位：IDEAL-IQ、T1WI FSE；冠状位：T2 IDEAL序列，扫描参数见表1。T2WI冠状位(近端包括双侧股骨头，远端至膝关节)扫描以确认大腿中部位置及排除大腿可能存在的肌肉病变。

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表1  大腿各序列扫描参数
Tab.1  Scanning parameters of each sequence of thigh

1.3 大腿肌肉脂肪分数的测量

       将所有大腿MR扫描图像导入GE后处理工作站ADW4.6，在冠状位上确定大腿中部位置对应的轴位T1WI、脂肪分数图的层数(图1)，将T1WI及脂肪分数图进行匹配。由住院医师A在T1WI图像上进行ROI的勾画，勾画过程中ROI距离肌肉边缘1～2 mm，避免将皮下及肌间脂肪勾入ROI内。记录每块肌肉的脂肪分数(fat fraction，FF) (图2)。

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图1  大腿中部层面定位示意图。在大腿冠状位上确定中间层面，线段1、2均与股骨长轴方向平行，线段1代表大腿全长，近端平齐股骨头，远端至膝关节腔，线段2近端平齐股骨头，远端至线段1中点位置
Fig. 1  MRI scan of thigh and map of middle thigh layer. Identify the medial layer in the coronal position of the thigh, line segments 1 and 2 are parallel to the long axis of the femur. Line segment 1 represents the full length of the thigh, the proximal end is flush with the femoral head, and the distal end reaches the knee cavity, the proximal end of line segment 2 is flush with the femoral head, and the distal end reaches the midpoint of line segment 1.

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图2  各肌肉脂肪分数图上ROI的勾画。A：在与脂肪分数图匹配的T1WI图像上进行ROI的勾画；B：在脂肪分数图上自动生成ROI；C：T1WI与脂肪分数图的融合图像　图3　ImageJ上大腿各区域脂肪的分割。A：大腿SAT外轮廓(箭)及内轮廓(箭头)；B：沿内外轮廓勾画出SAT区域；C：沿SAT内轮廓(黄色)及股骨外缘(绿色)剪去SAT及股骨区域；D：沿肌肉边缘勾画出每一块肌肉轮廓；E：InterMF区域(蓝色)；F：剪去InterMF获得肌肉CSA；G：通过阈值调节，标识出IntraMF(黄色)；H：将SAT、InterMF、IntraMF进行颜色编码，红色：SAT；蓝色：InterMF；黄色：IntraMF　图4　肌萎缩受试者(A、B)与正常组志愿者(C、D) Sth、Sinter及Sintra比较。A、B：肌萎缩受试者，男，43岁，BMI：24.22 kg/m²，Goutallier分级3级；C、D：正常组志愿者，男，43岁，BMI：22.27 kg/m²，Goutallier分级2级；A、C：T1图像；B、D：基于ImageJ 分割的伪彩图，红色：Sth，大腿皮下脂肪面积；蓝色：Sinter，大腿肌间脂肪面积；黄色：Sintra，大腿肌内脂肪面积
Fig. 2  ROI delineation on each muscle fat fraction diagram. A: ROI is delineated on T1WI images matching fat fraction maps; b: Automatically generate ROI on fat fraction graphs; c: Fusion image of T1WI and fat fraction map. Fig. 3　Segmentation of fat in various areas of the thigh by using Image J. A: Thigh SAT external profile (arrow) and internal profile (arrowheads); B: Outline the SAT area along the inside and outside outline; C: Cut the SAT and femur area along the internal contour of the SAT (yellow) and the outer edge of the femur (green); D: Outline each muscle along its edge; E: InterMF region (blue); F: InterMF is cut to obtain muscle CSA; G: IntraMF (yellow) is identified by threshold adjustment; H: Color coding SAT, InterMF and IntraMF, red: SAT; blue: InterMF; yellow: IntraMF. Fig. 4　Subjects with muscular atrophy (A and B) were compared with normal volunteers (C and D) with Sth、Sinter and Sintra. A, B: Muscular atrophy male, 43 years old, BMI: 24.22 kg/m², Goutallier grade 3; C, D: Normal group, male, 43 years old, BMI: 22.27 kg/m², Goutallier grade 2; A, C: T1 images; B, D: Pseudo-color image based on ImageJ, red: Sth, subcutaneous fat area of thigh; blue: Sinter, thigh intermuscular fat area; yellow: Sintra, Intramuscular fat area of the thigh.

1.4 图像后处理及肌肉Goutallier分级评分

       使用ImageJ对大腿中部T1WI图像进行后处理。首先，按照以下标准对大腿进行区域划分：

       (1) Sth：大腿SAT面积，外轮廓为T1WI图像上高信号的最外缘，内轮廓为大腿阔筋膜(图3A)，包括其内血管及筋膜组织(图3B)；

       (2) Sbone：股骨区域(包括骨髓腔)面积(图3C箭)；

       (3) Sinter：InterMF面积，SAT内轮廓中各肌肉间的区域，包括血管、神经(图3E，蓝色)；

       (4) CSA：横截面积(cross sectional area，CSA)，层面内所有肌肉横截面积之和(图3F)；

       (5) Sintra：IntraMF面积，T1图像上肌肉内可见的脂肪组织(图3G，黄色)；

       (6) FF：层面内所有肌肉脂肪分数的平均值；

       (7) Sintra-FF：根据脂肪分数测得的肌内脂肪面积，Sintra-FF=CSA×FF。

       所有ROI的勾画步骤如下：所有肌肉/脂肪区域的分割都是由住院医师C手动完成的。①在T1WI图像上进行SAT内外轮廓的勾画，SAT外轮廓为T1WI图像上高信号的最外缘(图3A箭)，内轮廓为大腿阔筋膜(图3A箭头)；②沿股骨外侧缘勾画包含骨皮质及骨髓腔的区域(图3C箭)；③紧贴每块肌肉的边缘勾画出每一块肌肉的轮廓(图3D)。④沿SAT内轮廓剪去所有肌肉及股骨区域即可获得InterMF (图3E，蓝色区域)；⑤在SAT内轮廓内剪去InterMF区域及股骨区域即可获得肌肉CSA (图3F)；⑥通过ImageJ内的阈值调整使肌肉内肉眼可见的脂肪尽量着色，着色区域即为intraMF (图3黄色)。

1.5 肌肉脂肪浸润的Goutallier分级评分

       肌肉脂肪浸润Goutallier分级包括5级：0级：没有脂肪；1级：肌肉内见脂肪条纹；2级：肌肉＞脂肪；3级：肌肉=脂肪；4级：肌肉＜脂肪。由一位工作5年以上的肌骨放射科医生在T1WI图像上根据Goutallier分级评分标准对所有28名受试者的肌肉脂肪浸润程度进行Goutallier分级评分。如果在分级过程中对分级不确定，则由该医师与另一位具有19年肌骨影像诊断经验的医师共同阅片后决定最终临床分级。

1.6 观察者内及观察者间一致性评估

       由两名住院医师A和B随机挑选6名受试者并进行大腿同一层面股直肌脂肪分数的测量；住院医师A再对上述6名受试者同一层面股直肌的脂肪分数进行3次测量；由住院医师C随机选择五名受试者，并用ImageJ软件对大腿同一层面SAT、InterMF、IntraMF进行三次分割；住院医师D用ImageJ软件对上述随机选中的五名受试者的大腿SAT、InterMF、IntraMF进行分割；计算组内相关系数ICC值以评估观察者内及观察者间一致性。A、B、C、D四位医师均为住院医师，且从事骨肌影像诊断3年以上；所有进行脂肪分数测量、ImageJ图像后处理及Goutallier分级的医师对患者基本临床资料单盲。

1.7 统计学分析

       采用SPSS 25.0进行统计分析。所有计量资料均以x¯±s表示，资料服从正态分布采用独立样本t检验，不服从正态分布则采用曼-惠特尼U检验。等级资料采用秩和检验。相关性分析：若服从正态分布采用Pearson相关性分析，不服从正态分布或者等级资料使用Spearman相关性分析。计算组内相关系数ICC值以评估观察者内和观察者间一致性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

       研究对象基线情况见表2。T2DM组BMI、FBG及TG均高于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.006)；T2DM组与对照组间年龄及性别组成差异无统计学意义(P＞0.05)。

       基于ImageJ分割测量的IntraMF面积Sintra与基于脂肪分数计算的IntraMF面积Sintra-FF对比见表3。统计结果表明：基于ImageJ分割测量的IntraMF面积与基于脂肪分数计算的IntraMF面积差异无统计学意义(P=0.589)。图4对比了基于ImageJ分割方法的T2DM受试者与正常组志愿者的Sth、Sinter及Sintra。

       ImageJ分割测量的IntraMF面积Sintra和Goutallier分级与基于脂肪分数计算的IntraMF面积Sintra-FF的相关性分析见表4；Sintra与Sintra-FF的相关性散点图见图5。结果表明：ImageJ分割测量的Sintra与基于脂肪分数计算的Sintra-FF相关系数r=0.998，差异有统计学意义(P＜0.001)；Goutallier分级与Sintra-FF无明显相关性(P=0.205)。基于ImageJ分割的大腿Sth、Sinter、Sintra的观察者内及观察者间的一致性分析见表5，结果表明：基于ImageJ分割的大腿Sth、Sinter、Sintra的观察者内及观察者间ICC分别是：0.999、0.992、0.997、0.999、0.941、1.000，差异均有统计学意义(P＜0.005)。

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图5  基于ImageJ分割与基于脂肪分数计算的IntraMF面积Sintra与Sintra-FF相关性散点图。Sintra：ImageJ分割测量的肌内脂肪面积；Sintra-FF：基于脂肪分数计算的肌内脂肪面积
Fig.5  IntraMF area Sintra and Sintra-FF correlation scatter plot based on ImageJ segmentation and fat fraction calculation. Sintra: Intramuscular fat area measured by ImageJ; Sintra-FF: Intramuscular fat area calculated from mean muscle fat fraction.

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表2  研究对象基线情况表(x¯±s)
Tab. 2  Baseline information of subjects (x¯±s)

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表3  基于ImageJ分割和基于脂肪分数计算的IntraMF面积对比
Tab. 3  IntraMF area comparison based on ImageJ segmentation and fat fraction calculation

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表4  Sintra和Goutallier分级与Sintra-FF的相关性分析
Tab. 4  Correlation analysis of Sintra and Goutallier grades with Sintra-FF

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表5  基于ImageJ分割的大腿Sth、Sinter、Sintra的观察者内及观察者间的一致性
Tab. 5  Intra-observer and inter-observer agreement of Sth, Sinter and Sintra of thigh by using ImageJ

3 讨论

       本研究首先采用ImageJ在MRI T1WI图像上对大腿SAT、IntraMF及InterMF进行分割和量化，并分析该定量方法和基于Goutallier分级评估法与基于水脂分离技术的IDEAL-IQ脂肪定量方法在定量IntraMF的相关性。基于ImageJ的分割方法在量化IntraMF准确性高，且定量大腿SAT、IntraMF及InterMF稳定性良好。实现在MR T1WI图像上即可较为准确地完成对大腿SAT、IntraMF及InterMF的量化，且在量化IntraMF时准确性优于Goutallier分级法。

       本研究结果表明，基于ImageJ的分割方法和基于IDEAL-IQ的脂肪定量方法在定量IntraMF面积时差异无统计学意义，这表明ImageJ在定量IntraMF时与基于IDEAL-IQ的脂肪定量方法间的差异在误差允许的范围之内。此外，基于ImageJ的分割方法和基于IDEAL-IQ的脂肪定量方法在定量IntraMF有很强的相关性(r=0.998)；但基于Goutallier分级的评估方法与基于IDEAL-IQ的脂肪定量方法在定量IntraMF相关性较差(r=0.247)。这表明基于ImageJ的分割方法在定量大腿IntraMF准确性优于Goutallier分级法，且与IDEAL-IQ定量结果更加一致。先前的研究表明，与MRI定量方法相比，半定量视觉评估方法高估了肌肉中脂肪浸润的程度^[12]。ImageJ在量化IntraMF时通过阈值的调节量化肌肉内可见的脂肪；IDEAL-IQ则是通过计算每个体素内的脂肪分数进而通过脂肪分数的形式量化IntraMF；Goutallier分级法则与阅片者的工作经验、个体间的差异关系密切，因此稳定性较差。为了验证基于IDEAL-IQ的脂肪分数测量的稳定性，本研究分析了脂肪分数测量的观察者内及观察者间的一致性，结果表明脂肪分数测量的观察者内ICC为0.952，观察者间ICC为0.969。为了验证ImageJ分割方法稳定性，本研究还分析了ImageJ分割方法的观察者内和观察者间的一致性，结果表明，ImageJ分割方法在大腿SAT、IntraMF和InterMF的测量中观察者内和观察者间的一致性良好，ICC均＞0.94。Lee等^[13]提出，当测量无明显偏倚，且ICC值≥0.75时，认为信度良好。这表明基于ImageJ的分割方法临床应用中稳定性良好，不同的操作者对结果的影响较小。

       IMAT的增加已被确认是导致骨骼肌力量和质量下降的潜在因素^[14]。因此，IMAT的准确评估对于临床决策的制定以及患者的康复预后至关重要。大腿阔筋膜将大腿SAT与IMAT划分开。在以往的研究中，对InterMF边缘的定义通常是紧贴大腿肌肉边缘的筋膜而不是大腿阔筋膜^[15]。但是，对于大腿部SAT及IMAT的精确量化，大腿阔筋膜的分割是一个先决条件，因为在老年受试者中大腿阔筋膜和肌肉表面之间的脂肪组织数量增加^[16]。本研究中基于ImageJ的分割方法能够较为准确地分辨大腿阔筋膜，很好地避免将InterMF误勾为SAT。本研究使用一款免费的开源软件ImageJ在MRI T1WI图像上即完成了对大腿SAT、IntraMF及InterMF的分割和量化，操作简单，临床工作中易于推广和使用。

       本研究仍有一定的局限性。(1)样本量少，未来仍需进一步加大样本量以进一步验证该方法的准确性及可靠性；(2)本研究仅针对大腿中部的SAT、IntraMF和InterMF进行了探究，其他部位的SAT、IntraMF和InterMF的评估仍需进一步验证；(3)本研究将肌间血管、神经均划为InterMF，对InterMF测量结果有一定影响，而现有方法尚难以准确分离出肌间血管神经；(4)勾画脂肪分数图ROI时，ROI边缘距离肌肉边缘1～2 mm会导致肌肉脂肪分数偏低。

       总之，在MRI T1WI序列上使用ImageJ分割来量化的大腿IntraMF与基于IDEAL-IQ脂肪分数计算的IntraMF有很强的相关性，且ImageJ分割方法在量化大腿SAT、IntraMF和InterMF稳定性高。ImageJ分割方法是未来替代半定量Goutallier分级系统的一种可行的选择。