根据国际癌症研究机构GLOBOCAN 2020年癌症统计数据，乳腺癌是女性发病率第一的癌症^[1]。化疗是乳腺癌患者重要的治疗的手段，但是有8.1%～75%的患者可出现与化疗相关的认知功能障碍^[2]，这严重影响乳腺癌患者的生活质量^[3]。因此，阐明化疗相关认知障碍的神经机制对其早期诊断和治疗至关重要。有研究认为与化疗后高水平的促炎细胞因子和氧化应激有关^[4]，也有研究认为与化疗药物所致DNA损伤、神经递质水平异常等有关^{[5, 6]}；目前，关于化疗所致认知功能障碍的机制仍待研究。

       功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)检查能探测细微的脑功能异常，是许多认知功能障碍疾病不可替代的检查工具。基于血氧水平依赖的功能磁共振成像(blood oxygenation level-dependent functional magnetic resonance imaging，BOLD-fMRI)是fMRI最常用的技术。低频振幅(amplitude of low-frequency fluctuations，ALFF)被广泛应用于表征神经元自发活动的程度，具有较高的重测信度^{[7, 8]}。此外，功能连接(functional connectivity，FC)分析可以探索脑同步性功能活动^{[9, 10, 11]}。在一项接受化疗的16名老年乳腺癌患者的研究中，发现化疗结束后1个月双侧胼胝体下回和右侧扣带回前部的ALFF增加^[8]。另外，有研究发现顶内沟与运动前皮质、楔叶和壳核以及后扣带皮质与左侧楔前叶的FC在化疗后1个月下降^[12]。

       既往神经心理学研究提示，癌症患者在病程的各个阶段都存在认知功能障碍，而主观性抱怨多在化疗结束后1个月报告^[13]，大多神经影像学研究的时间点也选择在化疗结束后1个月。然而，相对于单用内分泌治疗，乳腺癌患者在同时接受化疗和内分泌治疗后3个月内即可发生急剧的认知功能下降^[14]。因此，化疗导致的早期脑功能改变特点尚待研究。本研究以完成新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NAC)第1周期的乳腺癌患者为研究对象，采用ALFF和FC方法探讨化疗对脑功能活动的短期影响，为化疗相关认知障碍的早期评估提供神经影像学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究为前瞻性纵向研究，通过重庆大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(批准号：czls20200215-A)。所有受试者均签署书面知情同意。2021年1月至2021年6月期间，在重庆大学肿瘤医院共招募拟行NAC治疗的女性乳腺癌患者36例。纳入标准如下：(1)年龄20～70岁，临床诊断为Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者并计划术前行NAC；(2)右利手。排除标准：(1)脑器质性病变(脑转移瘤、外伤、脑卒中等)；(2)有神经或精神疾病病史(重度抑郁症、痴呆、多发性硬化症、精神分裂症、癫痫等)；(3)体内有金属植入物等MR检查禁忌证。

       乳腺癌患者在NAC前(timepoint 0，TP0)进行基线评估，包括脑rs-fMRI扫描和神经心理测试。NAC第1个周期(timepoint 1，TP1)后进行一次相同的脑rs-fMRI扫描和神经心理测试，具体时间为行第2周期NAC前3天内。本研究通过自我报告问卷获得所有受试者的人口统计学信息，包括年龄、受教育程度、体质量指数(body mass index，BMI)、血压和月经状况；另外，通过病历获取受试者的疾病分期和化疗方案。

1.2 神经心理测试

       以固定的顺序评估受试者的整体认知水平和主要的认知子域。整体认知水平通过中文版癌症治疗功能评估-认知功能量表(Functional Assessment of Cancer Therapy-Cognitive Function，FACT-Cog) (Version 3)评估，包括知觉的认知障碍(perceived cognitive impairments，PCI)、其他人评价(comments from others，OTH)、知觉的认知能力(perceived cognitive abilities，PCA)、生活质量的影响(impact on quality of life，QOL)四个方面。此外，注意、执行功能和精神运动速度通过连线测试(trail making test，TMT；Part A)进行评估^[15]；工作记忆通过数字广度测试(digital span test，DST；包括顺背和倒背)进行评估^[16]；语义记忆通过词语分类流畅性测试(verbal fluency test，VFT)进行评估^[16]。采用焦虑自评量表(Self-Rating Anxiety Scale, SAS)和抑郁自评量表(Self-Rating Depression Scale，SDS)分别对焦虑和抑郁情绪进行评定，并将测试评分按照手册规定的程序标准换算成量表得分。

1.3 磁共振数据采集

       使用Prisma 3.0 T磁共振扫描仪(Magnetom Prisma；Siemens Healthcare，Erlangen，Germany)进行影像学数据采集，搭配64通道头颈线圈。在扫描过程中，要求所有受试者保持清醒、闭目状态，不考虑特定问题，并使用海绵耳塞以减轻扫描仪噪声的影响。rs-fMRI数据扫描使用平面回波(echo-planar imaging，EPI)序列，扫描参数TR=3000 ms，TE=30 ms，翻转角=70°，FOV=240×240 mm²，扫描层数=36，平面矩阵=80×80，体素=3×3×3 mm³。采集240个时间点，扫描时间为8 min 8 s。高分辨率3D T1WI结构像采用磁化预备快速采集梯度回波(magnetization-prepared rapid acquisition gradientecho，MPRAGE)序列，扫描参数：TR=2100 ms，TE=2.26 ms，翻转角=8°，FOV=256×256 mm²，扫描层数=192，平面矩阵=256×256，体素=1×1×1 mm³。总扫描时间为4 min 53 s。

1.4 图像处理

       功能图像的预处理采用静息态功能数据处理助手(Data Processing & Analysis for Brain Imaging，DPABI) V5.1软件完成，具体步骤如下：(1)去除前10个时间点以提高数据的同质性；(2)利用剩余的230个时间点数据进行层间时间校正；(3)头动校正，排除头动位移大于3 mm或转动角度大于3°的受试者；(3)采用Friston-24模型回归头动参数协变量，通过回归协变量去除白质信号和脑脊液信号；(4)功能图像与结构图像进行配准；(5)将功能图像标准化到蒙特利尔神经研究所(Montreal Neurological Institute，MNI)空间中，手动检查配准后的结果；(6)去线性漂移；(7)滤波(0.01～0.10 Hz)；(8)以6 mm全宽半高(full width at half maximum，FWHM)进行高斯平滑。

       利用预处理后的数据计算出ALFF分布图。根据两个时间点ALFF的比较结果，将ALFF异常的脑区作为种子点，计算种子点与大脑其他各体素之间的时间序列相关系数，得到每个被试的FC模式，并进行Fisher's r-to-z变换，以提高FC相关系数值的正态性。

1.5 统计学分析

       数值型数据的分析通过SPSS V22.0 (IBM Corp，Armonk，New York)软件完成，包括人口数据和神经心理测试评分。首先，采用Kolmogorov-Smirnov检验对数据的分布进行检验；然后根据检验的结果，进行比较分析。符合正态分布的数据采用配对样本t检验，非正态分布的数据采用Wilcoxon符号秩检验。

       在DPABI V5.1软件的统计分析模块中进行ALFF图和FC图的分析。首先，用单样本t检验检查TP0和TP1的ALFF和FC分布模式(与“0”相比)。ALFF和FC分布图的比较(TP0 vs. TP1)采用配对样本t检验。年龄、受教育年限、头部运动参数和BMI作为协变量。所得ALFF分布图的结果采用高斯随机场理论进行校正(体素水平P＜0.001，簇水平P＜0.05)，FC分布图的结果采用高斯随机场理论进行校正(体素水平P＜0.005，簇水平P＜0.05)。

       提取乳腺癌患者异常脑区ALFF值和FC z值，采用Spearman相关分析探讨其与神经心理测试评分之间的关系，相关分析结果采用Bonferroni校正，P＜0.0167 (0.05/3)认为差异具有统计学意义。对于每一对rs-fMRI参数和神经心理测试评分，评估以下关系：(1)在TP0时，异常脑区rs-fMRI参数和神经心理测试评分之间的关系；(2)在TP0时异常脑区rs-fMRI参数和两次时间点之间神经心理测试评分差值之间的关系；(3)从TP0到TP1，异常脑区rs-fMRI参数的差值和神经心理测试评分差值之间的相关性。

2 结果

2.1 人口学资料和神经心理测试结果分析

       本研究共招募36名行NAC的乳腺癌患者，年龄为(50.22±9.08)岁，受教育程度为(9.17±3.88)年，BMI为23.99±2.93；术前分期Ⅱ期7例(19.4%)，Ⅲ期29例(80.6%)；NAC方案包括：12例(33.3%)患者行多西他赛、多柔比星和环磷酰胺化疗(TAC)方案，12例(33.3%)患者行多西他赛、卡铂化疗(TCb)方案，6例(16.7%)患者行表柔比星、环磷酰胺，序惯以紫杉醇化疗(EC-T)方案，另外6例(16.7%)患者行多柔比星和环磷酰胺，序惯以紫杉醇化疗(AC-T)方案。其中，有3名患者拒绝TP0的神经心理测试，2名患者拒绝TP1的神经心理测试，但她们均同意进行rs-fMRI数据采集和分析。因此，共31名患者在TP0和TP1均完成神经心理测试。TP0和TP1的MRI平均扫描间隔时间为(28.56±6.48) d。与TP0相比，TP1的SAS评分显著下降(P＜0.05)，其余神经心理测试评分在TP0和TP1之间差异无统计学意义(表1)。

点击查看表格

表1  TP0和TP1神经心理测试结果比较
Tab. 1  Comparison of the neuropsychological test performance between the TP0 and TP1

2.2 ALFF和FC分析

       根据单样本t检验结果，TP0和TP1的ALFF和FC的分布如图1所示。根据配对样本t检验的结果显示，与TP0相比，TP1的右侧额中回、右侧岛叶及左侧背外侧额上回的ALFF值显著降低(图1，图2A，表2)。将上述异常脑区作为种子点行全脑体素FC分析，结果提示左侧背外侧额上回与右侧额中回之间的FC在TP1显著增高(图1，图2B，表3)。

点击查看大图

图1  低频振幅(ALFF) (1A、1B)和功能连接(FC) (1D、1E)的分布(单样本t检验)；ALFF (1C)以及FC (1F)在TP0、TP1间的分布比较(配对样本t检验)。高斯随机场理论校正；标准色条代表t值。R：右侧；L：左侧。
Fig. 1  Distribution of ALFF (1A, 1B) and FC (1D, 1E) (one-sample t-test). Comparisons of ALFF (1C) and FC (1D) between TP0 and TP1 (paired sample t-test). Corrected with Gaussian random-field theory. The color bar denotes the t-value. R: right; L: left.

点击查看大图

图2  TP0及TP1差异脑区的ALFF、FC值比较(配对样本t检验)，误差线为标准误。2A：TP0和TP1间右侧额中回、左侧背外侧额上回及右侧岛叶的ALFF值比较，高斯随机场理论校正(体素水平**P＜0.001，簇水平P＜0.05)；2B：TP0和TP1间左侧背外侧额上回和FC z右侧额叶比较，高斯随机场理论校正(体素水平*P＜0.005，簇水平P＜0.05)。
图3  Spearman相关性分析。3A：左侧背外侧额上回的ALFF值(TP0)与TP0和TP1之间SDS差值(TP0-TP1)之间的相关性；3B：TP0和TP1之间左侧背外侧额上回与右侧额中回之间功能连接z值的差值与TP0和TP1之间TMT-A耗时差值的相关性。
Fig. 2  Comparisons of ALFF and FC between TP0 and TP1 (paired sample t-test). Error bars define the SE. 2A: Comparison of ALFF in the right middle frontal gyrus, the right insula and the left dorsolateral superior frontal gyrus between the TP0 and TP1. Corrected with Gaussian random-field theory (voxel level **P＜0.001, cluster level P＜0.05); 2B: Comparison of FC z scores between the left dorsolateral frontal gyrus and the right middle frontal gyrus. Corrected with Gaussian random-field theory (voxel level *P＜0.005, cluster level P＜0.05).
Fig. 3  Spearman correlation analysis. 3A: The correlation between the ALFF value (TP0) of the left dorsolateral frontal gyrus and SDS difference between TP0 and TP1 (TP0-TP1); 3B: The difference in z value of FC between the left dorsolateral frontal gyrus and the right middle frontal gyrus between TP0 and TP1 correlated with the difference in TMT-A time costing between TP0 and TP1.

点击查看表格

表2  TP0与TP1间低频振幅存在显著差异的脑区
Tab. 2  Brain regions with significant ALFF differences between TP0 and TP1

点击查看表格

表3  TP0与TP1间功能连接存在显著差异的脑区
Tab. 3  Brain regions showing significant functional connectivity differences between TP0 and TP1

2.3 相关性分析

       经过Bonferroni校正，P＜0.0167 (0.05/3)认为差异具有统计学意义。左侧背外侧额上回在TP0的ALFF值，与TP0与TP1间SDS的变化呈显著正相关(ρ=0.429，P=0.016；图3A)；左侧背外侧额上回与右侧额中回的功能连接z值的变化与TMT-A耗时的变化呈显著正相关(ρ=0.443，P=0.012；图3B)。其余异常脑区的rs-fMRI参数与神经心理测试评分之间的相关性均不显著。

3 讨论

       本研究首先采用ALFF和FC的方法评估乳腺癌患者行1周期NAC后大脑自发性和同步性功能活动的早期变化，并排除了手术的影响。研究结果发现，在乳腺癌患者完成第1周期NAC后，SAS评分显著下降，其余神经心理测试评分在TP0和TP1之间无显著差异。此外，与TP0相比，TP1的右侧额中回、右侧岛叶及左侧背外侧额上回的ALFF值显著降低；将上述异常脑区作为种子与全脑其余体素行功能连接分析，结果显示左侧背外侧额上回与右侧额中回间的FC显著增高。这些发现提示化疗所致脑功能改变先于认知功能改变，并且化疗所致早期脑损害可能涉及执行功能以及情绪调控等相关脑区。

3.1 额中回、岛叶及背外侧额上回是化疗所致脑损害的关键靶区，其可能与执行功能损害相关

       既往研究证实执行功能受损是化疗认知相关认知障碍的主要表现之一^[3]。本研究发现乳腺癌患者在第1周期NAC后，右侧额中回、右侧岛叶及左侧背外侧额上回的ALFF值显著降低。额中回、岛叶及背外侧额上回均在执行功能中发挥重要作用^{[17, 18, 19, 20]}。既往研究提示，乳腺癌患者化疗后，背外侧额上回及岛叶的功能活动异常与执行功能受损相关^{[21, 22]}。另外，一项关于衰老的研究显示，额中回和颞中回之间的功能连接与执行功能具有显著相关性^[23]。虽然在本研究中，神经心理测试中并没有发现执行功能的异常，但患者的执行功能相关脑区存在功能改变，这与以往的研究结果具有一定相似性^{[21, 22, 23]}。此外本研究还发现，第1周期NAC后左侧背外侧额上回与右侧额中回间的FC显著增加，并且二者之间功能连接z值的变化与TMT-A耗时的减少呈显著正相关，这可能由大脑的代偿机制所致。我们推测，在第1周期NAC后脑功能已经发生了改变，但由于大脑存在一定的代偿机制，大量募集认知资源以维持正常的认知功能，神经心理测试中并没有发现执行功能的异常，这也进一步说明了MRI功能成像可以更早发现化疗对大脑的损伤。

3.2 背外侧额上回的功能储备能力可能与负性情绪的调节能力相关

       乳腺癌在第1周期NAC后焦虑程度缓解，这与以往多数研究结果相似^{[24, 25, 26]}。乳腺癌患者在早期经常预期疾病和治疗会带来更多的负面影响，从而经历更高水平的焦虑^[27]。经过一段时间的治疗，由于肿块体积减小，疼痛减轻，患者的焦虑水平可能降低^[28]。既往研究发现，背外侧额上回参与了抑郁等负性情绪的调节^{[29, 30]}。在本研究中，乳腺癌患者左侧背外侧额上回在TP0的ALFF值与TP0与TP1间SDS的变化呈显著正相关，这可能反映了大脑的功能储备功能，背外侧额上回的功能储备能力越强，就越容易调节抑郁这种负性情绪。

       本研究的局限性为样本量较小，患者采用了不同的化疗方案，且部分患者同时接受了靶向治疗，这导致了样本的异质性，需要在未来的研究中扩大样本量，并进行分组进一步探索。此外，本研究的FC分析只有在检验水准为体素水平P＜0.005，簇水平P＜0.05时才获得了阳性结果，虽然更为严格的检验水准并不能有效避免假阳性^[31]，但是本研究中的FC分析结果仍需要谨慎解释。

       综上所述，本研究采用ALFF和FC来表征乳腺癌患者行第1周期NAC后脑的自发性和同步性功能活动的纵向变化，并排除了手术的影响。研究发现乳腺癌患者在右侧额中回、左侧背外侧额上回及右侧岛叶出现异常脑活动，它们可能参与执行功能相关的认知功能以及情绪的调控改变。