鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，其发病率一直缓慢上升^{[1, 2]}。研究表明，肿瘤细胞的增殖方式和速度与NPC的恶性程度和预后密切相关^[3]。而Ki-67作为细胞增殖期表达的核抗原，能准确反映细胞的增殖活性^{[4, 5, 6]}。因此，准确预测Ki-67表达水平有助于评估NPC患者的预后。然而，在临床中Ki-67指数只能通过对病理组织的免疫组化染色明确，是有创的，且仅能对活检获得的局部的组织标本进行检测，无法反映肿瘤的整体情况。影像组学可以从常规医学影像图像中提取高通量的非肉眼视觉的特征参数，与肿瘤的侵袭性、疗效及预后密切相关^[7]。目前国内外大多数使用影像组学方法预测Ki-67表达的研究都集中于乳腺癌、胶质瘤等^{[8, 9, 10]}，Fang等^[11]探讨了基于MRI的影像组学预测NPC患者无进展生存期（progression free survival, PFS）的价值，但目前国内未有基于MRI影像组学预测NPC Ki-67表达水平方面的研究报道。故本研究对基于多参数MRI的影像组学结合临床影像特征在预测NPC患者Ki-67表达状态中的价值进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 一般资料

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并通过宁夏医科大学总医院伦理委员会批准，免除受试者知情同意，批准文号：KYLL-2022-0403。回顾性纳入宁夏医科大学总医院2015年12月至2022年5月经病理证实的171例NPC患者的临床及MRI资料，按7∶3比例分为训练集（n=120）和验证集（n=51）。纳入标准：（1）病理活检证实为NPC者；（2）行免疫组化Ki-67检测且有明确结果者；（3）MRI图像上鼻咽黏膜增厚＞5 mm。排除标准：（1）MRI检查前已行抗NPC治疗者；（2）图像质量不佳者。用美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）第8版标准^[12]对NPC患者重新统一进行分期。

1.2 MRI检查方法

       采用美国GE Signa HDx 1.5 T成像系统和16通道头颈部相控线圈。T1加权成像（T1-weighted imaging, T1WI）轴位序列扫描参数：TR 600 ms，TE 15 ms，FOV 220 mm×220 mm，矩阵220×182；对比增强T1加权成像（contrast enhanced T1-weighted imaging, CE_T1WI）轴位序列扫描参数：TR 372 ms，TE 12 ms，FOV 220 mm×220 mm，矩阵220×174；T2脂肪抑制加权成像（T2-weighted imaging fat suppression, T2WI_FS）轴位序列扫描参数：TR 1140 ms，TE 60 ms，FOV 200 mm×200 mm，矩阵180×150。3种序列成像的层厚、层间距均分别为5.0 mm、1.0 mm。增强对比剂用Gd-DTPA，剂量为0.2 mmol/kg，注射速率为2.5 mL/s。

1.3 病理学分析

       由2名5年以上诊断经验的病理科医师对NPC病理切片进行分析。经固定（甲醛水溶液）、包埋（石蜡）、干燥、脱蜡（二甲苯）、冲洗（乙醇）、水化（蒸馏水）。使用Ki-67蛋白抗体（稀释倍数1∶300）（北京中杉金桥生物技术有限公司）进行免疫组织化学染色。细胞核呈深黄色或棕色则视为阳性。在5个阳性密度最高的区域中选择阳性细胞，然后在高倍镜（×400）下计数100个细胞核来确定阳性细胞的百分比。Ki-67增殖指数（proliferation index, PI）≤50%为记为低表达，＞50%为高表达^{[13, 14, 15, 16]}。

1.4 图像分割和特征提取

       从我院影像存档与通信系统获取所有NPC患者的MRI图像资料。所有图像在勾画感兴趣区（region of interest, ROI）之前均进行偏置场校正以消除磁场不均匀导致的信号强度变化^[17]。由具有3年及10年以上工作经验的头颈部MRI诊断医师各1名，采用3D-Slicer（https://www.slicer.org,version 4.13.0）盲法在CE_T1WI图像上沿病灶边缘逐层勾画ROI，并复制到T1WI、T2WI_FS图像上，再严格根据NPC病灶的实际形态对此ROI区域进行擦除或补画以消除序列定位不匹配带来的勾画误差，逐层勾画完毕后，生成全肿瘤容积感兴趣区（volume of interest, VOI）（图1）。由3年头颈部MRI诊断经验的医师于两周后再勾画一次，以便评估同一勾画者自身和不同勾画者之间手动分割的一致性。同时在T1WI_CE上记录病灶的强化程度及肿瘤最大径，强化程度以最大对比增强率（maximum contrast enhance-mentratio, MCER）来评价，MCER=（Smax-S0）/S0，Smax为CE_T1WI图像上信号测量区最大信号强度值，S0为增强前信号强度值，测量时避开坏死囊变部分。根据Youden指数确定MCER的最佳诊断临界值为1.39，MCER＞1.39记为明显强化，＜1.39记为轻-中度强化。由2名头颈部MRI诊断经验医师共同评价并商议后达成一致结果。

       用Python软件（https://www.python.org，version 3.7）的“Pyradiomics”包从CE_T1WI、T1WI、T2WI_FS序列图像中分别提取特征。在提取特征之前，使用线性插值算法将图像重采样到1 mm×1 mm×1 mm（x,y,z）的坐标，将像素空间标准化。通过组内和组间相关系数（intra- /inter- class correlation coefficient, ICC）评估同一勾画者自身和不同勾画者之间手动分割的一致性。ICC＞0.75表示一致性较好。

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图1  使用3D-Slicer在对比增强T1加权成像（T1WI_CE）、T1加权成像（T1WI）、T2脂肪抑制加权成像（T2WI_FS）轴位序列上手动勾画感兴趣区（ROI）及生成全肿瘤容积感兴趣区（VOI）示意图。1A～1D、1F～1I、1K～1N分别为基于T1WI_CE、T1WI、T2WI_FS逐层勾画ROI；1E、1J、1O分别为基于T1WI_CE、T1WI、T2WI_FS的全肿瘤VOI。
Fig. 1  Schematic diagram of manually segmenting the region of interest (ROI) and generated volume of interest (VOI) on the axial contrast enhanced T1‐weighted imaging (T1WI_CE), T1‐weighted imaging (T1WI), T2‐weighted imaging fat suppression (T2WI_FS) using 3D-Slicer. 1A-1D, 1F-1I, 1K-1N: ROI segmented slice-by-slice from T1WI_CE, T1WI, T2WI_FS, respectively; 1E, 1I, 1O: VOI of the whole tumor based on T1WI_CE, T1WI, T2WI_FS, respectively.

1.5 预测模型的建立

       对Ki-67高表达组和低表达组间的性别、年龄、TNM分期、肿瘤最大径等进行比较，采用单-多变量logistic回归筛选出差异有统计学意义（P＜0.05）的因素构建临床模型。

       根据对医生1自身、医生1和医生2之间勾画VOI后所提取特征的一致性分析结果，剔除ICC＜0.75的特征。通过Z-score法对所有组学特征进行标准化处理。利用R软件（https://www.r-project.org，version 4.1.2）对组学特征进行3阶段筛选，首先采用Student's t或Mann-Whitney U检验进行初始筛选，再用Pearson相关性分析剔除相关性系数|r|≥0.8的特征，最后基于“glmnet”包的最小绝对收缩与选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）及10倍交叉验证筛选得到最优特征集，以此计算影像组学评分（radiomic score, Rad-score）。

       将差异有统计学意义（P＜0.05）的临床影像特征和Rad-score结合建立联合模型，并绘制列线图将模型可视化。

1.6 统计学方法

       使用R 4.1.2软件分析171例NPC患者的临床资料，数值变量采用Student's t检验或Mann-Whitney U检验，分类变量使用χ²检验、校正卡方或Fisher法。使用logistic回归构建模型。以曲线下面积（area under the curve, AUC）和DeLong检验评价和比较三种模型的预测性能。用拟合优度（Hosmer-Lemeshow, H-L）检验评估模型的拟合度，并绘制其校准曲线，P＞0.05表示拟合度良好。通过决策曲线（decision curve analysis, DCA）观察列线图的临床应用价值。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

       171例NPC患者中，Ki-67高表达者105例，Ki-67低表达者66例；两组间EBV-DNA载量、肿瘤强化程度差异有统计学意义（P均＜0.05），其余变量差异无统计学意义（P均＞0.05）（表1）。

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表1  171例鼻咽癌患者临床资料比较
Tab. 1  Comparison of clinical data of 171 nasopharyngeal carcinoma patients

2.2 构建临床模型

       单-多变量logistic回归结果显示EBV-DNA≥5000 IU/mL（OR=3.809，95% CI:1.497～10.481,P=0.007）、肿瘤明显强化（OR=4.064，95% CI:1.575～11.294,P=0.005）为Ki-67高表达的独立预测因子（见表2），基于以上两个因素构建临床模型。

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表2  临床影像特征预测鼻咽癌Ki-67表达状态的logistic回归分析
Tab. 2  Logistic regression analysis of clinic-radiological features for predicting Ki-67 expression status in nasopharyngeal carcinoma

2.3 构建MRI影像组学模型

       根据两名医生勾画VOI后所提取特征的一致性分析结果，从CE_T1WI、T1WI、T2WI_FS序列图像中各自提取的1037个特征中分别剔除ICC＜0.75的809、843、828个冗余特征。通过单因素分析筛选得到64个特征，再经Pearson相关性检验剔除23个特征，保留41个特征,最后采用LASSO算法筛选得到13个最优特征（基于CE_T1WI 7个、T1WI 4个、T2WI_FS 2个）（图2，表3）。从而计算得到每个癌灶的Rad-score。训练集中，Ki-67高、低表达组的Rad-score分别为（0.403±0.561）、（-0.633±0.804），差异有统计学意义（t=7.195，P＜0.001）。验证集中，两组的Rad-score分别为（0.417±0.649）、（-0.467±0.809），差异具有统计学意义（t=5.417，P＜0.001）。

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图2  使用LASSO-logistic回归选择特征。2A：通过调整λ来取得最小二项式偏差。2B：使用LASSO和10倍交叉验证法选择最佳模型参数λ，纵轴为二项偏差，横轴为log（λ）值，垂直虚线与横轴交点为最佳log（λ）值。LASSO：最小绝对收缩与选择算子。
Fig. 2  Feature selection using LASSO-logistic regression. 2A: Minimum binomial deviation is obtained by adjusting λ. 2B: Use LASSO and 10 fold cross validation to select the best model parameter lambda, the vertical axis is the binomial deviation, and the horizontal axis is the log (λ) value. The intersection of the vertical dashed line and the horizontal axis is the optimal log (λ) value. LASSO: least absolute shrinkage and selection operator.

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表3  LASSO筛选获得的影像组学特征及其系数
Tab. 3  Radiomic features and the coefficients obtained by LASSO

2.4 构建联合模型

       由肿瘤强化程度、EBV-DNA载量及Rad-score这3个因素构建联合模型并绘制列线图将模型可视化（图3A）。列线图显示若对于一位EBV-DNA＜5000 IU/mL、病灶明显强化、Rad-score为1的NPC患者，其三项预测因子总分相加约为112.5分，则该患者Ki-67高表达的概率约为94%。且Rad-score相比其他2个临床因素在预测Ki-67高表达时贡献最大。H-L检验显示列线图在训练集（χ²=3.849，P=0.870）和验证集（χ²=6.670，P=0.573）中均具有较好的拟合度，且校准曲线显示列线图的预测结果和实际观察结果一致性较好（图3B、3C）。

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图3  联合模型列线图及其校准曲线。3A：列线图，由EBV‐DNA载量、强化程度、Rad‐score构成；EBV‐DNA：爱波斯坦巴尔病毒脱氧核糖核酸载量，0代表EBV‐DNA载量＜5000 IU/mL; 1代表EBV‐DNA载量≥5000 IU/mL。3B、3C分别为训练集和验证集的校准曲线图。
Fig. 3  Nomogram of the combined model and its calibration curves. 3A: Nomogram plot. It is composed of EBV‐DNA , enhancement degree and Rad‐score. EBV‐DNA: Epstein‐Barr virus deoxyribonucleic acid, EBV‐DNA＜5000 IU/mL is labled as 0, while EBV‐DNA≥5000 IU/mL is labled as 1. 3B and 3C are the calibration curves in the training and validation cohorts respectively.

2.5 各模型效能评估

       ROC曲线显示列线图的AUC值最高，训练集中，列线图、影像组学、临床模型的AUC值分别为0.887、0.861、0.701，验证集中则分别为0.860、0.814、0.749（表4）。DeLong检验显示，在训练集和验证集中，列线图模型的AUC均高于临床模型，差异均有统计学意义（P均＜0.05），而列线图模型与影像组学模型相比，其AUC值略高，但两者之间差异没有统计学意义（P均＞0.05）（表5）。DCA显示当风险阈概率在0.1～0.9（训练集）、0.1～0.8（验证集）范围内时，列线图比单纯的临床或影像组学模型的人群净获益高（图4）。

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图4  3种模型的决策曲线图。纵轴为净获益率，横轴为概率阈值。4A：训练组；4B：验证组。
Fig. 4  Decision curves of three models. The vertical axis is the net benefit rate, and the horizontal axis is the probability threshold. 4A: training group; 4B: validation group.

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表4  3个模型的预测效能比较
Tab. 4  Comparison of the prediction performance of three models

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表5  列线图与其他两种模型的AUC值比较
Tab. 5  Comparison of AUC values between the nomogram and the other two models

3 讨论

       本研究初步探讨了基于多参数MRI影像组学联合临床-影像特征的多维度列线图在预测NPC患者的Ki-67表达状态方面的潜在价值。结果表明，联合多序列（CE_T1WI、T1WI和T2WI_FS）图像构建的影像组学模型具有良好的预测效能，并且发现将Rad-score与临床-影像特征联合进一步提高了模型的预测效能，基于以上因素建立的多维度列线图模型能够无创、准确地区分出Ki-67高表达和低表达的NPC患者，从而为指导临床决策和判断患者预后提供了依据。

3.1 MRI影像组学预测NPC Ki-67表达水平的必要性

       随着调强放疗和新辅助化疗的应用，NPC患者的五年生存率逐渐提高^[18]。然而，复发和远处转移仍然是影响患者长期预后的主要问题^[19]。在抗肿瘤治疗前评估肿瘤的侵袭性有助于预测NPC患者预后^[20]。而Ki-67是评估细胞增殖最广泛使用的标记物，其表达与NPC的生长、转移、复发和远期预后密切相关^{[21, 22, 23]}，目前，NPC的Ki-67表达水平主要是通过活检获取病理组织进行免疫组化染色明确，然而肿瘤组织常常具有高度的异质性，活检获得的局部组织无法准确反映整个肿瘤Ki-67表达的全貌；此外，有创的活检操作可能导致出血、感染、肿瘤播散等并发症。因此在治疗前无创预测NPC的Ki-67表达水平具有重要的临床意义。Wu等^[13]和Deng等^[24]的研究表明一些功能MRI的定量参数与Ki-67的表达存在明显的相关性，可以作为预测Ki-67表达状态的生物标记物，然而不同研究者测量结果存在明显差异，而且功能MRI技术因额外的扫描序列导致扫描时间长、检查费用高，且需要复杂的后处理。

       影像组学通过机器学习算法从常规影像学图像中高通量地提取海量传统视觉图像特征无法评估的肿瘤纹理、小波特征等方面的高维度信息^{[25, 26]}，与肿瘤的异质性密切相关。而不同Ki-67 PI的肿瘤在细胞增殖、分化等方面存在明显异质性^[27]，与影像组学特征参数具有潜在的相关性。

3.2 MRI影像组学特征分析

       本研究共筛选得到13个最佳特征，包括1个形状特征（球形度）、5个一阶统计特征（偏度、峰度、中位数、第90个百分位数）、7个纹理特征。纹理特征包括灰度大小区域矩阵（gray level size zone matrix, GLSZM）、灰度共生矩阵（gray level co-occurrence matrix, GLCM）、灰度依赖矩阵（gray level dependence matrix, GLDM）。GLSZM为具有相同灰度强度的连接体素的数量，GLCM则描述了具有某种空间位置关系的两个像素灰度的联合分布，GLDM为依赖于中心体素的特定距离内连接体素的数量。以上纹理参数是根据体素排列计算的数值，可以表征肿瘤空间中体素排列的规律性（或不规则性）。另一方面，肿瘤异质性可能与局部肿瘤细胞数量、增殖、缺氧、血管生成和坏死有关^[28]，而这些因素与Ki-67表达水平和预后密切相关。这也进一步说明了医学图像的影像组学分析可以通过描述肿瘤空间中的体素排列来反映肿瘤的异质性。

3.3 基于MRI影像组学的列线图预测NPC Ki-67表达水平的效能

       既往关于NPC的影像组学研究主要集中在预测生存结局（PFS、总生存期等）和放化疗疗效^[11,29-30]，王欣等^[30]探讨了基于MRI的多序列模型融合（multi-sequence model fusion, MSMF）影像组学模型在预测NPC患者同步放化疗（concurrent chemoradiotherapy, CCRT）疗效中的价值，结果显示多序列融合模型中MSMF、临床-MSMF模型的AUC值分别为0.896、0.867,均显著高于单独的临床、T1WI、T2WI模型（0.542、0.633、0.711），这表明多个MRI序列联合能更充分、全面地挖掘出肿瘤的异质性特征。本研究也从多个序列图像（CE_T1WI、T1WI、T2WI_FS）中提取特征，观察最终的13个最优特征，可以发现基于这3个序列的影像组学特征对Rad-score均有不同程度贡献（基于CE_T1WI 7个，T1WI 4个，T2WI_FS 2个），并且基于以上序列建立的影像组学模型在训练集和验证集中均具有良好的预测效能（AUC值分别为0.861、0.814）。Fang等^[11]基于MRI影像组学联合临床因素构建的列线图预测NPC患者PFS时表现出良好的效能（训练集和验证集中的C指数分别为0.819和0.820），但以上研究仅涉及单纯的影像组学特征结合临床因素，未纳入NPC病灶的定性MRI征象，而某些MRI征象如肿瘤的强化程度则反映了病灶内部微血管结构和功能，这往往会影响肿瘤的增殖程度，从而间接反映Ki-67的表达水平和患者的长期预后。本研究不仅基于多个MRI序列进行建模，而且联合了传统的临床影像特征，结果显示加入临床因素以及MRI强化程度后，模型预测Ki-67表达状态的效能在训练集和验证集的效能均有不同提高（训练集AUC：0.887 vs. 0.861；验证集AUC：0.860 vs. 0.814）。这也说明临床特征、影像学征象和影像组学特征之间存在互补作用，基于不同维度（临床、病理、影像等）特征构建联合模型将是未来的发展趋势。

       研究结果显示Ki-67高表达在肿瘤明显强化和EBV-DNA≥5000 IU/mL的NPC患者中更为常见。Ki-67表达水平越高，肿瘤细胞增殖活性越强，其内部血流供应越丰富，因此在MRI图像上强化程度也越明显。而既往研究^[13]证实三维脉冲连续动脉自旋标记成像参数最大血流量与Ki-67 PI呈显著正相关（r=0.425，P=0.010），且其在Ki-67高表达组的值显著高于Ki-67低表达组。本研究结果与以上结果一致。已有研究^[31]表明，定量分析EBV阳性与Ki-67 PI高度相关（r=0.720，P=0.017），这可能与EB病毒编码的核糖核酸通过促进细胞生长和调节免疫过程而促进肿瘤发生有关^[32]。然而基于以上两个因素构建的临床模型仅表现出中等的性能，其AUC值分别为0.701（训练集）、0.749（验证集）。原因可能是它们仅提供局限于肉眼观察的解剖及病理生理方面的信息，不能充分反映肿瘤内部异质性。因此本研究将影像组学特征参数与临床影像特征相结合建立联合模型，并绘制列线图将Ki-67高表达的危险因子权重进行了量化，实现了对Ki-67高表达概率的可视化预测。并且发现将Rad-score加入临床模型后，列线图的预测效能无论在训练组还是验证组较单独的临床模型均有显著提高（DeLong检验，P均＜0.05），这说明从MRI图像中提取的反映肿瘤细胞功能代谢的组学特征参数比常规的形态学特征能更好地描述肿瘤异质性；而列线图模型与影像组学模型相比，其AUC值虽有提高，但两者之间差异无统计学意义（P均＞0.05），这可能是与本研究纳入的临床影像特征较少有关，导致将以上两个因素加入Rad-score后未能显著提高列线图模型的整体效能，未来的研究还应广泛纳入血液学参数以优化模型性能。

3.4 本研究的局限性

       第一，本研究为回顾性研究，难免会有选择偏倚，且病例均来自单中心，今后有待在多中心和前瞻性环境中进行验证；第二，研究序列未包括扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）的表观扩散参数图，主要是因为鼻咽、鼻窦周围组织及颅底区的DWI容易受到磁敏感伪影的干扰；第三，本研究仅基于LASSO-logistic回归构建模型而未使用其他机器学习方法，该模型的效能是否最佳有待后续研究进一步验证。

       综上所述，基于多参数MRI的影像组学联合临床影像特征构建的列线图能可视化地对NPC患者的 Ki-67表达状态进行无创预测，优于单一模型，为判断患者预后和指导临床决策提供了可靠的依据。