肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是由不同病因引发慢性肝损伤的病理改变^[1]，是导致失代偿性肝硬化的重要环节，早期诊断及治疗是阻止其向肝硬化以及肝癌转化的重要途径。美国肝脏疾病研究协会指南上提出桥接纤维化的存在，即F3期HF (Metavir 分级标准)是未来进展为肝硬化的重要预测因子，也是治疗的重要指征^[2]。从轻度HF (F1期)到中度HF(F2～F3期)的转变是影响预后的主要步骤^[3]，此阶段进行有效地干预可以逆转HF^[1]。因此，在临床上对中度HF进行准确分期评估，这在为患者制订正确的诊疗方案以及判断其预后情况中显得极为重要。

       HF的实验室检查，主要监测血清纤维化标志物[包括透明质酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅲ型前胶原蛋白(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和层粘连蛋白(laminin，LN)等]^[4]，具有经济、方便的特点。经肝穿刺活检是HF诊断及分期的“金标准”，是一种创伤性检查，存在着出血等多种并发症的风险，且具有取样误差及观察差异等不可避免的局限性，限制了其在临床的广泛应用^[5]。因此寻找一种可替代肝穿刺活检的无创性检查方法成为当下国内外学者的研究热点。目前影像学诊断及评估HF的方法中，超声检查及常规CT因多种局限性对HF的诊断以及分期敏感性较差。

       随着MRI技术，尤其是功能磁共振成像技术(functional magnetic resonance imaging，fMRI)的不断发展，可以从形态及功能两方面来评估HF。动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)通过注射对比剂，可以无创性成像来评估组织的微循环特征^{[6, 7]}。钆塞酸二钠(Gadolinium ethoxybenzyl diethylene-triamine-pentaacetic-acid，Gd-EOB-DTPA)是一种特异性对比剂，注射后可通过肝细胞膜上的有机阴离子转运体被肝细胞吸收，可以对肝脏血流灌注信息以及肝功能情况进行评估^{[8, 9, 10, 11]}。近年来，大多数研究是通过分析灌注参数进行评估的，包括血流量(blood flow)、对比剂平均通过时间(mean transit time，MTT)、达峰时间(time to peak，TTP)、分布容积(distribution volume，DV)等，多为半定量参数，未考虑HF时血管腔和血管外细胞外间隙(extravascular extracellular space，EES)的渗透关系。药代动力学参数，包括容量转运常数(transfer constant，K^trans)、速率常数(reverse rate constant，Kep)、血管外细胞外间隙体积百分数(extravascular extracellular volume fraction，Ve)等，能定量分析HF时血流灌注及血管渗透性的情况，但目前很少有使用上述药代动力学参数评估HF的报道，并且研究结果仍存在一定的争议，在广泛应用于临床之前，也需进行充分的实验研究。因此,本研究通过构建HF大鼠模型，以组织病理学为金标准，结合以Gd-EOB-DTPA为对比剂的DCE-MRI技术及血清学检查，旨在评估Gd-EOB-DTPA DCE-MRI各参数[K^trans、Kep、Ve及初始曲线下面积(initial area under curve，iAUC)]和血清纤维化标志物(LN、HA)对诊断中度HF的价值，为临床准确对中度HF诊断和分期提供更多的证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及肝纤维化模型建立

       本实验研究从2019年8月开始，2020年9月结束，在滨州医学院附属医院医学研究中心以及滨州医学院附属医院放射科进行。采用雄性Wistar大鼠(SPF级) 40只[于济南朋悦实验动物繁育有限公司购买，实验动物生产许可证号：SCXK (鲁) 20190003]，体重180～200 g，6周龄，健康。从中随机抽取10只作为对照组，30只作为实验组，分笼饲养。实验组再分为3个亚组，每组10只，腹腔注射CCl4与橄榄油的混合液(1∶1)，2 mL/kg，每周2次，2次用药时间间隔为3～4天，3个亚组的给药时间分别为4、6、8周，从而制备不同程度的HF模型；对照组腹腔注射等量橄榄油。本实验已通过滨州医学院医学伦理委员会批准，批准文号：论研批第(2017-15)号。

1.2 血清纤维化标志物测定

       所有大鼠MRI扫描前通过剪尾尖采血法取血，收集血液于用肝素浸润的1.5 mL EP管内，使用高速离心机，设置转速为3500 rpm，时间10 min，离心后获取上层血清，通过酶联免疫分析方法测定大鼠血清中HA、LN的含量。

1.3 MRI检查

1.3.1 检查前动物准备

       扫描前用10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经尾静脉置入留置针，将其俯卧位固定进行MRI扫描。对比剂采用Gd-EOB-DTPA (普美显，德国拜耳医药保健有限公司，德国)，将其稀释10倍(0.025 mmol/mL)，实际注射的对比剂体积为1.0 mL/kg大鼠体重。

1.3.2 MRI扫描

       采用德国Siemens Magnetom Skyra 3.0 T MRI扫描仪及15通道膝关节线圈。①轴位T1TSE (TR=3.49 ms，TE=1.39 ms，FOV=300 mm×300 mm，层厚=2.0 mm)；②轴位DCE-MRI：TR=6.32 ms，TE=2.40 ms，FOV 75 mm×75 mm，层厚1.0 mm。DCE-MRI先行两期增强前连续脂肪抑制扫描作为每个像素的T1弛豫时间的基线，于第3期末经尾静脉注射Gd-EOB-DTPA，3 s内注射完成，再用生理盐水冲管，约2 mL，连续扫描60期，总时长9 min 11 s。

1.3.3 图像后处理分析

       在双盲前提下，由3名具备5年以上腹部影像诊断经验的放射科诊断医师进行分析判断，如遇到分歧时则重新共同讨论后达成一致。采用Siemens多功能图像后处理工作站中的Tissue 4D软件包处理DCE-MRI数据。选取肝脏的最大层面及其上下各一层一共三个层面，在每一层面的肝右叶勾画感兴趣区域，尽量靠近肝脏取材的位置，避开肝脏大血管及胆管，感兴趣区面积为0.3 cm²～0.5 cm²，得到DCE的相对强化率-时间曲线，进一步得到K^trans、Kep、Ve及iAUC^[12]，最后取平均值得到最终的数据。

1.4 病理学分析

       MRI扫描结束后，处死大鼠，取肝右叶组织进行HE染色及Masson染色。病理切片由3名高年资病理科医师共同进行评估，如遇到分歧时则重新共同讨论后达成一致。HF分期根据Metavir分级标准进行评估。F0：无纤维化；F1：汇管区纤维化，无纤维间隔；F2：汇管区纤维化，少量纤维间隔；F3：大量纤维间隔，小叶结构破坏，无肝硬化；F4：早期肝硬化。

1.5 统计学分析

       采用SPSS 22.0软件，对DCE-MRI参数(K^trans、Kep、Ve和iAUC)及大鼠血清纤维化标志物(HA、LN)进行统计学分析。结果均以均数±标准差表示。采用独立样本t检验比较大鼠对照组与实验组、正常组及轻度HF组与中度HF组DCE-MRI参数以及血清纤维化标志物的差异；采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较HF不同分期之间上述MRI参数及大鼠血清学指标的差异，并使用最小显著差法检验(LSD检验)对DCE-MRI参数及血清纤维化标志物进行相邻组间比较；通过Spearman检验分析DCE-MRI参数和大鼠血清纤维化标志物含量与HF分期的相关性；结合受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线判断MRI各参及血清学指标数值对中度HF的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模结果及病理学结果

       30只实验组大鼠在建模过程中死亡6只，在麻醉时死亡1只，对照组10只大鼠在麻醉时死亡2只，最终实验组23只大鼠及对照组8只大鼠完成MR检查、血清学检查及病理学检查，其中2例对照组及1例实验组血液样本出现溶血。最终22只实验组大鼠中，F1期7只，F2期8只，F3期5只，F4期2只；对照组6只全部为F0期。最终实际有6只对照组大鼠及20只大鼠的数据纳入本次研究，其中病理学分期为正常组6只、轻度HF (F1期) 7只、中度HF (F2～F3期) 13只。各组HE及Masson染色图片见图1。

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图1  大鼠各组HE染色(A～C，×400)及Masson染色(D～F，×100)图片。A、D：正常组(F0期)：肝细胞及肝小叶结构正常，汇管区无纤维蛋白沉积；B、E：轻度HF组(F1期)，汇管区可见纤维蛋白沉积，无纤维间隔形成；C、F：中度HF组(F2～F3期)：汇管区可见纤维蛋白沉积，纤维间隔形成，肝小叶结构被破坏，无肝硬化。
Fig. 1  HE (A-C, ×400) atnd Masson (D-F, ×100) staining images of each group in rats. A, D：normal group (F0): normal liver cells and liver lobules, no fibrous deposits in the portal area; B, E: mild HF group (F1), a small amount of blue-stained fibrin deposits in the portal area without fibrous septum formation；C, F：moderate HF group (F2-F3): more blue-stained fiber deposits are seen in the portal area, and a small amount of fibrous septa is formed, the structure of liver lobules is destroyed, and no liver cirrhosis.

2.2 DCE-MRI参数与HF病理学分期

       各组DCE-MRI参数详细见表1。

       随着HF的进展，即从正常到中度HF，K^trans、Kep、Ve及iAUC均降低(图2)。Spearman检验分析显示，K^trans、Kep、Ve和iAUC与HF程度呈负相关(r=-0.626，P=0.001；r=-0.395、P=0.046；r=-0.570、P=0.002；r=-0.592、P=0.001) (表2)。

       对照组与实验组比较，即F0 vs. F1～F3，K^trans (t=2.901，P=0.008)；Ve (t=3.381，P=0.004)；iAUC (t=2.647，P=0.014)差异具有统计学意义，然而，Kep (t=1.166，P=0.255)差异不具有统计学意义(表3)。

       正常组(F0期)及轻度HF组(F1期)与中度HF组(F2～F3期)比较，即F0～F1 vs. F2～F3，K^trans (t=3.550，P=0.002)；Ve (t=3.195，P=0.004)；iAUC (t=3.321，P=0.003)差异具有统计学意义，然而，Kep (t=1.670，P=0.108)差异不具有统计学意义(表3)。

       K^trans、Ve及iAUC组间差异具有统计学意义(P=0.003，P=0.010，P=0.008)，Kep组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。组间两两比较，K^trans、Ve及iAUC在正常组(F0期)与中度HF组(F2～F3期)以及轻度HF组(F1期)与中度HF组(F2～F3期)中差异均具有统计学意义(其中正常组与中度HF组K^transP=0.001，VeP=0.004，iAUC P=0.003；轻度HF组与中度HF组K^transP=0.033，VeP=0.047，iAUC P=0.043)，然而正常组(F0期)与轻度HF组(F1期)之间的K^trans、Ve差异均不具有统计学意义(P＞0.05) (表4)。

       在判断有无中度HF时K^trans、Ve和AUC曲线下面积分别为0.840 (P=0.003)；0.811 (P=0.007)；0.828 (P=0.004)，当K^trans值小于0.868 min^-1时，敏感度为76.9%，特异度为84.6%；当Ve值小于0.355 min^-1时，敏感度为61.5%，特异度为92.3%；当iAUC值小于27.218时，敏感度为84.6%，特异度为76.9% (表5)。

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图2  Gd-EOB-DTPA DCE-MRI所测大鼠正常组(F0) K^trans (At)、Kep (B)、Ve (C)、iAUC (D)及中度肝纤维化组(F2～F3) K^trans (E)、Kep (F)、Ve (G)、iAUC (H)定量参数伪彩图。
Fig. 2  Representative images of K^trans (A), Kep (B), Ve (C), and iAUC (D) maps of the normal group (F0) and the images of K^trans (E), Kep (F), Ve (G), and iAUC (H) maps of the moderate HF group (F2-F3) in rats.

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表1  HF不同病理学分期之间DCE-MRI各参数值对比
Tab. 1  Comparisons of the values of parameters DCE-MRI in different pathology stages of HF groups

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表2  DCE-MRI各参数值与肝纤维化不同病理学分期的相关性
Tab. 2  Correlation between DCE-MRI parameter values and the different pathological stages of HF

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表3  DCE-MRI各参数值肝纤维化不同病理学分期组间两独立样本t检验比较
Tab. 3  Comparison of two independent sample t-tests of DCE-MRI parameter values HF between different pathological stages

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表4  DCE-MRI各参数值HF不同病理学分期相邻组间LSD检验比较
Tab. 4  Comparison of LSD test of DCE-MRI parameter values HF between different pathological stages

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表5  DCE-MRI各参数值鉴别中度肝纤维化的ROC曲线比较
Tab. 5  Comparison of ROC curves identifying moderate HF by each parameter values of DCE-MRI

2.3 HF血清学指标变化及与HF病理学分期

       各组LN、HA含量情况详细见表6。

       所测定血清学HF指标(LN、HA)随HF分期进展依次升高，Spearman检验分析显示，血清学指标(LN、HA)含量与HF程度呈正相关(r=0.614，P=0.001；r=0.601，P=0.001)，其中LN的相关性较大(r=0.614) (表7)。

       对照组与实验组比较，即F0 vs. F1～F3，LN、HA含量在两组间中差异显著，具有统计学意义(分别为t=-2.812，P=0.010；t=-3.093，P=0.005) (表8)。

       正常组(F0期)及轻度HF组(F1期)与中度HF组(F2～F3期)比较，即F0～F1 vs. F2～F3，LN、HA含量在两组间中差异显著，具有统计学意义(分别为t=-3.300，P=0.003；t=-3.211，P=0.004) (表8)。

       LN、HA含量组间差异具有统计学意义，组间两两比较，血清中LN与HA在正常组(F0期)与中度HF组(F2～F3期)之间差异具有统计学意义(P=0.002，P=0.001)，但在正常组(F0期)与轻度HF组(F1期)和轻度HF组(F1期)与中度HF组(F2～F3期)间差异无统计学意义(P＞0.05) (表9)。

       在判断有无中度HF时，LN和HA曲线下面积分别为0.834 (P=0.004)；0.805 (P=0.008)，当LN值大于86.175 ng/mL时，敏感度为100%，特异度为69.2%；当HA值小于65.770 ng/mL时，敏感度为69.2%，特异度为84.6% (表10)。

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表6  HF不同病理学分期之间LN、HA含量对比
Tab. 6  Content of LN、HA in serum in different HF groups

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表7  LN、HA含量与HF不同病理学分期的相关性
Tab. 7  Correlation between LN、HA content and different pathological stages of HF

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表8  LN、HA含量在HF不同病理学分期组间两独立样本t检验比较
Tab. 8  LN、HA content were compared between two independent sample t-tests between groups with different pathological stages of HF

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表9  LN、HA含量在HF不同病理学分期相邻组间LSD检验比较
Tab. 9  LN、HA content were compared with LSD test between adjacent groups at different pathological stages of HF

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表10  LN、HA含量鉴别中度HF的ROC曲线比较
Tab. 10  Comparison of ROC curves for identifying moderate HF by LN、HA content

3 讨论

       本研究通过对HF大鼠及正常大鼠进行Gd-EOB-DTPA DCE-MRI扫描以及测定其血清中HA、LN的含量，发现Gd-EOB-DTPA DCE-MRI定量评估中度HF分期具有较高的价值，其中DCE-MRI各参数中K^trans具有最佳的诊断效能。HF作为肝硬化、肝癌的必经环节，备受关注，有学者认为轻度至中度HF是影响慢性肝病预后的关键阶段^{[3,13, 14]}。目前通过DCE-MRI定量评价中度HF的研究依然处于探讨阶段，仍存在一定的争议，本研究通过无创性检查方法，利用药代动力学参数(K^trans、Kep、Ve)和半定量参数iAUC对肝脏的微循环特征进行评估，客观反映HF时肝脏的病理生理状态，在一定程度上评价中度HF，为临床早期发现HF提供更多的有效证据，在改善患者预后中具有重要意义。

3.1 HF的病理学改变

       HF是一种慢性肝损伤的修复反应，以成纤维细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常沉积为典型病理特征，并伴有明显炎性改变的病理过程，是导致失代偿性肝硬化的重要环节，同时会增加患者罹患肝癌的风险^[15]。在HF的发生及发展中，各种不同的致病因素(如饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和胆汁淤积性肝病等)^[16]会刺激肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)激活，转化为肌成纤维细胞样细胞(myofibroblastic-like cell，MFLC)，从而不断产生ECM，多沉积于肝细胞和肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)之间的窦周间隙(Disse间隙)中，导致纤维瘢痕形成，是HF发生发展的关键过程^{[1,16, 17]}；同时，各种不同的致病因素可以导致LSEC的损伤，以LSEC失窗孔及内皮下连续性基底膜形成为特征，称为肝窦毛细血管化，可以加速肝纤维化的发展进程^{[18, 19]}，以上病理学改变阻碍了肝细胞和肝血窦之间的物质交换过程，严重影响了肝脏微循环，抑制肝脏正常生理功能。

3.2 DCE-MRI参数与HF病理学分期

       本研究显示，随着HF进展(无HF-轻度HF-中度HF)，K^trans、Ve及iAUC均降低，其中K^trans与HF的相关性最大(r=-0.665)；Kep组间差异不具有统计学意义(P＞0.05)。在诊断中度HF方面，K^trans有较高的优势，其曲线下面积最大，为0.840 (P=0.003)。

       K^trans表示对比剂从血管内渗透到EES的速率，Kep值代表对比剂从EES到血管内的回流速率^[6,20]。在HF中，由于Disse间隙ECM的异常沉积以及肝窦毛细血管化，阻碍了血浆与EES的灌注，因此可以推测理论上K^trans及Kep将随着HF的进展而降低，这与本实验中K^trans的结果相符合，然而各组间Kep差异不具有统计学意义。上述结果与徐佳等^[12]利用大鼠及Li等^[21]利用家兔为研究对象以及钆二胺(Gd-DTPA-BMA)为对比剂得出的结果相类似。然而有学者却得出相反的结论，张丽萍等^[22]发现随着HF严重程度的增加，K^trans值不断增大，其原因可能与Gd-EOB-DTPA这种低分子量对比剂比其他大分子物质受肝窦毛细血管化的影响较小、Gd-EOB-DTPA具有肝细胞特异性摄取入胞内这种特性，造成对比剂代谢时间延长这些因素有关；肝动脉血流引发的肝窦压力增高亦可提高K^trans。除了以上观点，Liu等^[6]还认为HF的基本病理变化引发的门静脉灌注压增高，从而降低内皮依赖性血管扩张，导致k^trans升高。Zhang等^[18]通过对大鼠进行研究发现K^trans值的变化及所推测的原因与上述两位学者部分相一致，并发现虽然轻度(F1～F2期)及重度(F3～F4期) HF组Kep值较非HF组略增高，但其无法预测纤维化，虽然与本实验的分类方式不同，但均提示Kep在区分HF不同阶段中的价值较小，然而有学者^[6,23]认为Kep在部分HF阶段中差异具有统计学意义，所以对于其变化尚无定论。

       Ve是每单位体积组织中EES的体积分数^[6]，Zhang等^[18]发现Ve起初略降低然后升高，与本研究结果略不同。本实验结果与徐佳等^[12]及Li等^[21]一致，徐佳等^[12]认为这是由于ECM的不断沉积使得EES体积减小所致，Li等^[21]认为Ve不断降低可能与部分纤维化相关细胞的增殖，如HSC和肌成纤维细胞；LSEC失窗孔会阻碍液体交换，致使组织液含量减少；肝细胞再生和再生结节可能会扭曲正常结构，以上因素可能导致EES降低。

       半定量参数iAUC反映一定时间内输送进入肝脏组织中对比剂的量^[18]，由于上述病理变化导致肝脏血流灌注减少，故随着肝纤维化程度的加重iAUC不断降低，这与本实验的结果相符合，但这与Zhang等^[18]研究趋势相反。所以此参数的变化尚无定论，需要进一步探讨。

3.3 HF血清学指标变化及与HF病理学分期

       本研究显示血清纤维化标志物(LN、HA)在实验组与对照组中差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)，且与HF程度呈正相关(r=0.614，P=0.001；r=0.601，P=0.001)。在诊断中度HF方面，LN有着较高的优势，其曲线下面积最大，为0.828 (P=0.004)。HA、LN是主要由HSC合成的糖蛋白，是ECM的主要组成成分^{[24, 25]}，其血清水平升高表明肝脏已经开始发生慢性损伤，并最终导致HF，可反映HF的活性，故血清纤维化标志物的测定是一种能较好地反映肝细胞损伤及判断肝纤维化程度的无创性监测方法^[24,26]。本实验结果说明血清纤维化标志物(HA、LN)可以较好地监测HF的存在，随着HF进展，HA、LN不断升高，肝脏开始发生慢性损伤。然而HA、LN均在轻度HF组与中度HF组间差异无统计学意义(P＞0.05)，说明HA、LN在区分轻中度HF中的能力有限。

4 局限性

       这项研究存在一些局限性。第一，大鼠HF模型在其病理学以及血流动力学中某些方面的改变不同于人类；第二，本研究样本量相对较小，并且舍弃了重度HF组(F4期)，在描述不同指标的变化以及与HF分期关系时具有一定局限性，进一步研究需要增大样本量。第三，本研究采用的是单输入Tofts模型而非双输入模型，后者被认为是研究肝脏血液供应的更好模型，在今后的实验中会进行改善。

       综上，本研究提示Gd-EOB-DTPA DCE-MRI各定量及半定量参数(K^trans、Ve及iAUC)有助于区分轻度与中度HF及正常与中度HF，在诊断中度HF中具有一定价值，其中K^trans有着较高的优势。