乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，在临床、组织学和分子水平均表现出多样性的特点^{[1, 2]}。Ki-67是由MKI67基因编码的细胞核蛋白质，Ki-67指数即蛋白质染色阳性细胞的百分比。一般情况下，Ki-67指数越高，表明细胞分裂增殖越活跃、侵袭性越强^[3]。对于Ki-67高表达的乳腺癌分子亚型，需采取及时、强效的干预措施，以控制疾病进展。在临床实践中，乳腺癌术前肿瘤侵袭性的评估主要依靠穿刺活检，通过局部组织的病理学检测来评估Ki-67的表达水平。然而，穿刺活检为有创性检查，且取材较为局限，往往难以获取肿瘤组织的完整信息。因此如何能够在治疗前无创、精准地评估乳腺癌的Ki-67表达状态是十分有意义的临床问题。

       MRI具有高软组织分辨率的优势，已被广泛应用于乳腺癌的诊断与疗效评估中^[4]。然而，传统乳腺MRI需要采集多个序列，而且图像的解读主要基于不同组织的对比度，易受诊断医生主观经验的影响。此外，不同设备所采集的图像差异较大，图像标准化流程繁琐，难以适用于多中心研究。合成MRI是一种新型的成像方法，通过使用多回波和多延迟采集方法，一次扫描即可快速采集多种定量参数图像[如T1-mapping、T2-mapping及质子密度（proton density, PD）-mapping]并准确量化组织的相应定量参数值（如T1值、T2值以及PD值）^[5]。该技术已应用于全身多个部位如大脑^{[6, 7, 8, 9]}、骨关节^{[10, 11]}、前列腺^[12]及乳腺^{[13, 14]}等，有研究证明合成MRI的临床应用具有较高的准确性和较好的可重复性^[15]。有研究分析得出合成MRI相关定量参数图的直方图特征是鉴别乳腺浸润性导管癌相关免疫组化指标和分子亚型的潜在生物标志物^[16]。然而，合成MRI定量参数图的直方图特征是否能够用于无创性评估乳腺癌Ki-67的表达状态尚不明确。因此，本研究的目的是评估合成MRI相关定量参数图直方图特征对乳腺癌Ki-67表达状态的预测价值，并与传统的表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）图直方图特征进行比较。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       该回顾性研究得到了潍坊市中医院医学伦理委员会的批准，免除受试者知情同意（批准文号：2021-02号）。本研究对自2019年12月至2021年3月期间在潍坊市中医院就诊的乳腺癌患者病例进行了评估。纳入标准：（1）MRI检查前均未行临床治疗，检查后1周内行手术或穿刺术取得病理标本；（2）经穿刺活检或手术病理确诊为乳腺癌；（3）MRI扫描序列完整，包括扩散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）、动态对比增强MRI（dynamic contrast-enhanced MRI, DCE-MRI）和合成MRI；（4）乳腺癌患者均为女性。排除标准：（1）图像有严重的伪影；（2）增强图像病灶呈非肿块型强化；（3）病灶最大径＜1 cm。

1.2 MRI扫描方案

       乳腺MRI扫描采用3.0 T MRI系统（SIGNA Pioneer, GE Healthcare），患者取俯卧位，双乳自然下垂置于8通道相控阵乳房表面线圈内。依次进行常规轴位快速自旋回波（fast spin echo, FSE）T1WI序列、短时反转恢复（short time inversion recovery, STIR）T2WI序列和DWI（b=0、800 s/mm²）序列、合成MRI序列及DCE-MRI序列（共8期）扫描。静脉注射对比剂[钆双胺注射液（欧乃影），GE药业，爱尔兰]，速率2 mL/s，剂量0.1 mmol/kg。各序列详细扫描参数见表1。

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表1  不同磁共振成像序列扫描参数
Tab. 1  Scan parameters of different magnetic resonance sequence

1.3 直方图特征提取及MRI影像特征分析

       MAGIC的原始图像数据使用SyMRI 8.0软件（SyntheticMRI, Linköping, Sweden）处理以生成定量参数图（T1-mapping、T2-mapping和PD-mapping）（图1A～1C）。为了清晰准确地勾画病灶边界，我们首先对DCE-MRI的第二期（病灶边缘最明显的峰值增强相）图像与处理后的MAGIC图像在MATLAB（MathWorks, Natick, MA）中进行配准。然后两位分别具有5年和8年乳腺影像诊断经验的主治医师使用ITK-SNAP（http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php）软件在配准的DCE-MRI图像上手动逐层勾画感兴趣区（region of interest, ROI），最终得到3D-ROI（图1D、1E），勾画时尽量避开坏死、囊变及出血区域。当同侧乳腺存在多个肿块时，评估最大的一个肿块。两位诊断医师在勾画ROI时对临床资料、病理结果和其他影像学检查结果均不知晓。最后，应用Pyradiomics软件提取定量参数图T1-mapping、T2-mapping、PD-mapping的直方图特，包括10^th位数、90^th位数、均值、熵、峰度、偏度。在DWI（b=800 s/mm²）原始图像上手工逐层放置ROI，将获得的ROI复制到ADC图提取ADC图的直方图特征，方法同上（图1F、1G）。

       MRI影像特征的评估也由同样由以上两位主治医师进行，包括病灶最大径（DCE-MRI第二期测得）、形态（圆形或卵圆形、不规则形）、边缘（光整、不光整）、强化方式（均匀、不均匀、环形强化）、纤维腺体类型（脂肪型、少量腺体型、多量腺体型、致密型）。

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图1  女，48岁，右乳浸润性导管癌，组织学分级Ⅲ级，Ki-67高表达（60%）。1A～1C分别代表合成磁共振定量参数质子密度（PD）-mapping、T2-mapping及T1-mapping图；1D为在动态增强图像上逐层勾画感兴趣区（ROI）；1E为最终获得的3D-ROI；1F为扩散加权成像(DWI)图；1G为表观扩散系数（ADC)图。
Fig. 1  Female, 48-year-old, invasive ductal carcinoma in the right breast, histological grade Ⅲ, high expression of Ki-67 (60%). 1A-1C: Synthetic magnetic resonance imaging (SyMRI) quantitative parameter proton density (PD)-mapping, T2-mapping and T1-mapping; 1D: A region of interest (ROI) was placed layer by layer in the tumour of the dynamic contrast-enhanced (DCE)-MRI; 1E: 3D-ROI; 1F diffusion-weighted imaging (DWI) map; 1G: Apparent diffusion coefficient (ADC) map.

1.4 病理评估

       病理结果判定，Ki-67免疫组织化学染色反应细胞核表现为棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选10个高倍镜视野（×400），计算平均阳性细胞数：阳性细胞数＜30%为低表达组，≥30%为高表达组（图2）。ER、PR染色阳性细胞比例大于1%记为阳性。免疫组织化学检测显示HER-2为3+记为阳性，1+或0记为阴性，如果HER-2为2+，应再进行荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization, FISH）检测以明确HER-2状态，FISH结果阳性记为HER-2阳性，FISH结果阴性记为HER-2阴性。

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图2  2A、2B分别为乳腺癌Ki-67低表达（10%）和Ki-67高表达（80%）的病理图片（×400）。
Fig. 2  2A and 2B pathological pictures of breast cancer with low (10%) and high (80%) expression of Ki-67 (×400).

1.5 统计学方法

       采用SPSS 26.0、MedCalc和GraphPad Prism 9.0统计软件进行数据分析和统计作图，定量参数图及ADC图的直方图特征以P＜0.01为差异有统计学意义，临床及病理特征以P＜0.05为差异有统计学意义。经Shapiro-wilk检验符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，不符合正态分布的计量资料以中位数（P25，P75）表示，组间比较采用独立样本t检验（independent sample t检验）或非参数检验（Mann-Whitney U检验）；计数资料采用χ²检验或Fisher确切概率法进行组间比较。将差异有统计学意义的参数纳入多因素logistic回归分析，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线，并计算鉴别乳腺癌Ki-67表达状态的曲线下面积（area under the curve, AUC）、敏感度、特异度及准确度。

2 结果

2.1 一般情况及病理免疫组化结果

       146例患者均为女性，年龄（49.86±9.83）岁，共147个病灶，其中一例患者左、右乳各一个病灶。病理结果均为非特殊类型乳腺癌，其中浸润性导管癌130例、浸润性小叶癌4例、浸润性导管癌伴导管原位癌11例、浸润性导管癌伴浸润性小叶癌1例，微乳头状癌1例。分子分型包括：Lumina A型29例，Lumina B型66例，HER-2过表达17例，三阴性（triple negative, TN）35例。147例乳腺癌病灶Ki-67指数2%～95%，平均值39.86%±25.61%，其中低表达56例，高表达91例。

2.2 Ki-67高表达组与低表达组患者的临床、MRI影像特征比较

       Ki-67高表达组与低表达组间，患者的年龄、病灶最大径、形态、边缘、强化方式及纤维腺体类型差异均无统计学意义（P值范围为0.09～0.94）（表2）。

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表2  乳腺癌Ki-67高、低表达组临床及MRI影像特征比较
Tab. 2  Comparison of the clinical and MRI characteristics of breast cancer between the high and low expression of Ki-67

2.3 Ki-67高、低表达间MRI相关定量参数比较

       Ki-67高表达组与低表达组间，T1-平均值（P＜0.001）、T1-10^th位数（P＜0.001）、T2-平均值（P=0.002）、T2-10^th位数（P＜0.001）、PD-熵值（P=0.005）及PD-峰度（P＜0.001）的差异具有统计学意义，其中Ki-67高表达组的T1-平均值、T1-10^th位数、T2-平均值、T2-10^th位数和PD-峰度均大于Ki-67低表达组，Ki-67高表达组PD-熵值小于Ki-67低表达组（表3）。Ki-67高表达组与低表达组间，ADC值的直方图特征差异均无统计学意义（P值范围0.14至0.96）。T1-平均值、T1-10^th位数、T2-平均值、T2-10^th位数、PD-熵值及PD-峰度区分Ki-67高、低表达的AUC值分别为0.69、0.75、0.68、0.74、0.63、0.67（表4）。

       将以上差异有统计学意义的参数纳入多因素logistic回归分析得出，T1-10^th位数、T2-10^th位数是Ki-67表达状态的独立预测因素（表5）。采用箱式图显示T1-10^th位数、T2-10^th位数在Ki-67高、低表达组间数据的差异（图3）。联合T1-10^th位数、T2-10^th位数建立logistic回归模型进行诊断效能分析，得出AUC值为0.809（95% CI：0.737～0.869），敏感度为64.8%，特异度为87.5%，准确度为72.8%（图4）。

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图3  T1-10^th位数（3A）、T2-10^th位数（3B）在Ki-67高、低表达组分布的箱式图。Ki-67：细胞增殖指数；10^th位数：第十百分位数。
Fig. 3  Box-whisker plot showing the T1-10^th (3A), T2-10^th (3B) percentile of the high and low expression of Ki-67.

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图4  合成磁共振定量参数图直方图特征联合诊断模型预测Ki-67高、低表达情况的ROC曲线。Ki-67：细胞增殖指数；ROC：受试者工作特征。
Fig. 4  Receiver-operating characteristic (ROC) curve of predicting the high and low expression of Ki-67 by the combined diagnostic model of the histogram features of synthetic magnetic resonance imaging (SyMRI) quantitative parametric map.

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表3  Ki-67高、低表达组间合成MRI定量参数图、ADC值直方图特征比较
Tab. 3  Comparison of histogram features of synthetic MRI quantitative parameters and ADC values between the high and low expression of Ki-67

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表4  Ki-67高、低表达组间差异有统计学意义的定量参数的诊断效能
Tab. 4  The diagnostic efficacy of quantitative parameters with statistical significance between the high and low expression of Ki-67

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表5  区分Ki-67高、低表达组的多因素logistic回归分析
Tab. 5  Multivariate logistic regression analysis to distinguish the high and low expression of Ki-67

3 讨论

       Ki-67表达状态是辅助乳腺癌分子分型、预测乳腺癌患者预后及新辅助治疗疗效的重要指标，可为临床个体化精准诊疗提供依据。本研究探讨了乳腺癌合成MRI定量参数图及ADC图直方图特征与Ki-67表达状态的关系，研究得出T1-10^th位数与T2-10^th位数是预测Ki-67状态的独立预测因素,这为治疗前精准评估乳腺癌肿瘤细胞的增殖情况提供了一种新的辅助诊断方法。

3.1 合成MRI定量参数直方图特征的临床意义

       合成MRI是一种2D自旋回波多动态多回波扫描技术，一次扫描即可获得T1、T2、PD三种定量参数图像且可重建任意对比加权图像。合成MRI获取的图像显示了仅基于单个组织参数的纯对比度，并且由于内部B1场的校正，可以最大限度减少透射射频场B1对图像的影响，这些特点为多中心研究提供了支持。与传统的T1、T2、PD定量方法相比，合成MRI扫描可以减少长时间采集过程中可能出现的运动伪影等影响。本研究使用了3D-ROI画法，相对于以往在最大层面绘制ROI,可以获取更加完整的肿瘤信息，从而更全面地反映病变的整体异质性。另外，直方图特征可以将影像数据转化为具有高分辨率的可发掘的特征空间数据，之前乳腺肿瘤领域的直方图特征大多基于DWI或DCE-MRI技术，基于合成MRI定量参数图的直方图特征少有报道。

3.2 评估Ki-67高低表达状态对于乳腺癌的重要性

       Ki-67水平可以反映乳腺肿瘤的增殖情况^[17]。肿瘤增殖活性越高者，Ki-67指数越高。世界卫生组织将Ki-67小于14%的情况称之为低表达，但是不同种族、地区、国家的患者及不同卫生组织，Ki-67水平高低的评定标准有所区别。有研究对1800例早期TNBC患者Ki-67最佳分界进行评估得出与预后最密切的临界值是30%^[18]。Sachiko等^[19]将乳腺癌Ki-67以30%为界分为Luminal A型和Luminal B型。中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2021版）表明Ki-67增殖指数的判定值在不同病理实验中心可能有所不同，可采用20%～30%作为判断Ki-67高低的界值。2021年乳腺癌Ki-67国际工作组根据最新的评估标准将 Ki-67＞30%定义为高表达^[20]。根据本研究乳腺癌Ki-67数据的表达情况并结合以上标准，将Ki-67≥30%定义为高表达，＜30%定义为低表达。Ki-67在乳腺癌的诊断、指导治疗、预后判断以及判断新辅助化疗疗效等方面具有重要价值。目前临床上Ki-67增殖指数主要通过活检或手术后取材标本获得，不仅为有创性检查，且不能反映整个肿瘤的异质性，准确率还常受抽样误差的影响，另一方面Ki-67增殖指数是动态变化的^[21]，活检或手术后取材标本的方法无法便捷、有效地反映Ki-67增殖指数的变化情况。

3.3 合成MRI定量参数T1值、T2值与乳腺癌Ki-67的关系

       组织病理学是肿瘤影像学表现的基础，因此MRI可以间接反映乳腺癌的免疫组织化学相关指标的表达情况^[22]。MRI定量成像手段不仅能够在术前无创反映肿瘤整体的异质性，还可以进行多次动态评价，对指导临床个性化诊断、治疗及预后有重大意义。T1值是组织的纵向弛豫时间，与组织含水量、水结合力和大分子浓度有关。以往T1定量值多用于评估心肌纤维化、肝纤维化以及膝关节软骨损伤，在乳腺癌Ki-67表达方面的研究较少。Matsuda等^[23]对乳腺病变注射对比剂前、后的T1、T2和PD值及其标准差进行分析，发现注射对比剂后T1值的标准差是Ki-67表达的独立预测因素，AUC值可达到0.885。此外，该研究团队^[15]还将乳腺病变注射对比剂前、后的T1、T2和PD值及其差值和比值纳入统计学分析，发现乳腺恶性病变注射对比剂前T1值高于良性病变。本研究中，Ki-67高表达组的T1-平均值及T1-10^th均高于Ki-67低表达组，分析认为可能与Ki-67高表达组肿瘤呈高增殖，肿瘤细胞密度高、瘤内更易出血、坏死有关。

       T2值反映的是人体组织自由水分子之间能量交换的能力，主要与自由水含量、蛋白多糖、胶原含量和排列方式有关。Jung等^[24]报道合成MRI获得的乳腺癌T2弛豫时间与基于多回波自旋回波（multi-echo spin echo, MESE）T2-mapping的T2弛豫时间呈正相关，这说明合成MRI所测得的T2值同样可反映机体组织的微观变化。有研究认为当恶性程度较高的肿瘤发生邻近组织侵犯时，会分泌较多的透明质酸酶，而透明质酸酶具有延长横向弛豫时间的属性，是造成T2值较高的原因^[25]。本研究中Ki-67高表达组的T2-10^th高于低表达组，可能与Ki-67高表达组肿瘤组织增殖活性程度高及侵袭性强有关。

3.4 ADC值与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性研究结果不一致

       ADC值能够反映组织水分子扩散受限的程度。目前普遍认为细胞体积或特殊的空间排列以及细胞的密集程度是影响水分子运动的重要因素^[26]。以往有研究表明ADC值与Ki-67指数呈负相关^[27]，即Ki-67指数越高，细胞增殖越明显，相应地ADC值就越低。但也有研究显示乳腺癌的ADC值与Ki-67无明显相关性^{[28, 29]}。李芹等^[30]研究浸润性乳腺癌ADC值与Ki-67无显著相关性，作者分析可能与病例中未排除非肿块型病灶有关。由此可见，ADC值与Ki-67的相关性有待进一步研究。在本研究中，Ki-67高、低表达组之间的ADC图的直方图特征之间没有显著差异，分析原因可能是由于乳腺癌基质成分较复杂，癌灶内可能存在的微钙化及微液化坏死区对ADC值的影响等因素有关。此外，乳腺癌新生血管丰富，血流灌注也可能成为影响ADC值的重要因素。

3.5 局限性及展望

       本研究有一定的局限性：（1）本研究属于单中心研究，未进行外部验证；（2）本研究DWI为单指数模型，相对于多b值DWI模型的研究[如体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion, IVIM）]，可能未完全排除微血管灌注对ADC值的影响；（3）本研究未将最大径＜1 cm的乳腺癌病变纳入分析，因此建立的模型对该类病变Ki-67表达状态的预测效能尚不可知。下一步研究将会探讨多b值DWI与乳腺癌免疫组化指标的关系，并且对于＜1 cm的乳腺癌病变还需要进一步研究。

       综上所述，合成MRI定量参数图的直方图特征可以用于评估乳腺癌Ki-67的表达状态，这为术前全面地预测乳腺癌的侵袭性提供了一种新的无创性方法。