行维持性血液透析（maintenance hemodialysis, MHD）治疗的终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）患者常伴发认知功能障碍、焦虑和抑郁等神经心理并发症^{[1, 2, 3, 4]}。这些并发症严重影响患者的生活质量、甚至可增加其死亡率。故探索无神经心理障碍的MHD患者的脑结构变化特点对于理解神经心理并发症的脑机制、早期诊断和干预至关重要。有研究利用基于体素的形态学（voxel-based morphometry, VBM）分析技术探索了ESRD患者脑灰质体积（gray matter volume, GMV）的变化特点^[5]，但很少有研究进一步评估患者发生神经心理并发症之前的脑结构变化。而且，仅仅形态学分析不足以充分揭示脑结构重组机制^{[6, 7]}，结构协变网络（structural covariant network, SCN）分析能够通过构建基于组水平的结构脑网络进一步研究脑结构重组的特点。因此，本研究的旨在联合VBM和SCN分析，深入探索无神经心理障碍的MHD患者的GMV及SCN的变化特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本前瞻性研究符合《赫尔辛基宣言》，经大连大学附属中山医院伦理委员会批准，批准文号：2019008，全体受试者均签署了知情同意书。于2016年10月到2018年9月期间，在大连大学附属中山医院透析中心纳入无神经心理障碍的MHD患者23例。患者组纳入标准：（1）符合ESRD诊断；（2）每周行血液透析治疗3～4次；（3）透析龄≥3月；（4）右利手。排除标准：（1）整体认知功能下降，即蒙特利尔认知量表（Montreal Cognitive Assessment Scale, MoCA）评分＜26^[8]；（2）焦虑和抑郁评分≥50^[9]；（3）年龄小于18或大于70岁；（4）药物或酒精滥用史；（5）精神病史及家族史；（6）严重的心衰、肝脏疾病等；（7）无法独立完成神经心理测试者；（8）T1结构像及T2液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery, FLAIR）图像证实存在严重的脑内病变（如严重的脑白质病变、慢性或急性缺血性脑血管疾病、肿瘤等）；（9）图像存在严重伪影者；（10）MRI扫描禁忌证。

       同期招募23例性别、年龄及受教育年限相匹配的健康志愿者作为对照组。对照组纳入标准：（1）无慢性或急性肾脏疾病；（2）无糖尿病等其他系统性疾病；（3）右利手。排除标准与患者组相同。

1.2 神经心理学测试

       使用MoCA、数字连线测试A（Trail Making Test A, TMT-A）、数字广度测试（Digital Span Task, DST）评估认知功能。焦虑自评量表（Self-rating Anxiety Scale, SAS）和抑郁自评量表（Self-rating Depression Scale, SDS）评估情绪状态。

1.3 MRI数据采集

       采用Siemens 3.0 T MRI（Siemens, Verio, Germany）扫描仪收集所有受试者的3D-T1结构像及常规T2-FLAIR图像。3D-T1序列扫描参数：重复时间2530 ms，回波时间2.22 ms，翻转角7°，视野224 mm×224 mm，层数192，层厚1 mm；T2-FLAIR序列扫描参数：重复时间4000 ms，回波时间77 ms，翻转角150°，视野250 mm×226 mm，层数20，层厚5.0 mm。

1.4 图像分析

1.4.1 数据预处理及VBM分析

       利用基于MATLAB平台的SPM8工具箱进行数据预处理和VBM分析。预处理包括如下四步：（1）数据转换，即3D-T1原始数据转换成NIFTI格式数据；（2）分割，基于DARTEL^[10]算法将格式转换后的T1图像分割成灰质、白质和脑脊液；（3）空间标准化，将灰质图像配准到标准MNI空间；（4）调制，校正空间标准化过程中产生的偏差。VBM分析需先将调制后的图像以8 mm的平滑核进行平滑处理；为消除灰质和白质的边缘效应，进一步将灰质图像中灰度值＜0.15的体素排除，以进行统计分析。

1.4.2 利用图论分析工具箱进行SCN分析

       利用图论分析工具箱进行SCN分析的步骤如下^[11]：（1）构建基于组水平的SCN。调制后的灰质图像根据自动化解剖标记（Automated Anatomical Labeling, AAL）脑图谱划分为90个脑区。线性回归分析用以消除性别、年龄、受教育年限及颅内总容积的影响^[12]，然后计算所有脑区之间的GMV的Pearson相关系数，最终得到90×90的相关矩阵，即基于组水平的SCN（图1A、1B）。基于特定的网络稀疏度将相关矩阵转换成二值矩阵（图1C、1D），此二值矩阵用于计算图论参数。（2）选择合适的网络稀疏度。网络稀疏度指该网络存在的边数与该网络最大可能存在的边数的比值。本研究最小网络稀疏度需满足两个SCN均为全连接状态，无任何孤立节点，故最小稀疏度为0.14。稀疏度太大通常被认为是非生物网络，故最大稀疏度设置为0.5^[11,13]。因此本研究稀疏度取值范围为0.14～0.5（间隔为0.02）。（3）计算全局和局部水平的图论参数^[11]。全局参数包括聚集系数（clustering coefficient, Cp）、标准化Cp（Gamma）、特征路径长度（characteristic path length, Lp）、标准化Lp（Lambda）、小世界属性标量（Sigma）、全局效率（global efficiency, Eg）和局部效率（local efficiency, Eloc）。局部参数包括节点度和节点介数。

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图1  结构协变网络的相关矩阵和二值网络。1A和1B分别表示HC组和MHD患者组在最小稀疏度为0.14时的相关矩阵（坐标轴数字1到90表示自动化解剖标记脑图谱的标签）；1C和1D分别表示对照组和MHD患者组在最小稀疏度为0.14时的二值网络。HC：健康对照；MHD：维持性血液透析。
Fig. 1  The correlation matrix and binary network of structural covariance network. 1A and 1B respectively represent the correlation matrix of the HC and patient group (MHD) at the minimum sparsity with 0.14 (the numbers 1-90 of axes represent the number labels of the Automated Anatomical Labelling atlas); 1C and 1D respectively represent the binary network of the HC and MHD group at the minimum sparsity with 0.14. HC: health controls; MHD: maintenance hemodialysis.

1.4.3 基于SCN的鲁棒性分析

       本研究利用网络相对大小评估最小稀疏度（0.14）时的SCN对蓄意和随机攻击的鲁棒性。蓄意攻击指以节点度由高到低的顺序依次移除90个节点，直到90个节点完全移除。随机攻击指每次移除节点为完全随机，直到90个节点全部移除。网络相对大小指每次移除节点后的子网络的总边数与SCN的总边数之比。综上，每次节点移除均可得到一个对应的网络相对大小。故可用网络相对大小随节点移除的变化曲线可视化SCN的鲁棒性。需注意的是，随机攻击模型需重复1000次保证结果的稳定性。

1.5 统计学分析

       一般临床资料使用R软件（版本3.6.1,http://www.r-project.org）进行统计分析。连续变量（x¯±s表示）用两样本t检验进行组间比较。分类变量（例数[百分比]表示）使用卡方检验进行组间比较。组间GMV的比较使用两样本t检验，整体错误率（family wise error, FWE,团簇水平的P值＜0.05，体素水平的P值＜0.001,团簇大小＞20个体素）用于多重比较校正。如果GMV存在显著组间差异，则对患者组显著变化的GMV与神经心理学评分进行偏相关分析，协变量为性别、年龄及受教育年限。根据既往研究^[10]，所有SCN的图论参数使用置换检验联合曲线下面积（area under the curve, AUC）分析进行组间比较[局部参数需额外使用错误发现率（false discovery rate, FDR）进行多重比较校正]。网络的鲁棒性分析使用置换检验进行组间比较，即比较每次节点移除时两组网络相对大小的差异。本研究统计显著性水平阈值设定为P＜0.05（双尾）。

2 结果

2.1 一般资料

       两组性别比例、年龄、受教育年限、神经心理学评分（MoCA、TMT-A、DST、SAS和SDS评分）差异无统计学意义（P值均＞0.05）（表1）。

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表1  临床资料和神经心理学测试
Tab. 1  The clinical data and neuropsychological test

2.2 GMV变化及其与神经心理学评分的关系

       患者组右侧杏仁核GMV显著低于对照组（P＜0.05，FWE校正）（表2、图2），但降低的GMV与所有神经心理学评分均无显著相关性（P值均＞0.05）。

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图2  灰质体积的差异。患者组右侧杏仁核显著低于健康对照组（P＜0.05, FWE校正）；L表示左侧。
Fig. 2  The difference of the gray matter volume. The gray matter volume of the right amygdala was significantly lower in the patient group than in the health controls (P＜0.05, FWE corrected). L: left.

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表2  患者组与对照组灰质体积的比较
Tab. 2  Comparison of the gray matter volume between patients and healthy control group

2.3 图论参数的比较

       两组的SCN均具有小世界属性，即Sigma＞1、Lambda≈1和Gamma＞1,见图3。在大多数稀疏度下，患者组Cp和Eloc显著高于对照组（P值均＜0.05）（图4A～4D），且AUC分析进一步证实患者组Cp（P=0.011）和Eloc（P=0.003）高于对照组（图4E）。

       AUC分析显示两组所有节点的度值和介数值差异无统计学意义（P值均＞0.05，FDR校正）。

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图3  三个定量评估小世界属性参数的真实值和组间比较。3A、3B和3C分别表示不同稀疏度下患者组（MHD，红色）和对照组（HC，蓝色）Sigma、Lambda及Gamma的真实值；3D、3E和3F分别显示Sigma, Lambda及Gamma在所有稀疏度下的组间差异无统计学意义（P值均＞0.05）。MHD：维持性血液透析；HC：健康对照；Sigma：小世界属性标量；Lambda：标准化特征路径长度；Gamma：标准化集聚系数。
Fig. 3  The actual values and comparisons of three quantitative parameters used to evaluate small-world attribute. 3A, 3B and 3C respectively represent the actual values of Sigma, Lambda and Gamma in the patient group (MHD, red) and healthy controls (HC, blue) at different sparsities; 3D, 3E and 3F respectively show that Sigma, Lambda and Gamma have no significant difference between the groups at all sparsities (all P＞0.05). MHD: maintenance hemodialysis; HC: health controls; Sigma: small-worldness scalar; Lambda: normalized characteristic path length; Gamma: normalized clustering coefficient.

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图4  Cp和Eloc的真实值和组间比较以及全局参数的AUC分析。4A和4B分别表示不同稀疏度下患者组（MHD，红色）和对照组（HC，蓝色）Cp和Eloc的真实值；4C和4D显示Cp和Eloc在多数稀疏度下均存在显著的组间差异（P值均＜0.05）；AUC分析显示所有全局属性参数的组间比较，可见Cp（P=0.011）和Eloc（P=0.003）差异具有统计学意义（4E）。Cp：聚集系数；Eloc：局部效率；AUC：曲线下面积；MHD：维持性血液透析；HC：健康对照；Lp：特征路径长度；Gamma：标准化Cp；Lambda：标准化Lp；Sigma：小世界属性标量；Eg：全局效率。
Fig. 4  The actual values and comparisons of Cp and Eloc, and the global parameters'AUC analysis. 4A and 4B respectively represent the actual values of Cp and Eloc in the patient group (MHD, red) and healthy controls (HC, blue) at different sparsities; 4C and 4D respectively show that Cp and Eloc have significant difference between the two groups at most of sparsities (all P＜0.05); AUC analysis reveals the comparison of global parameters between the two groups, which show that the difference between Cp (P=0.011) and Eloc (P=0.003) was statistically significant (4E). Cp: clustering coefficient; Eloc: global efficiency; AUC: area under curve; MHD: maintenance hemodialysis; HC: health controls; Lp: characteristic path length; Gamma: normalized Cp; Lambda: normalized Lp; Sigma: small-worldness scalar; Eg: local efficiency.

2.4 网络鲁棒性的比较

       面对蓄意攻击（图5A），在移除多个节点的情况下，患者组SCN的相对大小显著低于对照组（20/90，P值均＜0.05）。面对随机攻击（图5B），两组在移除任意节点时均具有相似的网络相对大小（P值均＞0.05）。

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图5  鲁棒性分析。5A和5B分别表示患者组（MHD，红色）和对照组（HC，黑色）的结构协变网络对蓄意攻击和随机攻击的相对大小变化曲线，其中5A可见在移除多个节点时存在显著的组间差异（红色星号表示P＜0.05）；横坐标表示移除节点数占总节点数的比值，纵坐标表示网络相对大小。MHD：维持性血液透析；HC：健康对照。
Fig. 5  Robustness analysis. 5A and 5B respectively represent the change curve of the relative sizes of the structural covariant network of the patient group (MHD, red) and the HC group (black) against targeted and random attacks, where 5A shows that there is significant difference between the two groups when removing multiple nodes (red asterisk indicates P＜0.05). The horizontal axis represents the ratio of the number of nodes removed to the total number of nodes, and the vertical axis represents the relative sizes of the network. MHD: maintenance hemodialysis; HC: health controls.

3 讨论

       本研究首次联合VBM和SCN分析探索无神经心理障碍的MHD患者GMV和SCN的变化特点，结果显示患者组右侧杏仁核的GMV显著低于对照组，提示MHD患者在发生明显神经并发症之前可能已经存在局限性的GMV降低。SCN分析显示患者组两个全局参数（Cp和Eloc）显著高于对照组。此外，鲁棒性分析发现患者组SCN面对蓄意攻击更易受损。

3.1 患者组GMV变化

       既往研究^{[14, 15, 16, 17, 18]}发现ESRD患者存在包括杏仁核在内的、广泛的GMV降低。这些研究所纳入的研究对象并未能够确保受试者保持相对正常焦虑和抑郁情绪。因此，笔者推测本研究所有受试者相对正常的情绪状态可能是与既往研究结果不完全一致的最重要因素。杏仁核与情绪调节、认知功能、奖赏和恐惧机制等有关^{[18, 19, 20]}。尽管本研究未能发现杏仁核降低的GMV与情绪、认知评分存在显著相关性，但杏仁核的GMV的降低至少表明杏仁核与无神经心理障碍的MHD患者的早期脑损伤有关。

3.2 患者组图论参数的变化

       人脑属于一种具有小世界属性的网络系统，能使全脑功能整合和功能分离达到最佳平衡状态以将全脑信息进行高效、低成本传输和处理^{[21, 22]}。研究显示ESRD患者静息态功能及白质结构脑网络均具有小世界属性^{[23, 24]}。本研究进一步证实了无神经心理障碍的MHD患者的灰质SCN同样具有小世界属性，而且小世界属性参数无显著的组间差异，这表明患者组能够以相对正常效率处理和传输不同的脑信息。

       本研究还发现患者组两个衡量网络功能分离的参数（Cp和Eloc）显著高于对照组，这说明患者组SCN的功能分离能力（即局部信息处理能力）显著增强^[25]。然而，既往研究结果显示MHD患者的静息态功能和白质脑网络的功能分离能力较健康对照组显著降低^{[23, 26]}。另有研究认为网络功能分离能力的增强（即Cp和/或Eloc升高）可能是脑损害的重要网络代偿机制^{[27, 28, 29]}，据此推测患者组Cp和Eloc升高可能是早期脑损害的网络代偿效应。因此，Cp和Eloc升高相关的网络代偿机制可能是MHD患者早期脑结构重组的重要特点。

3.3 患者组SCN的易损性

       本研究结果显示与对照组相比，患者组SCN对随机攻击具有相似的鲁棒性，而对蓄意攻击则具有更高的易损性。Achard等^[30]研究表明越规则的网络对蓄意攻击的抵抗力越弱。本研究患者组升高的Cp 和Eloc也反映了患者组SCN更加规则化。因此，从SCN的观点来看，MHD患者早期SCN的重组伴随对病理攻击抵抗力减弱是MHD患者容易发生神经病理损害的重要证据之一。

3.4 GMV变化和结构协变网络的联系

       本研究显示VBM分析较SCN分析能够更敏感地发现局部灰质结构的变化（右侧杏仁核GMV降低）。尽管VBM分析仅发现局限性的杏仁核GMV降低，但是SCN分析显示MHD患者整体的网络结构已发生显著改变。因此，VBM联合SCN分析能够从局部到整体以互补的方式更进一步地探索MHD患者脑结构重组特点，这为深入理解MHD患者脑损害机制提供了新的视角。

3.5 本研究的局限性

       第一，本研究属小样本和横截面研究，无法揭示MHD患者灰质脑网络和神经损伤的纵向变化。因此，有必要进行大样本、纵向研究。第二，本研究患者组性别比例不平衡，可能对结果产生潜在的影响。因此，需进一步根据性别差异进行亚组分析。第三，基于组水平的SCN分析不能够直接分析脑网络参数与临床变量的关系。第四，尿毒症神经毒素、其他可能存在的神经系统并发症等也能导致大脑形态学的改变。未来研究需进一步排除这些潜在因素的影响。

       综上所述，本研究发现无神经系统并发症的MHD患者的GMV丢失局限于杏仁核。此外，这类患者SCN的功能分离能力增强（Cp和Eloc升高），但对蓄意攻击的抵抗性减弱，这表明患者SCN局部信息处理能力增强的同时伴有对病理性损害的抵抗力减弱。因此，推测MHD患者灰质结构及灰质SCN的重组可能是MHD患者早期脑损害的重要结构基础。