0 前言

       急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是一种以造血组织幼稚淋巴细胞增殖为特征的血液恶性肿瘤，也是儿童最常见的恶性肿瘤，约占0～14岁确诊恶性肿瘤人群的25%^{[1, 2]}。目前国内、外ALL患者的5年总生存率已超过90%^{[3, 4]}，现代治疗的主要目标是在保持高治愈率的同时减少治疗的后遗症，如化疗相关认知障碍（chemotherapy-induced cognitive impairment, CICI）越来越值得关注。CICI是指非中枢神经系统肿瘤化疗后出现智力、注意力、执行能力等认知功能的损伤^{[5, 6]}，这些问题影响着ALL长期生存患者的社会心理状态、治疗依从性和生活质量。既往研究已证实接受化疗的儿童ALL患者在停止治疗后数年可观察到大脑灰白质体积的减少与认知功能障碍有关^{[7, 8, 9]}。但是，以往研究对象多为成年后的儿童ALL幸存者，缺乏关于仍处于儿童期的ALL幸存者化疗结束后脑灰质体积变化的研究，且儿童期灰质体积变化与认知功能的关系仍不清楚。因此，本研究拟采用基于体素的形态测量学方法（voxel-based morphometry, VBM）分析儿童期ALL患者化疗结束后脑灰质体积变化，并分析其与认知功能的相关性，探讨儿童期ALL患者化疗结束后脑灰质体积变化与认知功能损害关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

       本研究为横断面研究。收集2021年3月至2022年7月在遵义医科大学附属医院就诊的ALL经治儿童20例为ALL组。其中男11例，女9例，年龄7～15（10.72±2.91）岁，末次化疗距离MRI检查的时间为2～24个月（中位时间：15个月）。纳入标准：（1）年龄在6～16岁之间；（2）采用的化疗方案包括中国儿童白血病组（the Chinese Childhood Leukemia Group, CCLG）-ALL 2008和2018版本方案以及中国儿童肿瘤协作组（the Chinese Children's Cancer Group, CCCG）-ALL 2015版本方案，完成治疗、达到完全缓解；（3）治疗结束2年内无复发。排除标准：（1）中枢神经系统白血病浸润；（2）既往有其他中枢神经系统疾病病史；（3）放疗史；（4）常规颅脑MRI异常；（5）左利手；（6）VBM分析中皮层分割效果不佳^[10]；（7）认知功能评估不配合者。

       同期招募6～16岁健康儿童志愿者20名作为对照组，其中男10例，女10例，年龄6～14（10.26±2.43）岁。排除标准：（1）既往有其他中枢神经系统疾病病史；（2)常规颅脑MRI异常；（3）左利手；（4）VBM分析中皮层分割效果不佳^[10]；（5）认知功能评估不配合者。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，且已获遵义医科大学伦理委员会批准（伦审〔2020〕1-048号），检查前所有受试者监护人均签署知情同意书。

1.2 图像采集

       采用美国GE公司signa HDxt 3.0 T超导型MR扫描仪，所使用的线圈为自带的8通道相控阵头线圈。检查中嘱受试者仰卧，行颅脑轴位MRI扫描。（1）T2加权液体衰减反转恢复序列扫描参数：重复时间7800 ms，回波时间165 ms，反转时间2100 ms，视野240 mm×240 mm，层厚5 mm，层间距1.5 mm，翻转角90°，扫描时间1 min 50 s。（2）高分辨率T1加权图像通过三维扰相梯度回波序列采集参数：重复时间7.8 ms，回波时间3.0 ms，反转时间450 ms，视野 256 mm×256 mm，层厚1.0 mm，层间距0 mm，翻转角15°，扫描时间 3 min 28 s。轴位定位线平行于前-后联合线。

1.3 数据预处理

       在MatlabR 2018b环境下，采用SPM12软件及CAT12工具箱（http://www.neuro.uni-jena.de/cat12/CAT12）对所有ALL组和对照组的3D-T1WI图像进行预处理，处理过程依据CAT12工具箱官方的操作指南及默认参数。具体操作如下：（1）使用MRIcron软件的dcm2niix将所有被试3D-T1WI的DICOM格式图像转换为CAT12可处理的格式；（2）应用CAT12工具箱中Segment将每个被试的NIFTI图像分割为脑灰质、脑白质和脑脊液；（3）将分割后的脑灰质、脑白质、脑脊液图像标准化到CAT12默认的蒙特利尔神经科研研究所（Montreal Neumlogical Institute, MNI）标准空间上；（4）对标准化后的图像进行质量检查，排除分割、配准效果不佳的被试数据；（5）最后，使用8 mm半高全宽高斯核对脑灰质图像进行空间平滑，并计算每个被试的颅内总体积大小。

1.4 认知功能评估

       所有参加研究的ALL患者和正常儿童，由获得韦氏智力量表主试资格的医师采用中国韦氏儿童智力量表第四版^[11]（适用年龄：6～16岁）对儿童的认知功能进行测试评估，通过积木、词汇、理解、字母数字等10个核心分测验及算术、填图、划消、常识4个补充分测验，最终得到言语理解指数、知觉推理指数、工作记忆指数、加工速度指数及全量表智商5个量表。测试在安静环境下进行，并且在测试当日完成颅脑MRI检查。

1.5 统计学方法

       采用SPSS 25.0软件分别对ALL组和对照组的性别、年龄、受教育年限和认知功能结果进行正态性检验。对符合正态分布的计量资料用x¯±s表示，采用两独立样本t检验比较两组间差异；对不符合正态分布的计量资料用中位数和四分位数间距表示，采用非参数检验比较两组间差异；分类变量采用χ²检验，由于本组样本量n=40，故采用Fisher确切概率法。两组受试者灰质体积变化采用SPM12的两独立样本t检验，以受教育年限、颅内总体积为协变量。采用假阳性率（false discovery rate, FDR）对结果进行多重比较校正，将统计学阈值设为P＜0.05，结果体素阈值＞50个。提取两组之间差异脑区的平均灰质体积，以年龄作为协变量与ALL患者的认知功能结果进行偏相关检验。所有检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料和认知功能评估

       ALL组与对照组年龄、性别差异无统计学意义（P均＞0.05）；ALL组受教育年限明显低于对照组（P=0.048）；在控制受教育年限后，ALL组的知觉推理指数、工作记忆指数、加工速度指数、言语理解指数及全量表智商明显低于对照组（P均＜0.05），见表1。

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表1  ALL组和对照组的临床资料和认知功能比较
Tab. 1  Comparison of clinical data and cognitive function between ALL group and HCs

2.2 VBM脑灰质体积比较

       ALL组表现为灰质体积减小的脑区包括：额叶（右眶部额下回、右额中回、右额上回）、颞叶（左颞中回）、顶叶（左中央后回）、枕叶（双侧舌回）、右海马回（FDR校正，P均＜0.05），未发现灰质体积增加的脑区，见表2和图1。

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图1  ALL组与对照组比较灰质体积具有显著差异的脑区。冷色区域代表ALL组较对照组脑灰质体积减小的脑区，主要包括右侧眶部额下回、右侧额中回、右侧额上回、左侧颞中回、左侧中央后回、双侧舌回、右侧海马（FDR校正，P＜0.05）。ALL：急性淋巴细胞白血病。
Fig. 1  Brain regions with significant difference of the brain gray matter volume between ALL group and healthy controls (HCs). The cold colour area represents a decrease in gray matter volume in ALL group compared with HCs, mainly including right orbital inferior frontal gyrus, right middle frontal gyrus, right superior frontal gyrus, left middle temporal gyrus, left postcentral gyrus, bilateral lingual gyrus, right hippocampus (FDR correction, P＜0.05). ALL: acute lymphoblastic leukemia.

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表2  ALL组与对照组相比灰质体积减小的脑区
Tab. 2  Brain regions with decrease in brain gray matter volumes of ALL group and HCs

2.3 相关性分析

       本研究将上述出现差异性脑区域灰质体积与言语理解指数、知觉推理指数、工作记忆指数、加工速度指数及全量表智商进行偏相关分析，结果显示均无明显相关（P均＞0.05）。

3 讨论

       本研究采用VBM分析发现，儿童期ALL患者在化疗结束短期内存在多个脑区灰质体积减小，主要分布在额叶、颞叶、顶叶、枕叶以及海马，且双侧半球均有累及。目前关于ALL患者化疗后脑体积减小神经病理机制仍有待阐明。相关研究表明，鞘内注射和/或静脉注射大剂量甲氨蝶呤通过血脑屏障以预防中枢神经系统白血病细胞浸润的同时，会干扰脑脊液和血清中的叶酸代谢，诱导产生与神经毒性相关的生化改变^[12]，产生对少突胶质细胞、血管内皮细胞的毒性作用和神经元的氧化损伤，导致髓鞘合成减少、血管损伤和神经元凋亡^{[13, 14, 15]}，最终引起白质脱髓鞘病变和/或灰质萎缩。既往研究通过扩散张量成像证实仅接受化疗的ALL患者在化疗前后观察到白质微观结构损伤^{[16, 17]}。研究结果与上述神经病理机制相符。

3.1 ALL患者化疗后基于VBM的脑灰质改变及意义

       国内、外学者采用VBM技术对化疗结束2～40年的儿童ALL幸存者脑微观结构进行研究，结果发现ALL幸存者存在多发性脑灰质体积减小且左侧大脑半球更明显。三项基于VBM技术研究显示，ALL幸存者灰质体积减小的区域位于额叶、顶叶、枕叶、颞叶、海马和小脑^{[8,18, 19]}。另外一项采用VBM技术、感兴趣区法对儿童和青少年ALL患者化疗停药2年后进行脑体积分析，结果发现ALL患者的颞叶、枕叶灰质体积减小^[7]。除了灰质体积外，ALL患者皮质下灰质核团也发现体积减小，包括杏仁核、丘脑、伏隔核、尾状核、苍白球、纹状体^{[7, 8, 9]}。本研究中，接受化疗的儿童期ALL患者灰质体积减小与以往利用VBM技术的类似研究所取得的结果具有较好的一致性，这也表明经过化学治疗后的ALL患者，无论在成年后还是儿童时期，由于化疗药物直接或间接神经毒性作用导致脑灰质体积受到不同程度损伤。与以往研究不同的是，本研究未发现小脑及皮质下核团病变，分析原因可能与纳入的研究对象不同有关，以往研究对象为化疗结束2～40年的儿童ALL幸存者，而本研究对象为化疗结束短期内的ALL患者，或与化疗方案的改进有关。在本研究中，被试对象均为右利手，理论上绝大部分以左侧大脑半球为优势半球^[20]，预估应当发现左侧灰质体积萎缩较右侧明显，但统计结果表明，右侧大脑半球变化较左侧明显，可能是与治疗时年龄较小或细胞抑制药物选择性损伤神经元等因素有关，因此后续研究中有必要进一步研究不同脑区对化疗药物毒性作用的不同易感性。

       研究表明大脑双侧半球额顶网络系统功能分工不同，左侧额顶网络系统主要支配语言处理功能，右额顶网络系统主要与执行功能、视觉处理等认知领域密切相关^[21]。本研究中眶部额下回、额中回、额上回作为大脑前额叶皮质的重要组成部分，负责广泛的认知功能，包括工作记忆、规则学习、计划或决策、动机、智商、注意力、执行功能及情绪调控等一系列活动^{[22, 23]}。PORTO等^[18]和ZOU等^[19]通过VBM和扩散张量成像技术研究发现左侧额上回灰质体积减小，KRULL等^[24]在ALL患者化疗期间研究发现较高的甲氨蝶呤血浆浓度与额纹状体束白质完整性受损和执行功能障碍有关，这些研究均提示化疗对脑结构及功能的影响涉及额叶。中央后回作为躯体感觉最高中枢，接受来自全身的深、浅感觉，它的改变直接影响到人体的感觉功能^[25]。大量研究结果表明颞中回具有多种功能，包括语言相关过程，如言语理解、语义处理等，还参与情感、记忆和社会认知^{[26, 27, 28]}。海马体位于内侧颞叶，是编码新的陈述性记忆的中心，尤其是情景记忆特别依赖海马体的完整性^[29]。此外，海马体与相应大脑皮质结构协同工作以协调陈述性记忆功能，而皮质记忆系统高度依赖皮质下白质连接的完整性，包括重要的前额叶皮质、顶叶皮质以辅助短期视觉记忆、注意力^{[29, 30]}。动物模型研究表明鞘内注射化疗药物如甲氨蝶呤、阿糖胞苷会损害海马树突结构和背侧神经节的棘突密度，并导致记忆障碍^[31]。本研究中颞叶（颞中回、海马）灰质体积萎缩，也可能提示存在神经认知障碍的风险。舌回是内侧枕叶的组成部分，主要参与视觉记忆和情感、视觉表象、创造性思维、语言处理等过程^[32]。由此可见，认知过程依赖于整个大脑网络的完整性以及它们之间的动态相互作用。

3.2 ALL患者化疗后灰质体积变化与认知功能的相关性

       本研究对两组间认知功能结果进行比较发现，化疗结束后ALL患者的言语理解指数、知觉推理指数、工作记忆指数、加工速度指数及全量表智商明显低于对照组，表明接受化学治疗后的ALL患儿存在认知功能改变，且较正常学龄儿童低，这与以往研究结果大致相符^{[5, 33]}，但我们的研究并未发现ALL患者的认知功能结果与其灰质体积改变存在相关性。然而，既往研究表明皮质下灰质核团体积减小与神经认知结果之间存在显著相关性。例如，GENSCHAFT等^[8]对15～22岁ALL患者研究发现，ALL化疗组的图形记忆得分较低与海马体体积较小相关。ZELLER等^[9]对130例成人ALL患者分析发现加工速度、执行功能与其皮质灰质、尾状核及丘脑体积减小呈正相关。VAN DER PLAS等^[7]针对完成化疗数年后的ALL男性患者研究发现，ALL化疗组的工作记忆表现与杏仁核、丘脑、纹状体和胼胝体的体积减小存在显著的结构-功能相关性。由于认知功能结果是一种综合性评估，影响神经认知功能障碍的可能机制复杂多样，包括灰质萎缩和/或白质脱髓鞘的直接神经毒性作用和引起炎症反应、微血管损伤和遗传易感性、继发性免疫反应等^[6]。本研究发现灰质体积萎缩的脑区虽与所测量的认知功能结果无显著相关性，但可能还与情绪和执行功能有关，而本研究中未涉及情绪和执行功能评估。未来的研究应该包括全面的神经认知功能检查，进一步观察儿童期大脑灰质体积变化与神经认知功能的关系。

3.3 本研究的局限性

       本研究还有以下局限性：（1）VBM技术需要对所分析图像进行配准分析，本文所选标准化模板为成人模板，这会对后续配准、统计产生影响，尽管通过限定年龄范围（6～16岁）去除年龄过小的受试者、减少受试者间配准效果的差异，并检查所有受试者的配准结果，去除分割、配准效果不佳者，但细微配准差异也可能引起统计结果偏移^[10]。（2）本研究是一项横断面研究，未能动态观察ALL患者脑灰质体积变化。（3）纳入样本量较少，还需要更大的样本量进一步验证结果的可靠性。（4）两组受试者受教育程度存在明显差异，尽管数据分析过程中以之作为协变量，但仍可能对结果产生一定偏倚。

4 结论

       综上所述，本研究通过磁共振VBM技术发现儿童期ALL患者化疗结束短期内脑灰质体积存在改变，主要集中在额叶、颞叶、顶叶、枕叶以及海马，但这些区域体积改变与其认知功能结果缺乏相关性。这些区域体积的变化对儿童期ALL患者的影响值得进一步研究。