在全球范围内，脑卒中是导致病患残疾或死亡的第二大疾病，且在我国的发病率也逐年上升。脑卒中包括出血性和缺血性两种形式，其中以缺血性脑卒中为主，占所有脑卒中病例的71%^[1]。卒中治疗时间窗短，例如静脉注射溶栓应在3 h以内进行，病灶的及时诊断及尽早治疗干预对患者的康复至关重要^[2]，因此，精准且快速地定位缺血病灶具有重要的临床意义。前期的研究结果表明，化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer magnetic resonance imaging, CEST）MRI具有靶向性、高对比度以及无创诊断的特性^{[3, 4]}，能够在体检测多种常见体内代谢物^{[5, 6]}，进而诊断具有代谢物紊乱特征的疾病^{[7, 8, 9]}。酰胺质子转移（amide proton transfer, APT）成像^[10]是CEST MRI最常见的一种形态，尤其适用于卒中诊断，因为APT成像的基础是代谢物分子和水分子之间的氢质子交换^[11]产生的信号增强^[12]，而氢质子的交换速率（exchange rate, kex）对环境pH值非常敏感，因此缺血后病灶中葡萄糖代谢异常产生的酸性物质会导致APT信号的显著变化^[10]，从而产生病灶和正常组织的显著对比。但在临床应用中，APT过程通常伴随着一些其他效应的产生，例如直接水饱和（direct saturation, DS）、核奥氏效应（nuclear Overhauser effect, NOE）和半固相大分子转移（magnetization transfer, MT）以及来自其他可交换质子（如胺基）的CEST效应等^{[13, 14, 15, 16, 17, 18]}，这些效应对分析过程造成了显著的干扰，因此本研究拟开发一种更加精确的量化方法。

       本文针对卒中前期APT图像病灶区域对比度低、检测难度较大的问题，使用不同功率的B1射频脉冲采集多组APT影像，然后建立APT信号、饱和脉冲振幅和酰胺质子kex之间的关系^[19]。通过这种方法对缺血性脑卒中大鼠的APT影像进行逐像素定量，生成的kex成像避免了其他竞争效应的干扰，提供了一种更加直观的卒中病灶对比机制。与其他MRI模态和原始APT影像进行的对比实验充分验证了该方法的对比增强能力以及鲁棒性。

1 材料与方法

1.1 动物实验

       动物实验部分在潍坊医学院医学影像学院进行。实验对象为健康的9～10周Sprague-Dawley大鼠（雄性，体质量240 g），通过腔内缝合使其进行大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）^[20]。在MCAO后2 h，取出尼龙线进行再灌注，以此来完成脑卒中的造模。在手术过程中，动物的核心温度保持在（37±0.5）°C，并实时监测呼吸频率。在扫描过程中，使用异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）对大鼠进行固定和麻醉，用药量大致为10 mL/h。本研究经潍坊医学院伦理委员会批准（批准文号：2019SDL092）。

1.2 MRI数据采集

       MRI数据的扫描过程在7 T动物MR扫描仪（Bruker Biospec，德国）上使用发射-接收器体积线圈（直径=40 mm）进行，在冠状位分别采集了T2WI、弥散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）和CEST影像。T2WI扫描序列为弛豫增强的快速采集序列（rapid acquisition with relaxation enhancement, RARE），参数为：RARE因子=32，重复时间5000 ms,回波时间4 ms,层厚1 mm，FOV 34 mm×28 mm,矩阵256×192，扫描时间2.56 min；DWI使用脉冲梯度自旋回波（pulsed gradient spin echo, PGSE）序列，参数为：重复时间2500 ms,回波时间0.27 ms,层厚1 mm，FOV 34 mm×28 mm,矩阵80×80，b值=2000 s/mm²，扫描时间2.42 min；CEST先进行水饱和位移参考（water saturation shift referencing, WASSR）扫描用于主磁场不均匀校正，使用弱饱和高斯脉冲（B1=0.5 μT；脉冲时间=500 ms），扫描频率从-1～1 ppm（间隔为0.1 ppm）；CEST扫描使用连续波（continuous wave, CW）预饱和脉冲(脉冲时间=2500 ms），扫描频率从-10～10 ppm（间隔不等，共50个频率），参数为：B1=0.7、1、2 μT，重复时间5000 ms,回波时间3.7 ms,层厚1 mm，FOV 34 mm×28 mm,矩阵64×64，扫描时间共11.5 min。本研究基于上述的扫描参数设置，按照缺血后早、中、晚期的病程发展阶段分别在拔线后2、6、24 h三个时间点进行了扫描。

1.3 行为学评分

       对造模情况的评价基于Longa法^[20]，具体为对模型大鼠行为学进行评分：0分，正常行走，无神经功能受损表现；1分，悬吊尾部左前肢挛缩，无法正常伸直；2分，无法直行并向左侧转小圈；3分，向左侧倾倒或转大圈；4分，无法行走或死亡。评分介于1至3分者，作为成功的造模进行研究。

1.4 病理学检查

       在本研究中通过切片染色的方法来评估病理学改变。在使用水合氯醛麻醉大鼠后，取脑组织进行切片封存于石蜡，石蜡切片脱蜡至水后，分别进行了两种染色：（1）苏木精-伊红染色。具体步骤为苏木精染核、分化液分化、双蒸水冲洗、伊红染液染浆、无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。（2）尼氏染色。步骤为滴加甲苯胺蓝、烤箱孵育、双蒸水冲洗、乙醇浸泡。观察细胞核呈淡蓝色后使用无水乙醇脱水，然后二甲苯透明、中性树胶封片。

1.5 CEST质子kex定量方法

       CEST的成像机制较为复杂，依赖于多个参数。不仅包括外部的实验设置，如主磁场强度B0，饱和脉冲强度B1，也与内部生理条件，如代谢物浓度、代谢物kex、体内自由水和代谢物的弛豫时间等紧密相关。如图1所示，在不同B1功率和不同kex下的多组Z谱（在各个频率偏移上的CEST信号）仿真结果给出了CEST信号受这些参数影响的一个典型范例。而本文从这些不同的Z谱组合中来进行对应交换参数的定量。

       该机制的具体描述通常使用包含可交换质子池的布洛赫-麦康奈尔方程（Bloch-McConnell equation），根据Woessner等^[21]对该方程的推导，单个可交换池（池指代自由水或某种可交换质子）经过饱和后达到稳态时的磁化强度Mz可以根据下式（1）得到：

       其中M0是未经过饱和脉冲的磁化强度，ω1为射频脉冲的拉莫尔频率，ω1=γB1，其中常数γ为旋磁比，对于氢质子其值为267.5。R1和R2分别是自旋池的纵向和横向弛豫速率。

       在该式的基础上，Dixon等人补充了在有交换池存在情况下Mz的表达式（2）^[19]：

       并证明在交换速率k远大于弛豫速率（k≫R1&R2）的情况下，上式中的R1和R2可以忽略不计，此时对Mz使用M0进行归一化，记作m，可以用如公式（3）的形式进行简化描述：

       由池b的交换效应导致的自由水信号降低占总体信号降低的比率记作RCEST，表达式如公式（4）：

       此处mb为池b的归一化磁化强度，kb为池b到自由水池的交换速率。

       定义自由水池为a，在稳态下，基于单个交换效应的水信号降低量等于以自由水的纵向弛豫速率R1a进行的信号恢复量，表示为公式（5）：

       其中ma便是可以直接观察到的水信号（归一化Z谱信号），fb是池b中的可交换质子浓度，然后将ma替换回Mz/M0的表达，然后经过简单的变换，可以得到公式（6）：

       此时，将1ω12视作自变量，Mz/(M0-Mz)是关于1ω12的因变量，这二者都是可以直接观测到的参数。如此便可以建立起不同B1功率下CEST信号之间的线性关系，其斜率为(kb/fb)R1a。

       通过绘制回归直线，可以更加直观地观察到在x轴上的截距xintercept为-1/kb2。显而易见，如此便方便地得到了交换速率如式（7），避免了对溶质浓度的计算。

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图1  不同饱和参数设置下的Z谱仿真。1A：不同的B1饱和脉冲强度；1B：不同的交换速率。
Fig. 1  Z-spectrum simulations under different saturation parameters. 1A: Different B1 saturation pulse intensities. 1B: Different exchange rates.

1.6 数据处理流程

       所有的数据处理流程在Matlab 2016版（MathWork有限公司，美国）平台进行。本研究首先使用水饱和偏移参照（WASSR）方法对所有CEST数据进行B0场不均匀性校正，随后对于每个像素，分别用三种B1功率下采集得到的Z谱取3.5 ppm处,即APT的信号值Mz，与其对应的未饱和信号M0求得Mz/(M0-Mz)。以这三组Mz/(M0-Mz)值作为纵坐标，其对应的三组1/(ω1)2[对于0.7，1，2 μT分别为2.852×10-5，1.3975×10-5，0.34938×10-5(rad/s)-2]作为横坐标，对这三个坐标点进行线性回归，通过回归直线与x轴的截距求出对应的kex。

       对于kex量化结果，分别通过以下两种指标来进行评估：（1）通过t检验计算P值来评估基于kex成像中区分开的两种组织之间是否有显著性差异；（2）通过计算对比度噪声比（contrast-to-noise ratio, CNR）来评价原始CEST影像和使用上述方法计算出的kex成像对病灶区域的检测质量，CNR的表达式见公式（8），

       IS和CO分别代表缺血脑半球和对侧正常半球，S为感兴趣区域（region of interest, ROI）内信号均值，σ为ROI内信号标准差。

1.7 统计学分析

       采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software有限公司，美国）进行统计学分析。计量资料以x¯±s表示，分别对每个时间点的所有大鼠按照缺血和对侧的半球统计各自所有像素APT的信号，并采用t检验进行组间比较，P＜0.05视为差异有统计学意义。采用Bland-Altman图观测不同时间点之间kex定量值的一致性，组间差值多数落在95%一致性界限内则视为这两种方法一致性较高。

2 结果

       由表1可见，各个时间点的缺血侧和对侧APT值经配对t检验，P值均小于0.05，差异具有统计学意义。

       图2给出了一组典型的kex量化范例，在图2A～2C中展示了一组2 h大鼠1号在3种不同脉冲强度B1（0.7、1、2 μT）下的APT影像，可以看出原始图像中缺血脑侧和正常侧并没有呈现出很明显的对比，尤其是在0.7 μT的情形下。借助DWI图像呈现出的弥散损伤，在缺血核心以及对侧镜像区域中分别选取了ROI，提取其中像素的CEST信号计算出一对回归直线，并展示在图2D中。虽然来自两种组织的回归直线在小B1强度的情形下重合度高，无法区分两种组织，但通过x轴截距反映出的kex可以看到二者之间的对比较为明显。

       图3展示了一组kex缺血再灌注2 h后的大鼠2号中，通过逐像素定量生成的质子kex成像与其他传统MR模态成像的对比。T2WI（图3A）和DWI（图3B）都没有展示出病灶区域和正常组织之间可明显观察到的对比，而在kex成像（图3C）中，病灶区域显示出明显的低值。根据kex成像展现出的对比，病灶区域可以被分割出来用以量化分析。病灶区域和正常组织中的kex值经过统计，分别使用带有误差棒的柱状图展示在图3D中。通过t检验法得出，两个组别之间的P值小于0.01，说明它们之间差异具有统计学意义。

       在图4中展示了kex成像在再灌注后不同时间点的多组数据上的表现，并与其对应的原始APT影像(以1 μT为例)作为对比。其中对于kex成像，病灶区域由于低pH值的抑制，表现为低kex值；而病灶区域的CEST信号值相对正常组织表现为高值。从图4中可见，kex成像（图4A）中呈现出的病灶区域与其余正常组织间有清晰的轮廓，相比之下APT影像（图4B）中对侧正常组织则出现了一些伪影，对比效果较差。除此之外，可以观察到：从2～24 h的病程中，kex图像呈现出的缺血病灶范围逐渐扩大，并且随着时间推移病灶内的kex值也逐渐降低。相应的CNR值对比结果展示在表2中。通过数值量化指标可见，相对原始的APT影像，kex成像在所有时间点的样本上都具有更高的CNR值，表现出更好的病灶对比性能。

       本研究使用光学显微镜观察了染色情况，其中2 h大鼠1号作为代表性结果展示于图5。5C、5E显示对侧正常组织所有细胞排列紧密，形态正常。而代表病灶的5B、5D中细胞则呈现不规则排列，细胞数量也较少。

       Bland-Altman一致性分析结果展示在图6中，可以看出每两组的对比中差值几乎都落在95%一致性界限内，并且差值的均值都接近于0，说明不同时间点的定量结果之间具有较好的一致性。

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图2  kex定量的一组示例。2A：饱和脉冲强度为0.7 μT下的APT影像以及选取的ROI；2B：饱和脉冲强度为1 μT下的APT影像以及选取的ROI；2C：饱和脉冲强度为2 μT下的APT影像以及选取的ROI；2D：从两处ROI中获得回归直线并利用截距计算kex。kex：质子交换速率；ROI：感兴趣区；APT：酰胺质子转移。
Fig. 2  An example of exchange rate (kex) quantification. 2A: Amide proton transfer (APT) image under saturation pulse intensity of 0.7 μT and the selected region of interests (ROIs). 2B: APT image under saturation pulse intensity of 1 μT and the selected ROIs. 2C: APT image under saturation pulse intensity of 2 μT and the selected ROIs. 2D: Regression lines obtained from two ROIs and the intercepts were used to calculate exchange rates.

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图3  卒中大鼠的质子交换速率(kex)成像和传统MRI的对比。3A：T2加权成像；3B：弥散加权成像；3C：kex成像；3D：病灶区域和正常组织之间kex的差异。
Fig. 3  Comparison of exchange rate (kex)  imaging and conventional MRIs in stroke rats. 3A: T2-weighted imaging. 3B: Diffusion-weighted imaging. 3C: kex imaging. 3D: Difference in kex between lesion region and normal tissue.

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图4  在不同再灌注后时间点上质子交换速率（kex)影像和酰胺质子转移（APT）影像的对比。4A：kex成像结果；4B：原始APT影像（1 μT）。
Fig. 4  Comparisons between kex images and amide proton transfer (APT) images at different time points after reperfusion. 4A: kex imaging results. 4B: Original APT images.

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图5  灌注后2 h大鼠的切片染色示例。5A：T2WI图像及选取的感兴趣区域（ROI）；图5B、5C分别代表2个ROI的苏木精-伊红结果，5D、5E分别代表2个ROI的尼氏染色结果。
Fig. 5  The section staining of 2 hours after perfusion rat. 5A: T2WI image and the selected region of interest (ROI); 5B-5C: Hematoxylin-eosin staining within the ROI; 5D-5E: Nissl staining results within the ROI.

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图6  Bland-Altman一致性分析结果。6A：2 h组和6 h组间的一致性评价；6B：6 h组和24 h组间的一致性评价；6C：2 h组和24 h组间的一致性评价。
Fig. 6  Bland-Altman consistency analysis results. 6A: The consistency evaluation between the 2 hours group and the 6 hours group; 6B: The consistency evaluation between the 6 hours group and the 24 hours group; 6C: The consistency evaluation between the 2 hours group and the 24 hours group;

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表1  各时间点缺血侧及对侧APT值
Tab. 1  APT value of ischemic side and contralateral side at each time point

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表2  kex图像和原始APT图像的CNR值对比
Tab. 2  Comparison of CNR values between kex images and original APT images

3 讨论

       本研究基于CEST成像原理的解析表达式，经过推导获得B1脉冲强度、kex和CEST信号之间的线性关系，并根据建立的回归方程在坐标轴上的截距求得kex。本研究采用该方法对缺血性脑卒中后大鼠进行量化分析，来评估kex成像在病灶检测中的应用价值。实验结果表明，卒中侧病灶区域的kex呈现明显的低值，且轮廓较为明显。相比传统MRI模态和原始的CEST影像，kex成像具有更好的病灶组织对比度，并且在不同的再灌注后时间点上表现出较好的定量一致性。

3.1 kex量化方法的应用优势

       CEST MRI具有对多种体内代谢物质进行特异性检测的能力，能够为广泛使用的弛豫加权成像、弥散峰度成像（diffusional kurtosis imaging, DKI）或DWI等MRI模态在代谢紊乱疾病方面提供检测能力的补充^{[22, 23]}，在诸如脑卒中的代谢异常疾病中具有可观的应用前景。然而成像过程伴生的干扰效应带来的伪影在一定程度上削弱了成像质量及对比度，限制了CEST的临床应用^[24]。因此目前CEST研究领域的一大目标即为寻求更加准确的定量分析方法^[25]。APT成像的信号强度主要取决于组织内酰胺质子与自由水质子的kex，其与pH的关系最为紧密^[26]。因此对kex的定量是反映化学交换饱和转移过程最为直观的方式，避免其他因素的干扰，适合于pH值显著变化场景下的CEST定量分析^{[27, 28]}。

       以往的研究已表明，CEST信号受到多个参数的共同影响，包括场强、弛豫速率、交换物质浓度、kex等。它们之间彼此依赖，故而对单一参数的准确量化往往需要对多个参数的测量，然而活体环境下这具有相当的难度。相较于此前的kex量化方法，本研究通过消元的方式提供了一种简便的途径，避免了对于弛豫速率和浓度等参数的依赖^[29]。

       kex的定量表达式[公式（4）]作为线性方程，至少需要两个基于不同强度射频脉冲采集到的Z谱。不同可交换物质的CEST效应对B1变化的响应具有差异。例如，由于酰胺质子交换速度相对较慢，APT效应在1～2 μT左右的B1下获得最佳饱和^[30]，本研究的实验结果（图2）中，不适宜的功率（0.7 μT）造成质子不完全饱和，与kex下降带来的饱和降低相混淆也说明了这一点。又如谷氨酸具有相对较快的酰胺质子交换率，谷氨酸CEST效应在高饱和功率下表现更佳^[31]。因此kex回归直线可以辅助寻找感兴趣生物标志物的最佳饱和功率，以指导后续采集工作的序列参数设置。

       根据图3的实验结果，可以看出kex展现出的病灶信号要比T2或DWI影像中更加明显，其轮廓也更大。这表明以酸中毒作为表征的成像机理并不同于常见的以弛豫时间或水分子扩散为参照的成像机制，可能先于传统成像方式检测到病程的初期发展，体现出CEST MRI在卒中检测方面的优势^[32]。

3.2 影响kex的其他因素

       除了pH值外，组织kex还可能会受到、温度、组织代谢物类型或活性氧(reactive oxygen species, ROS)的影响^{[33, 34]}。缺血性脑卒中后，无氧代谢增加会导致组织酸中毒，从而导致缺血组织的pH值降低，鉴于质子交换是在正常生理环境中的pH值附近由碱催化进行的，则可以预见kex会因酸中毒而降低。而大脑温度通常较为稳定，Karaszewski等^[35]已经证明缺血性脑组织的温度变化幅度通常不会超出1℃。除了pH值和温度之外，质子交换率相对较快的小代谢物浓度的增加可能导致梗塞病变中整体组织kex的增加。据报道一些微量代谢物，如兴奋性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和抑制性氨基酸（GABA和牛磺酸），会在卒中的初始阶段（24 h以内）升高，接着在24 h后减少。近期的研究发现，ROS对组织kex也有着独特的影响。卒中发生时，脑缺血伴随着ROS的产生与抗氧化能力失衡，导致ROS产生大量直接或间接参与脂质、蛋白质、核酸等的氧化损伤，继而造成细胞损伤和死亡。此外，急性缺血性卒中主要的诱发条件包括无氧代谢和氧化应激在内的复杂代谢变化，而急性期后的再灌注进一步刺激了ROS的产生。但ROS能否视为对kex的主要影响因素仍需要对其在缺血组织中的含量进一步进行测量。

3.3 应用前景

       不止于缺血性脑卒中，kex成像在多种疾病的诊断应用中都具有潜力。已有数项研究对其他应用场景进行了探讨，包括多发性硬化病变以及脑胶质瘤的诊断，以及脑组织灰白质的区分等^{[36, 37, 38]}。

3.4 局限性

       本研究也存在一定的局限性：（1）MRI采集过程通常存在B1不均匀性的伴生，受到该干扰效应影响的像素可能会因CEST信号偏移表现为噪点；（2）虽然酰胺是卒中后对比表现最为明显的可交换物质，本研究通过在Z谱上3.5 ppm处取值来提取酰胺信号。但由于CEST效应的交换峰通常较宽，提取的酰胺信号难以避免地混杂了其他CEST效应的信号，可能会对分析结果造成一定的影响；（3）该项技术如果应用于临床，由于其需要至少两次采集，会带来长采集时间的问题。针对这些不足之处，今后可能的改进工作包括加入更可靠的干扰校正预处理、更完备的临床试验，以及进一步探索酸中毒病变与弥散加权病变的不匹配与缺血半暗带之间的联系。

       综上所述，本研究通过对CEST MRI的量化分析实验，表明kex成像可以作为一种独特的对比增强机制，有用于缺血性脑卒中后病灶检测的潜质。相比传统的MRI成像方法，kex成像表现出更灵敏的检测能力以及更高的对比度，为未来CEST MRI在脑卒中诊断方面的临床应用提供了一种有潜力的工具。