肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）为运动神经元疾病的最常见形式，是一种伴随着上、下运动神经元变性的神经系统退行性疾病，其症状包括肌肉无力、肌肉痉挛、萎缩和瘫痪，随着时间的推移，疾病发作的模式和传播的速度亦高度可变，尽管后期针对患者采取人工生命支持手段，但疾病进展最终会导致呼吸肌功能障碍和死亡^[1]。由于ALS的病理与生理学机制尚不清楚，临床上难以在疾病早期作出准确诊断。因此，需要寻找一个客观有效的检查方法或诊断指标，而影像学研究作为潜在生物标志物在ALS疾病研究中发挥越来越重要作用。

       弥散张量成像（diffusion tensor imaging, DTI）是一种成熟且灵敏的MRI技术，用来评估大脑中神经纤维的完整性、方向一致性和组织微观结构^[2]。应用DTI技术研究发现ALS患者在皮质脊髓束、放射冠、内囊后肢等结构各向异性分数（fractional anisotropy, FA）值降低^[3]。此外，研究表明皮质脊髓束FA值与修订版ALS功能评分量表（Revised ALS Functional Rating Scale, ALSFRS-R）之间存在相关性^[4]。然而，先前的研究主要集中于ALS患者白质完整性的区域异常，局灶性白质变化对大脑网络完整性的影响尚不确定。

       人脑是一个复杂网络，有超过1000亿个神经元通过数万亿个网络相互连接。基于图论理论的现代研究充分理解大脑结构网络连接的复杂性，对大脑结构网络拓扑属性研究提供了一个更有价值的工具。图论是一种通过将皮质和皮质下区域表示为节点，并将白质束互连为数学图上的边来重建和评估大脑连接网络的方法，可以分析大脑网络的拓扑结构，并阐明不同大脑区域之间的相互关系^[5]。目前，针对ALS的结构网络分析研究较少，有研究发现与健康对照（healthy controls, HCs）组相比，ALS患者结构网络整体改变，全局效率降低，全脑平均度降低^[6]。之前一篇文献报道ALS结构网络的破坏与运动功能障碍有关^[2]。应用人脑连接组学研究发现ALS患者运动^[7]和运动外区域结构损伤^[8]，ALS患者也可能存在一定的认知功能损伤^[9]。然而，在ALS患者中，白质结构网络属性变化与运动功能和认知功能的关系目前尚不清楚。因此本文拟采用DTI技术，依据图论理论，研究ALS患者和HCs之间大脑白质结构网络的拓扑特性差异，进一步探索ALS患者的大脑结构网络的完整性与运动功能及认知功能的关系，以期为ALS的早期评估和干预提供客观的影像学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       前瞻性招募2015年5月至2019年3月在陆军军医大学第一附属医院神经内科确诊的25例ALS患者，其中男13例，女12例，其诊断符合世界神经病学联盟的修订版EI Escorial诊断标准^[10]。同时招募年龄、性别匹配的26例健康志愿者作为HCs组，其中男19例，女7例，HCs组既往无头部损伤史、神经或精神科诊断，临床检查正常。被试均为右利手。ALS组纳入标准：（1）符合修订版EI Escorial诊断标准的ALS患者；（2）患者在MRI扫描期间能够仰卧；（3）MRI检查未见明显脑实质病变。ALS组排除标准：（1）高血压、脑血管病及其他神经系统病变相关疾病；（2）患有急性或严重威胁生命的疾病，有心脏起搏器、金属关节、幽闭恐惧症等MRI检查禁忌证；（3）严重的视觉、听觉或语言障碍不能配合认知量表评估；（4）服用精神类药物或药物滥用。

       所有ALS患者在MRI检查当天均接受了标准化临床检查。记录的人口统计学和神经心理量表参数包括：病程、发病部位、ALSFRS-R评分、简易精神状态检查（Mini-Mental State Examination, MMSE）量表和蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）进行评价。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并经陆军军医大学第一附属医院医学伦理委员会批准（KY202231），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 影像数据采集

       MRI是在陆军军医大学第一附属医院放射科的德国西门子3.0 T MR扫描仪（Trio，Siemens Medical，Erlangen，Germany）上进行，扫描线圈为标准8通道头颅线圈。实验时用套垫固定被试头部，确保被试整个扫描期间头部稳定。高分辨率1H T1加权像采用3D MPRAGE序列矢位状扫描，扫描参数如下：TR 1900ms，TE 2.52 ms，翻转角9°，FOV 256 mm×256 mm，矩阵256×256，层厚1.0 mm，层数176层，采集时间约6 min。DTI图像是使用单次激发回波平面成像（echo-planar imaging, EPI）序列，图像采集参数如下：TR 10 000 ms，TE 92 ms，翻转角90°，FOV 256 mm×256 mm，扩散敏感梯度方向64个，b值=1000 s/mm²，层厚2 mm，无层间距，采集时间约12 min。

1.3 DTI图像处理

       应用大脑磁共振图像处理软件FSL( Funtional MRI Software Library 4.1.0，Oxford，http://www.mrib.x.c.k/fsl)对DTI图像数据进行预处理。使用FSL软件的FDT工具箱对DTI数据进行仿射对准，用b=0 s/mm²图像来校正DTI数据的涡流失真和运动伪影；应用FSL中的DTIFIT来估计差异张量和基本DTI参数，并计算每个体素的FA值得到FA图。

1.4 结构网络构建与图论处理

1.4.1 结构网络构建

       在Linux操作系统下，采用PANDA软件构建白质结构网络^[11]。将自动解剖标记图谱（automated anatomical labeling, AAL）应用于全脑束成像重建^[12]，将脑网络划分为90个节点，对应于AAL图谱上的感兴趣区域，并互连代表重建白质束的边。使用AAL模板上连接任意两个节点的平均FA值来评估区域之间的结构连通性，进行确定性纤维束成像算法，以获得原始扩散空间中的每个受试者的全脑纤维束成像，如果FA值小于0.2，且路径跟踪的曲率大于45°则终止追踪^[13]。当重建纤维束的端点位于两个区域内，则设为两个脑区之间的网络边。网络边是大脑区域之间的纤维束数量与纤维束的平均FA的乘积的函数^[14]。通过脑区体积平均，对网络边加权函数进行归一化，以校正不同大小的脑区和不同的大脑尺寸。则为每个被试构建FA无向、加权的90×90连接矩阵。

1.4.2 网络图论分析指标

       所有图论分析均使用GRETNA软件（http://www.nitrc.org/projects/gretna/）进行。针对加权的白质网络，计算全局和局部网络参数指标^[5]，包括：全局指标有全局效率（global efficiency, Eglob）、局部效率（local efficiency, Eloc）、特征路径长度（characteristic path length, Lp）、集聚系数（clustering coefficient, Cp）、标准化特征路径长度（normalized characteristic path length, λ）和小世界属性（small-world parameter, σ）。对于局部网络节点参数，计算节点效率（nodal efficiency, Ne）、介值中心性（betweenness centrality, Bc）。

1.5 统计学分析

       运用SPSS 22.0统计软件对ALS组和HCs组年龄差异行双样本t检验，对两组间性别变量差异采用χ²检验比较，均为双尾检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。运用GRETNA软件，统计组间网络参数（全局和节点参数）差异，采用基于非参数置换检验（10 000次）方法，统计分析组间网络参数的差异。相关分析运用SPSS 22.0软件，纳入协变量（年龄、性别、受教育年限），将ALS组的结构拓扑网络异常参数值：网络全局参数值、组间差异有统计学意义的脑区节点参数值，依次与ALS被试组的ALSFRS-R、MMSE、MoCA评分进行偏相关分析，以双尾P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人口统计学和临床特征统计

       ALS组和HCs组人口统计特征见表1。χ²检验分析发现，两组间在性别上差异无统计学意义，双样本t检验分析发现，两组间在年龄上差异无统计学意义（P＞0.05）。

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表1  两组间人口统计学和神经心理量表统计表
Tab. 1  Comparison of demographic and neuropsychological scale scores between ALS group and HCs group

2.2 结构网络参数属性分析

2.2.1 ALS组和HCs组全局参数分析

       结构网络全局参数计算结果分析见表2，与HCs组相比发现，ALS组网络Eloc显著增强（P=0.014），λ显著增长（P=0.006）。此外，由结构网络σ的定义发现，两组σ＞1，表明两个受试者组的结构网络均具有小世界组织特征，其他参数未发现组间差异有统计学意义。

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表2  ALS组和HCs组间全局网络参数比较
Tab. 2  Comparison of global network properties in ALS and HC subject groups

2.2.2 ALS组和HCs组局部节点参数分析

       与HCs组相比发现，ALS组在右侧眶部额中回、右侧枕上回、右侧嗅皮质、右侧角回、左侧眶部额上回、左侧前扣带回、左侧楔前叶、左侧丘脑和双侧尾状核10个脑区的节点效率值Ne增加（图1，P＜0.05，FDR校正），未发现Ne降低脑区。

       与HCs组相比发现，ALS组在右侧中央前回、左侧楔叶和左侧中央后回节点Bc降低，而在左侧眶部额上回和左侧岛盖部额下回脑区发现Bc增加（图2，P＜0.05，FDR校正）。

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图1  肌萎缩侧索硬化症与健康对照组白质结构网络的节点效率值差异有统计学意义脑区分布图（P＜0.05，FDR校正），颜色条表示t值大小，暖色代表节点效率值升高。图中各缩写代表的含义：ORBsup为眶部额上回；OLF为嗅皮质；ORBmid为眶部额中回；ACG为前扣带回；SOG为枕上回；ANG为角回；PCUN为楔前叶；THA为丘脑；CAU为尾状核。
Fig. 1  Significant difference in node efficiency (Ne) between amyotrophic lateral sclerosis group and healthy controls group (P＜0.05, FDR corrected). The color bar indicates t value, and the warm colors represent the increase of node efficiency. Meanings of abbreviations in the figure, ORBsup: Superior frontal gyrus, orbital part; OLF: Olfactory cortex; ORBmid: Middle frontal gyrus, orbital part; ACG: Anterior cingulate and paracingulate gyri; SOG: Superior occipital gyrus; ANG: Angular gyrus; PCUN: Precuneus; THA: Thalamus; CAU: Caudate nucleus.

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图2  肌萎缩侧索硬化症组与健康对照组白质结构网络的介质中心性差异有统计学意义脑区分布图（P＜0.05，FDR校正），颜色条表示t值大小，暖色代表介质中心性值升高，冷色代表介质中心性值降低。图中各缩写代表的含义：PreCG为中央前回；ORBsup为眶部额上回；IFGoperc为岛盖部额下回；CUN为楔叶；PoCG为中央后回。
Fig. 2  Significant difference in betweenness centrality (Bc) between amyotrophic lateral sclerosis group and healthy controls group (P＜0.05, FDR corrected). The color bar indicates t value, the warm colors represent the increase of betweenness centrality, and the colds color represent the decrease of betweenness centrality. Meanings of abbreviations in the figure, PreCG: Precentral gyrus; ORBsup: Superior frontal gyrus, orbital part; IFGoperc: Inferior frontal gyrus, opercular part; CUN: Cuneus; PoCG: Postcentral gyrus.

2.3 相关分析结果

       将年龄、性别和教育年限作为协变量，分别将拓扑网络全局参数（Eglob、Eloc、Lp、Cp、σ）和节点参数（Ne、Bc）与ALS患者ALSFRS-R、MoCA和MMSE量表进行偏相关分析，发现ALS组左侧岛盖部额下回的局部参数Bc与ALSFRS-R评分存在负相关关系（r=-0.514，P=0.012）（图3A），即左侧岛盖部额下回Bc值越高，ALSFRS-R评分越差。ALS组左侧丘脑的Ne与MoCA评分存在正相关关系（r=0.539，P=0.008）（图3B），即左侧丘脑Ne值越低，认知功能越差。其他网络参数未发现和ALS组量表之间的存在显著相关性。

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图3  肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者结构网络局部节点参数与神经心理量表Pearson相关分析。3A：左侧岛盖部额下回（inferior frontal gyrus pars opercularis，IFGoperc）介值中心性（Bc）值与修订版ALS功能评分量表（ALSFRS-R）评分呈负相关关系（r=-0.514，P=0.012）；3B：左侧丘脑（Thalamus，THA）节点效率（Ne）值与蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分呈正相关关系（r=0.539，P=0.008）。
Fig. 3  Pearson correlation analysis between local node parameters of structural network and neuropsychological scale in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). 3A: negative correlation between the betweenness centrality (Bc) of left inferior frontal gyrus pars opercularis and revised ALS functional rating scale (ALSFRS-R) score (r=-0.514, P=0.012); 3B: positive correlation between the node efficiency (Ne) of left thalamus and Montreal Cognitive Assessment (MoCA) score (r=0.539, P=0.008).

3 讨论

       本研究采集DTI数据并利用图论分析探索ALS患者全脑结构网络拓扑属性，发现ALS组和HCs组的大脑结构均具有小世界特性，与HCs相比，ALS患者大脑的λ增大，Eloc增强。除了全局网络参数的改变外，节点网络参数也受到影响，结构网络拓扑参数变化与疾病运动和认知程度相关，相关参数可为ALS疾病的诊断及预后评估提供客观依据，具有重要的临床应用价值。

3.1 ALS白质结构网络全局拓扑参数变化

       基于图论分析能够对整个大脑结构网络进行拓扑研究，网络分析可使用多种参数来评估人脑网络的拓扑模式，例如σ、Lp、Bc等参数。与随机网络相比，小世界组织具有较高的聚类系数和较短的平均路径长度，这样组织起来的大脑网络，能满足网络组件之间资源成本最小化和信息流最大化之间的平衡^[15]，既可以进行专门的信息处理，也可进行综合信息处理，从而最大限度地提高信息传播的效率。本研究发现ALS组和对照组大脑结构网络的σ差异无统计学意义，表明两组被试的大脑结构均具有小世界拓扑组织特性。尽管两组均存在小世界拓扑结构，但ALS患者与对照组相比，在全局网络参数上存在显著改变，其特征是Eloc显著增强、λ显著增加。Eloc用来测量网络的容错能力，本文发现ALS组相较于HCs组发生增加变化，可能反映ALS患者结构网络的整体整合能力受到干扰。λ是真实网络和100个随机网络之间的Lp之比，它量化了网络的总体路由效率^[16]。本研究发现ALS组相较于HCs组λ增加，可能ALS组大脑存在网络整合的中断，反映了ALS患者的网络传递性降低，网络整合被破坏，这与之前Renga等^[17]的报道基本一致。

3.2 ALS白质结构网络局部拓扑参数变化

       本研究发现ALS组在右侧眶部额中回、左侧眶部额上回、左侧前扣带回、左侧楔前叶、双侧尾状核等多个脑区的Ne显著增加。Ne反映了特定节点的直接邻域之间的集成程度，其发生增高或降低改变，表明该节点与其直接邻域之间的集成度改变。先前一篇多中心研究报告ALS患者的感觉运动区、基底节、额叶和顶叶区域局部拓扑改变^[18]。本研究主要发现ALS患者非运动脑区Ne显著增加，我们推测这可能是对运动功能区损伤的一种代偿反应。扣带回是连接额叶、顶叶和颞叶内侧区域的复杂结构^[19]，在执行功能和情景记忆中起重要作用。在ALS患者中，扣带回的损伤可能导致执行功能障碍和记忆缺陷。额叶结构退行性变是ALS的一个标志性特征，多项研究证实了这一点^{[20, 21]}。尾状核是基底神经节的重要组成部分，基底神经节是具有高代谢活性的深部灰质核，大脑需要充足的血液循环和能量来维持基底神经节的正常功能^[22]。已知ALS疾病的一个标志性特征是新陈代谢的破坏，最近一篇研究发现ALS疾病与肌肉活动有关的代谢指标发生异常改变^[23]，因此双侧尾状核区域的Ne异常升高可能反映了ALS诱导的代谢紊乱对基底节的不利影响。ALS先前的纤维束成像研究结果发现，ALS白质结构完整性与执行功能的表现有着广泛的联系^[24]，这种功能性过度兴奋可能是内在病理生理过程的结果，或是对肌肉组织减弱的代偿反应^[25]。

       Bc是网络中通过给定节点的所有最短路径的分数^[6]，节点Bc值减少意味着网络中节点的重要性降低。与正常对照组相比，ALS患者右侧中央前回、左侧楔叶和左侧中央后回Bc明显降低。皮质运动系统是一个分布式的区域网络，涉及特定运动执行的不同方面。即使是简单的运动也与初级运动皮质和次级运动皮质的多个皮质区域的激活有关^[26]，包括辅助运动皮质、运动前皮质、中央旁小叶和上顶叶运动区域，这些区域高度相互连接，汇聚在初级运动皮质上^[27]。中央前回和中央后回作为初级运动皮质的重要组成部分，在ALS的多项神经影像学研究已发现其皮质厚度和灰质体积减小^[28]，本研究中ALS患者中央前回和中央后回Bc显著降低，进一步表明ALS患者运动脑区受到损伤，在网络中的重要性降低。另外，ALS患者在非运动系统包括左侧眶部额上回和左侧岛盖部额下回Bc增加，这种额外运动脑区的Bc增加，可能是ALS患者额外运动脑区节点的一种代偿作用，在大脑任务处理网络中充当了更重要的节点，发挥了远程的执行功能作用，以促进信息整合和全局认知处理。运动系统Bc降低和非运动系统Bc增加改变可能是ALS患者结构网络局部拓扑属性的一个重要特征。

       结构网络拓扑参数与临床参数之间的相关分析发现，ALS组左侧岛盖部额下回的Bc与ALSFRS-R量表间存在负相关关系，左侧岛盖部额下回Bc值越高，ALSFRS-R评分越差。岛盖部额下回区域与大脑语言句法的解构和分析任务有关^[29]，亦有研究证明其在运动抑制过程中发挥作用^[30]，该节点的Bc值越高，可能其参与运动抑制反应能力越强，从而导致ALS疾病的运动功能越差。因此，本研究发现左侧岛盖部额下回Bc增加和与ALSFRS-R量表显著负相关，可将左侧左侧岛盖部额下回Bc值作为一种影像学标记物，对于疾病的诊断及预后评估具有一定的参考意义。此外ALS组左侧丘脑的Ne值与MoCA间存在正相关关系，即左侧丘脑Ne值越低，认知功能越差。白质网络Ne增加与认知缺陷存在正相关关系，这与其他以白质损伤为特征的退行性疾病的认知缺陷相似，例如多发性硬化和脑小血管疾病^[14]。之前一篇研究发现，额叶和颞叶区域功能连接性的增加与执行功能障碍和行为损伤有关^[31]。

3.3 不足与展望

       本研究亦存在一些局限性：首先，ALS组的样本量较小，需要在未来的研究中扩大。其次，在本研究是基于回顾性数据，由于ALS进展是动态的，前瞻性研究设计更适合于预测分析。最后，本研究为横断面研究，与ALS相关的白质结构网络是如何动态演变的，以及白质结构网络在疾病进展中是如何演变的，有待于进一步纵向研究。

       综上所述，大脑复杂网络分析为我们提供了一种新的、非侵入性的方法来追踪ALS患者高度复杂的大脑结构的紊乱进程，与HCs相比，ALS患者表现出结构网络拓扑属性改变，主要位于中央前回、额叶、颞叶、顶叶和基底节的部分。此外，这些网络异常与ALS患者的运动功能和认知功能表现相关。这表明这些区域的网络参数可能作为ALS相关检测的潜在生物标志物。