乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和致死率居所有癌症首位^[1]。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）根据全球癌症发病率和死亡率估计2020年大约有230万乳腺癌新增病例^[2]。随着精准医疗的发展，肿瘤生物学标志物在临床工作中呈现愈发重要的价值，其中肿瘤细胞增殖指数（Ki-67）是与细胞增殖相关的核抗原^[3]，是乳腺癌重要的预后因素，已被用于选择个体化治疗^[4]。Ki-67表达水平越高，肿瘤侵袭性越强^[5]，复发风险越高，预后越差^[6]。

       目前，术前Ki-67表达水平的主要方法是免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）法，该方法通过活检样本或术后病理标本进行，二者均属有创操作，存在合并并发症的风险。乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，活检样本取材会存在抽样误差，影响结果的准确性^[7]；术后标本可较准确评估Ki-67表达水平，但具有滞后性，无法在术前指导临床治疗决策，并且有研究表明Ki-67表达水平在治疗过程中是动态变化的^[8]，仅凭一次检测无法动态评估Ki-67表达水平^[9]。既往的研究^{[10, 11]}发现高Ki-67表达的乳腺癌患者具有更多的病理完全缓解（pathological complete response, pCR）能力，新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）之前的高Ki-67水平是乳腺癌患者NAC后pCR的预测因素；基于Ki-67的术前内分泌预后指数（preoperative endocrine prognostic index, PEPI）也被证明是复发风险的重要预测因子；通过测量接受短期内分泌治疗患者的Ki-67指标可以提高患者无复发生存率的预测性能，因此临床亟须一种全面、及时、无创地检测Ki-67表达状态的方法。

       影像组学被定义为高通量、自动地从医学影像中提取大批量影像特征^[12]，其可以从图像中挖掘人眼无法识别的信息，有助于疾病定性、肿瘤分期、疗效评估等^{[13, 14]}。影像组学的出现给肿瘤学带来了新的机遇^[15]，Cui等^[16]研究乳腺癌超声影像组学特征与Ki-67及P53阳性表达的关系，模型的曲线下面积（area under the curve, AUC）值分别为0.78和0.71，但超声图像影像组学特征的采集容易受操作者经验的影响；Zhang等^[17]通过研究浸润性导管癌患者MRI的表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）图影像组学特征预测乳腺癌术前Ki-67的表达状态，训练组和验证组的AUC分别为0.72和0.70，但是不同医院对扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）序列设定的b值没有统一标准，并且ADC图的分辨率较差容易造成勾画靶区存在误差，研究结果泛化能力较差；Liu等^[18]对T2WI、DWI和对比增强T1WI序列中提取影像组学特征进行深度学习，基于单个的三个MRI序列及其组合[即多参数MRI（multi-parameter MRI, mp-MRI）]构建了四个模型，结果表明mp-MRI分类模型对Ki-67的预测能力明显优于单个序列模型（P均＜0.01），但是该研究仅提取了病灶区域单层图像的影像组学特征，没有提取病灶的三维影像组学特征，结果可能存在偏倚。

       Hu等^[19]研究基线CT图像的瘤周影像组学特征是否能提供新辅助放化疗反应的有价值信息，并提高瘤内影像组学评估pCR的能力，模型瘤内+瘤周（AUC=0.852）的评估能力明显优于单纯模型瘤内（AUC=0.734），瘤周的影像特征发挥了巨大的优势。在乳腺癌Ki-67的相关研究中，国内少有研究探讨瘤内联合瘤周影像组学特征预测其表达状态的价值。因此，本研究基于动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI）图像创新性采用了瘤内联合瘤周三维影像组学特征的方法构建术前预测乳腺癌Ki-67表达状态的预测模型，三维图像将包含更完整的信息，DCE-MRI第2期图像病灶强化程度较高，与邻近腺体对比度亦较高，可以提高靶区勾画的准确性，该研究将为乳腺癌患者个体化治疗方案提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并经新疆医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准（批准文号：K-2021028），免除受试者知情同意。回顾性分析新疆医科大学附属肿瘤医院自2019年1月至2022年1月收治的乳腺癌患者病例。纳入标准：（1）经穿刺活检或术后病理证实为乳腺癌，且有Ki-67检测结果；（2）于活检或手术前1周内接受乳腺MRI检查，图像质量良好；（3）无其他部位原发肿瘤。排除标准：（1）图像质量不佳；（2）既往接受过乳腺穿刺、手术、放疗、化疗或激素治疗的患者；（3）非肿块型乳腺癌。纳入病例312例，均为女性，年龄（49.0±9.7）岁，其中Ki-67高表达46例，低表达266例。乳腺浸润性导管癌291例，小叶癌6例，乳头状癌15例。将病例按8∶2的比例随机分为训练组（ｎ=250）和验证组（ｎ=62）。本研究流程见图1。

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图1  预测乳腺癌Ki-67表达状态影像组学流程图。
Fig. 1  Predicting the expression status of Ki-67 in breast cancer imaging flowchart.

1.2 扫描方法

       检查设备采用Siemens Verio Tim 3.0 T超导MRI扫描仪及8通道乳腺相控阵线圈。患者行俯卧位，双侧乳腺自然下垂放置于线圈内并严格制动。扫描范围：双侧乳腺，同水平胸廓前部即腋窝。患者均行乳腺MRI平扫及多期动态增强扫描。DCE-MRI采用轴位三维液体衰减反转恢复序列，增强扫描前先扫蒙片，层厚1.2 mm，层间隔0.2 mm，翻转角10°，视野340 mm×340 mm，矩阵448×336。于手背静脉用高压注射器注射Gd-DTPA（马根维显，拜耳制药，德国）对比剂，剂量为0.2 mL/kg，速度2.5 mL/s，注射对比剂后以同样速率团注20 mL生理盐水。注药后即开始扫描，连续扫描7期，每期1 min。

1.3 影像组学分析

1.3.1 图像ROI勾画

       将入组乳腺DCE-MRI图像从PACS系统以DICOM格式导出，将DCE-MRI第2期图像导入3D Slicer软件（4.11版本）。由两名有乳腺MRI诊断经验的高年资医师（医师1为15年工作经验的副主任医师，医师2为12年工作经验的副主任医师）各自分别在DCE-MRI第2期图像勾画ROI，两位医师都知道乳腺癌的诊断，但对临床及病理细节均不了解。沿肿瘤边缘逐层手动勾画瘤内区域，瘤周区域（肿瘤外扩5 mm）由软件计算后自动勾画^[20]，构建全肿瘤感兴趣体积（volume of interest, VOI）。避开肿瘤坏死部分，若乳腺皮肤或胸壁距瘤周最远距离小于扩张距离，则将乳腺皮肤表面或胸壁到瘤周最远距离确定为瘤周区域。多中心及多灶性病例选择最大病灶勾画。

1.3.2 影像组学特征提取及标准化

       采用pyramidimocs软件提取瘤内及瘤周三维影像组学特征；在特征分析之前，用Z-score标准化法进行对数据进行标准化处理，解决不同性质数据的问题并提高数据的可比性，加快梯度下降求最优解的速度，提高模型的精度。

1.3.3 影像组学特征筛选

       应用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）评价2位医师勾画、提取影像组学特征参数的一致性，大于0.75认为一致性良好并进行下一步分析；使用Spearman相关系数计算特征之间的相关性，对于相关系数大于0.9的特征，两者保留其一；利用最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）算法对数据进行十折交叉验证，筛选出最优影像组学特征。

1.3.4 构建模型

       通过Python 3.7.13和机器学习库Scikit-learn 23.0建立影像组学模型，利用支持向量机（support vector machine, SVM）机器学习算法对筛选后的影像组学特征建立瘤内、瘤周、瘤内+瘤周模型用于预测乳腺癌Ki-67的表达状态，用验证组进行验证。

1.4 Ki-67检测

       采用IHC方法进行Ki-67检测，由２名具有10年以上病理诊断经验的副主任医师以恶性细胞阳性染色百分比记录Ki-67表达评分，Ki-67≥14%为高表达，Ki-67＜14%为低表达^[21]，意见不一致时，经讨论决定。

1.5 统计学分析

       使用Python 3.7.13软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以（x¯±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（上下四分位数）表示，两组间比较采用两独立Mann-Whitney U秩和检验；计数资料以n（%）来表示，两组间比较采用卡方检验；所有P值均为双侧检验结果，以P＜0.05为差异有统计学意义。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线，计算AUC、敏感度、特异度、准确度并评价各模型预测乳腺癌Ki-67表达的效能，利用Delong检验评价各模型AUC差异是否具有统计学意义；绘制校准曲线，采用Hosmer-Lemeshow检验评估模型的拟合优度；进行决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）评估模型的临床效用。

2 结果

2.1 一般临床资料分析

       Ki-67低表达组和高表达组的绝经状态、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。保证了后续数据分析的一致性。

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表1  患者临床信息
Tab. 1  Patient clinical information

2.2 提取和筛选影像组学特征

       从每位患者的瘤内、瘤周VOI中各提取1906个影像组学特征，瘤内+瘤周经过早期特征融合提取3812个影像组学特征。首先，分别剔除322、413、762个ICC值＜0.75的特征；其次，使用Spearman相关系数，分别剔除624、732、1604个r＜0.9的特征；最后，使用十折交叉验证的LASSO逻辑回归对剩下的960、761、1446个特征进行分析，保留特征系数大于0的特征（图2A～2F）。分别于瘤内、瘤周、瘤内+瘤周筛选出8、19、16个与Ki-67表达状态相关的影像组学特征，包含密度、纹理、形状及滤波特征。

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图2  使用参数化方法、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）逻辑回归进行瘤内(2A～2B)、瘤周(2C～2D)、瘤内合并瘤周(2E～2F)放射组学特征选择。
Fig. 2  Radioomics feature selection of intratumoral (2A-2B), peritumoral (2C-2D) and intratumoral with peritumoral (2E-2F) by using parametric methods, minimum absolute contraction, and selection operator (LASSO) logistic regression.

2.3 构建模型及效能评价

       对瘤内组、瘤周组、瘤内+瘤周组筛选得到的特征分别基于SVM算法建立预测模型，采用混淆矩阵及其衍生的诊断符合率、敏感度和特异度（表2）来评价训练组（图3A）和验证组（图3B）的诊断效能，AUC曲线分析表明模型瘤内+瘤周（训练组=0.949、验证组=0.862）优于单一模型瘤内（训练组=0.901、验证组=0.689），模型瘤周训练组AUC为0.999提示该组数据存在过拟合，而验证组AUC仅0.694，说明该模型的泛化能力欠佳，经综合分析模型瘤内+瘤周的预测效能较优。Delong检验显示，验证组模型瘤内+瘤周的AUC高于模型瘤内（P=0.007）及模型瘤周（P=0.01），模型瘤内与模型瘤周的AUC差异无统计学意义（P=0.97）。验证组的校准曲线（图4）显示其校准曲线更贴近于45%的最佳值，Hosmer-Lemeshow检验该校准曲线验证组的P值为0.082，说明校准曲线的拟合度良好；验证组决策曲线（图5）（获益区间0.2%～0.9%）优于其他模型，具有更好的临床获益度。证明同时使用瘤内+瘤周影像组学特征对Ki-67进行预测效果更好。

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图3  三种模型受试者工作特征（ROC）曲线。3A为训练组；3B为验证组。
图4  三种模型的校准曲线（验证组）。
图5  三种模型的决策曲线（验证组）。AUC为曲线下面积；CI为置信区间。
Fig. 3  Comparison of receiver operating characteristic (ROC) curves in three models. 3A is training group; 3B is validation group.
Fig. 4  Calibration curves for three models (validation group).
Fig. 5  Decision curves of three models (validation group).

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表2  三种模型ROC曲线分析结果
Tab.2  Results of ROC analysis in three models

3 讨论

       Ki-67的表达状态在乳腺癌分子分型、乳腺癌治疗决策的制订、治疗疗效评估及预后预测中均起着重要的作用。本研究开发并验证了一种利用SVM机器学习算法构建的基于DCE-MRI瘤内联合瘤周影像组学特征的模型，用于术前无创预测乳腺癌患者Ki-67的表达状态。研究结果初步表明模型瘤内+瘤周在训练组和验证组中均表现良好，AUC值分别为0.949、0.862，该模型预测效能高于既往单独以瘤内或瘤周影像组学特征构建的模型，有益于辅助临床制订个体化诊疗决策。

3.1 影像组学模型预测乳腺癌Ki-67的表达状态的价值

       影像组学能够把数字医学图像转化为高维、可利用、定量提取的影像特征来表征肿瘤内部异质性，并通过定量提取特征综合分析病灶，为临床决策提供无创性生物标志物，可挖掘人眼无法识别的高维信息^[22]。此前已有基于数字乳腺断层摄影（digital breast tomosynthesis, DBT）的研究展示了影像组学在预测乳腺癌Ki-67表达状态方面的巨大潜能，Tagliafico等^[23]基于DBT的图像进行特征提取，构建的模型预测性能较好，训练组AUC为0.698。Jiang等^[24]通过研究发现在预测乳腺癌Ki-67表达状态方面，MRI比DBT有更优的诊断效能，可能由于MRI较DBT有更优的分辨率及对比度。Liang等^[25]通过对MRI的T2WI序列提取影像组学特征构建的用于预测乳腺癌Ki-67表达状态的模型表现出了较优的诊断效能，训练组和验证组的AUC分别为0.762和0.740。Ma等^[26]研究基于DCE-MRI提取影像组学特征，构建模型的诊断效能优于平扫各序列。有研究认为DCE-MRI影像组学特征可以作为Ki-67在乳腺癌中表达的预测因子^[27]，可能由于DCE-MRI较平扫序列包含更多不可视化信息，能提供反映肿瘤DCE参数特征的功能信息^[28]。

       因此本研究采用DCE-MRI图像提取影像组学特征，预测效能最优的模型瘤内+瘤周由10个瘤内特征及6个瘤周影像组学特征通过SVM机器学习算法构建，SVM机器学习算法是一个二分类算法，可以利用内积核函数实现高维空间的非线性映射，具有较好的鲁棒性。本研究最终筛选影像组学特征名及相关权重系数见图6，其中瘤内特征权重系数最大的是形状特征。刘晓东等^[29]的研究结果表明，肿瘤内DWI及ADC图像描述三维空间肿瘤形状和大小的形态学特征与Ki-67状态显著相关，反映了肿瘤形态差异和图像的不均匀性，与本研究结果一致，虽然本研究与刘晓东等研究的序列不同，但形状特征在瘤内不同序列的图像特征都与Ki-67显著相关，更加说明形状特征能在一定程度上能反映肿瘤的恶性程度及异质性。瘤周特征中权重系数最大的是一阶特征的偏度，偏度描述像素分布的不对称特性，Juan等^[30]的一项研究结果表明，肿瘤周围区域DCE-MRI图像的偏度与Ki-67状态显著相关，与本研究结果一致。本研究16个特征中有10个特征属于纹理特征，既往有研究^[31]表明图像的纹理特征分析可以提供关于肿瘤潜在生物学异质性的信息，据Ko等^[32]的研究指出基于MRI纹理分析获得的乳腺癌灶异质性与从组织病理学中观察到的异质性之间存在相关性。本研究构建的影像组学模型在训练组（AUC=0.949）和验证组（AUC=0.862）中均表现了优秀的诊断效能。由此可见基于MRI影像组学特征构建的模型具备术前预测乳腺癌患者Ki-67表达状态的潜能，有望成为有效的辅助检测方法。

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图6  基于动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）瘤内联合瘤周筛选特征及其权重。
Fig. 6  Screening characteristics and weight of intratumoral combined periatumoral tumor based on dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI).

3.2 瘤内+瘤周影像组学模型预测Ki-67的表达状态的价值

       乳腺癌的异质性包括肿瘤内异质性和肿瘤周围微环境的异质性。肿瘤周围微环境的一些特征可能是癌症进展、转移发生和治疗耐药启动的驱动力^[33]。有研究表明^[34]，随着肿瘤的浸润或转移，原发肿瘤周围的正常组织也会受到影响。通过提取瘤周组织的影像组学特征，有可能捕捉到肿瘤微环境的异质性及复杂性，从而更好地评估其生物学行为，进行早期干预。Beig等^[35]提取肺结节及周围组织的影像组学特征以区分肺息肉和非小细胞肺癌，以结节外30 mm瘤周区域分别提取6个5 mm的环，分别提取每个小环的影像组学特征并综合结节内特征构建影像组学模型，结节外影像组学模型AUC值为0.74，联合模型的评估性能提高至0.80。Braman等^[36]评估瘤周及肿瘤内部的DCE-MRI影像组学特征预测乳腺癌NAC后能否获得pCR，结果显示综合肿瘤外2.5 mm至5.0 mm的瘤周及瘤内影像组学特征可以较好地预测乳腺癌患者获得pCR的能力，为乳腺癌治疗方式的选择提供理论依据。以上研究结果均表明瘤内联合瘤周影像组学模型比单一瘤内或瘤周影像组学模型对疾病的鉴别诊断、治疗效果的评估具有更高的价值。本研究参照Braman等研究定义的肿瘤周围范围，提取乳腺癌DCE-MRI图像瘤内及瘤周5.0 mm的三维影像组学特征，结果表明无论在训练组还是验证组，模型瘤内+瘤周较模型瘤内、模型瘤周具有更高的AUC值，说明瘤周特征的加入确实能有效提高模型的诊断效能，Delong检验提示模型瘤内+瘤周与模型瘤内、模型瘤周AUC值的差异有统计学意义，但模型瘤内、模型瘤周AUC值的差异无统计学意义，可能是由于样本量较少并且是单中心的研究导致结果存在一定的偏倚性。决策曲线显示模型瘤内+瘤周较模型瘤内、模型瘤周有更大的净收益，可以得出结论，模型瘤内+瘤周具有更高的临床应用价值。

3.3 局限性

       本研究仍有一些不足之处：（1）首先本研究为单中心研究，样本量有限，可能会导致结果的偏倚，下一步将努力拓展多中心、大数据进行验证并改进预测模型的预测效能；（2）本研究仅基于DCE-MRI第2期图像进行分析，将来希望进一步融合多期动态增强扫描的图像及多个序列的图像进行研究，以期挖掘更多的影像组学数据从而进一步提高模型的预测能力；（3）本研究采用病变外扩5 mm得到瘤周范围，是否为最优瘤周范围，还需对瘤周扩大范围进行精细划分并加以验证。

       综上所述，本研究基于DCE-MRI图像创新性采用瘤内和瘤周影像组学特征结合的方法构建乳腺癌Ki-67表达状态的预测模型，该研究为乳腺癌患者个体化治疗方案提供参考依据，为术前、治疗后无创预测乳腺癌Ki-67表达状态提供评估方法。