0 前言

       胶质瘤为颅脑常见的原发性神经上皮恶性肿瘤^[1]，根据病理组织分级、临床表现、免疫组化等分为Ⅰ～Ⅳ级^[2]。胶质瘤侵袭能力强，常表现为无包膜、浸润性生长^[3]，且瘤体的位置特殊，导致手术往往难以完全切除，极易复发，因此，最大范围安全切除肿瘤，提高患者生存率是临床有待解决的一项重要问题。

       近年来随着影像技术的发展，MRI在胶质瘤诊断中具有重要价值，而多模态MRI不仅能够显示胶质瘤的位置、大小、形态，还可进一步显示其血液动力学信息以及代谢情况^{[4, 5, 6]}。但目前大部分研究多采用常规MRI设备、运用单个或多个多模态MRI序列进行胶质瘤分级^[2,7]。而运用7 T动物专用高场强MRI检查，并结合多个病理学指标进行胶质瘤瘤周浸润的研究极少。

       本研究采用与人颅脑胶质瘤生物学特性相似的Wistar大鼠脑胶质瘤模型^[8]，基于7.0 T动物专用MRI检查，采用动脉自旋标记技术（arterial spin labeling, ASL）、弥散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）及磁共振波谱（magnetic resonance spectrum, MRS）等功能成像，观察并统计、分析肿瘤组织中心区、浸润区肿瘤细胞生长、浸润情况。此外，本研究将多模态MRI结果与Ki-67、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、CD105的微血管密度（microvessel density, MVD）等指标相结合，并点对点分析之间的相关性，期望进一步完善胶质瘤瘤周浸润信息，探究瘤周浸润影像学表现的生物学基础，从而帮助临床准确判断肿瘤范围，实现最大程度安全切除，改善患者预后。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制作及分组

       本实验已获得潍坊医学院伦理委员会的批准，批准文号：2019SDL092。

       将32只雌性Wistar大鼠（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，220～250 g）随机分成4组，每组8只大鼠（6只实验组、2只对照组）。水合氯醛（购自上海麦克林生化科技有限公司，4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后固定于立体定位仪。备皮，常规消毒，沿大鼠双侧内眦连线的中点向后方切一长度约1 cm的纵行切口，逐层分离头皮软组织并使得顶骨充分暴露。中线位置向右旁开3 mm，冠状缝后1 mm为进针点，钻孔，深达硬脑膜，但不刺破硬脑膜。实验组大鼠用微量进样器（10 µL）缓慢注射C6细胞悬液（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）10 µL建立大鼠胶质瘤模型，对照组在相同位置注射相同剂量不含胶质瘤细胞的完全培养基。

1.2 磁共振扫描

       14 d后采用配有大鼠专用线圈的7.0 T动物磁共振仪（Bruker BioSpin MRI GmbH 7.0 T，德国）对实验组及对照组进行磁共振检查。常规成像序列包括轴位T1WI、T2WI及矢状位、冠状位T2WI平扫，功能成像序列包括DWI、MRS、ASL扫描。轴位T1WI扫描参数：TR 4420 ms，TE 4.3 ms，层厚0.8 mm，层数4，层间距0.3 mm，矩阵256×256，FOV 30 mm×30 mm；轴位T2WI扫描参数：TR 3000 ms，TE 33 ms，层厚0.8 mm，层数2，层间距0.3 mm，矩阵256×256，FOV 30 mm×30 mm；矢状位及冠状位T2WI扫描参数：TR 2500 ms，TE 33 ms，层厚0.8 mm，层数2，层间距0 mm，矩阵256×256，FOV 30 mm×30 mm；DWI序列扫描参数：TR 2500 ms，TE 33 ms，层厚0.8 mm，层数4，层间距0.3 mm，矩阵128×128，FOV 30 mm×30 mm；MRS序列扫描参数：TR 2000 ms，TE 35 ms，层数256，体素大小2 mm×2 mm×2 mm；ASL序列扫描参数：TR 11203 ms，TE 25 ms，层厚0.8 mm，层数1，层间距0.3 mm，矩阵128×96，FOV 30 mm×30 mm。

1.3 组织学检查

       实验组及对照组行磁共振检查后立即处死大鼠，灌注取脑，并进行HE染色及免疫组化染色，统计VEGF、Ki-67阳性率，计算CD105-MVD值。

1.4 图像分析及数据测量

       MRI扫描图像由2位具有5年以上工作经验的影像医师进行观察分析，意见出现分歧时讨论达成一致。根据HE染色结果，确定肿瘤中心区、瘤周浸润区，确定MR图像上各区域的相应位置（与病理结果作对比），分析各个序列上各区域相关参数的结果。采用系统自带的Paravision软件进行DWI、MRS及ASL后处理及数据测量，分别测量肿瘤中心区、瘤周浸润区、对照组相同部位表观弥散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）值，同时测量脑脊液ADC值，计算得出相对表观弥散系数（relative apparent diffusion coefficient, rADC）数值；计算胆碱（choline, Cho）/氮-乙酰天冬氨酸（N-acetyl-aspartate, NAA）值及测量局部脑血流量（cerebral blood flow, CBF）。

1.5 统计学方法

       结果用均数±标准差（x¯±s）表示。采用SPSS 20.0软件对结果进行统计学分析。rADC值、CBF值、Cho/NAA值以及Ki-67、VEGF的阳性表达率及CD105-MVD采用独立样本t检验；利用Pearson相关分析法统计分析影像学结果及相关病理学指标的相关性。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRI结果

       Wistar大鼠右侧尾状核区见团块状混杂长T2信号（图1A、1B、1C）；ASL序列示局部灌注增加（图1D）；DWI序列示病灶大部分弥散受限（图1E）。绘制感兴趣区进行颅脑血流量测量，结果显示肿瘤中心区血流＞肿瘤浸润区＞对照组，坏死区域血流灌注减低。MRS基线稳定，实验组肿瘤区NAA峰下降，Cho峰、乳酸（lactic acid, Lac）峰及脂质（lipid, Lip）峰不同程度升高（图1F），Cho/NAA比值倒置。胶质瘤不同区域影像学结果详见表1。

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图1  Wistar大鼠胶质瘤MR图像。1A～1C：冠状位、矢状位及轴位T2WI显示右侧基底节区见不均质团块状病变，内可见坏死，右侧侧脑室呈轻度受压；1D：ASL示局部异常高灌注；1E：DWI呈低信号；1F：MRS序列，Cho峰（3.2 ppm）升高，NAA峰（2.0 ppm）降低并且伴随宽大Lip峰和Lac峰。ASL：动脉自旋标记；DWI：弥散加权成像；MRS：磁共振波谱；Cho：胆碱；NAA：氮-乙酰天冬氨酸；Lip：脂质；Lac：乳酸脂质。
Fig. 1  MR images of brain glioma in Wistar rat. 1A-1C: Coronal T2WI, sagittal T2WI and axial T2WI demonstrate heterogeneous mass centered in the right basal ganglia region with necrosis inside, the right lateral ventricle is slightly compressed; 1D: ASL shows local abnormal high perfusion; 1E: DWI shows low signal; 1F: MRS, there is elevated choline (resonates at 3.2 ppm) with decreased NAA (resonates at 2.0 ppm), and with wide irregular Lip and Lac peaks. ASL: arterial spin labeling; DWI: diffusion weighted imaging; MRS: magnetic resonance spectrum; Cho: choline; NAA: N-acetyl-aspartate; Lip: lipid; Lac: lactic acid.

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表1  大鼠胶质瘤不同区域影像学结果
Tab. 1  Imaging results in different regions of glioma in rat

2.2 免疫组织化学结果

       肿瘤中心区Ki-67阳性率＞瘤周浸润区＞对照组，其在肿瘤中心区与瘤周浸润区、对照组与瘤周中心区、肿瘤浸润区的表达差异均有统计学意义（P＜0.001）；VEGF阳性率在肿瘤中心区数值最高，瘤周浸润区次之，对照组存在少量表达，三者组间两两比较差异具有统计学意义（P＜0.001）；中心区CD105-MVD高于肿瘤浸润区，二者差异具有统计学意义（P＜0.001）。各区域病理学结果详见表2。

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表2  大鼠胶质瘤各区域病理学指标阳性表达情况
Tab. 2  The positive expression of pathological indicators in different regions of glioma in rat

2.3 MR结果与相应病理指标相关性分析

       肿瘤中心区、浸润区rADC值与相应区域Ki-67数值均呈负相关；胶质瘤中心区Cho/NAA数值与相应区域Ki-67阳性率呈正相关，肿瘤中心区、浸润区CBF与相应区域VEGF阳性率及CD105-MVD呈明显正相关。MR结果与相应病理指标相关性详见表3。

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表3  MR结果与相应病理指标相关性（n=24）
Tab. 3  Correlation between MR results and pathological indicators (n=24)

3 讨论

       本研究利用Wistar大鼠胶质瘤模型，运用7 T动物专用MRI，并结合相关病理学指标，深入探讨了胶质瘤及瘤周浸润区的病理学及分子基础。既往已有部分研究报道了大鼠脑胶质瘤的常规MRI及功能MRI特点，但大鼠胶质瘤模型7 T动物专用高场强MRI检查少有报道，此外，大部分研究仅讨论大鼠脑胶质瘤影像表现^[9]，未深入讨论其分子生物学行为。而本研究在7 T动物专用MRI基础上，行常规MRI检查的同时，还补充了DWI、ASL及MRS等功能成像，测量ADC值、CBF值，记录Cho峰、NAA峰等，利用高分辨率图像从多方面观察、探索脑胶质瘤的周边浸润情况。此外，研究中还结合了相关病理学指标，并将其与影像学结果进行相关性分析，进一步探讨了胶质瘤及瘤周浸润区的病理学及分子基础，为临床进行肿瘤范围的评估、手术切除提供一定依据。

3.1 大鼠胶质瘤瘤周浸润区多模态MRI表现

       本研究测量肿瘤中心区、瘤周浸润区及脑脊液ADC值，计算rADC值，并进行统计分析。研究结果显示，肿瘤中心区rADC＜浸润区＜对照组，笔者分析，由于中心区肿瘤细胞密集、间隙小，因此水分子运动减慢，rADC值减小；而瘤周浸润区肿瘤细胞生长相对稀疏，细胞间隙大，因此rADC值升高。目前研究认为，DWI通过测量水分子微观弥散运动反映活体组织内部信息^[10]，因此测量肿瘤实体ADC值，能够了解目标区域水分子的运动情况，从而间接反映肿瘤的生物学特性、细胞形态结构以及功能等。本研究通过比较肿瘤中心区、瘤周浸润区及对照组rADC值，提示浸润区也有一定数目的肿瘤细胞生长，细胞间隙相对正常组织有所减小。此外，SUI等^[11]研究显示，ADC值能够较好区分术区正常脑组织、残留肿瘤以及邻近脑膜和硬膜下强化，这对于确定肿瘤残存部分的位置、大小和形态及准确划定放疗靶区具有一定价值。

       MRS能够提示病变组织构成，既往众多研究用其反映肿瘤细胞的活性及代谢状态^[12]。也有研究认为，MRS对于胶质瘤分级也有较高准确性，其中，高级别胶质瘤Cho/NAA、Cho/肌酸（creatine, Cr）高于低级别胶质瘤，而NAA/Cr则相反^[13]。本研究中，实验组NAA波峰下面积较对照组明显降低，而Cho峰下面积明显增大，Cho/NAA数值倒置。提示胶质瘤细胞大量增殖，细胞膜合成加快，神经元破坏。本研究还发现，MRS中Lip峰及Lac峰也存在不同程度升高，考虑是由于肿瘤内部发生坏死，大分子崩解，导致Lip峰及Lac峰释放。此外，胶质瘤的存在使得正常有氧代谢无法正常进行，因此常在1.3 ppm处出现异常的Lac峰。

       ASL是一种可重复、低成本、非侵入性的MR技术，是评价颅脑肿瘤血流灌注的方法之一^[14]，在一定程度上对于判断肿瘤血管产生、肿瘤生物学行为有着重要价值。本研究表明肿瘤中心区CBF＞浸润区＞对照组，推测是胶质瘤引起颅脑自我调节功能紊乱，局部血液循环增加，导致高灌注的结果^[11]。而在肿瘤实体的周边区域，可能同样也存在异常增殖的新生血管，从而表现为稍高灌注。此外，ATA等^[15]研究表明，ASL对于良恶性肿瘤的诊断、鉴别诊断以及肿瘤的分级有着重要价值。

3.2 大鼠胶质瘤瘤周浸润区病理组织学特点

       Ki-67能够较好评估恶性肿瘤细胞的增殖活性^{[16, 17]}，在增殖标志物当中应用广泛。正常脑组织中，Ki-67不表达或阳性表达率极低，但在恶性肿瘤中，其表达明显升高。本研究表明肿瘤中心区Ki-67阳性表达率＞浸润区＞对照组，提示肿瘤实体细胞密度大，而在瘤周浸润区，同样存在一定数量的肿瘤细胞，这与TEJADA等^[18]和WANG等^[19]的研究一致。此外，XU等^[20]研究显示，Ki-67的表达对于胶质瘤分级、患者的生存率的预测也具有一定价值。

       VEGF是诱导胶质瘤血管生成最为关键的调控因素^[21]。通常情况下，正常脑组织不表达VEGF，发生脑胶质瘤时其表达相应增高。VEGF表达区域与经典血管芽生分布大致相同。在本研究中，肿瘤中心区见大量VEGF染色的棕黄色颗粒，而瘤周浸润区VEGF阳性细胞数目明显少于中心区，提示瘤周浸润区虽然较中心区肿瘤细胞少，恶性生物学行为相对较轻，但是该区域的肿瘤细胞同样能够产生多种促血管生成因子促进血管增生和发展，这也与SEYEDMIRZAEI等^[22]和AWASTHI等^[23]的研究相符。此外，VEGF不仅能显著促进胶质瘤的血管生成，其阳性表达率甚至还与胶质瘤的临床分级、患者预后等均存在一定的相关性^{[22, 23]}。

       CD105高度表达于异常增殖血管内皮细胞^[24]，被认为是血管生成的一个强有力的标记物，其特异性优于CD31、CD34等^[25]。在胶质瘤中，CD105阳性标记的异常增殖微血管常常提示具有恶性潜质，这些微血管结构不成熟，形态不规则且壁薄、基底膜部分缺乏，具有较高的通透性，与胶质瘤的浸润生长相关^{[26, 27]}。本研究利用CD105对胶质瘤血管进行标记，特异性地反映瘤周浸润区微血管的增殖情况，结果表明肿瘤浸润区的新生血管数量少于肿瘤中心区。此外，不同级别胶质瘤的CD105阳性表达有差异，肿瘤级别越高，CD105阳性率也相应增高，并且不同肿瘤的临床分期相关CD105-MVD数据统计有显著性差别，即肿瘤临床分期增加，CD105-MVD也相应增高^{[28, 29]}。

3.3 大鼠胶质瘤瘤周浸润区多模态MRI表现及其病理学相关性

       本研究结果表明，Ki-67数值与相应区域肿瘤中心区、浸润区rADC值均具有相关性，且相关指数为负数，胶质瘤细胞生长越密实，Ki-67指数越高，而ADC值相应减小，这与KANG等^[30]的实验结果一致。因此，通过测量ADC值可判断细胞的生长情况、密集程度。但由于胶质瘤生长不均质，可能会导致ADC值测量结果的偏差，从而使得肿瘤级别、瘤周浸润区范围的大小等被低估或者高估。由于高级别胶质瘤易液化坏死，当肿瘤内部发生肉眼不能分辨的小灶性坏死时，影像学上则表现为ADC值的升高^[31]。所以，将ADC值与细胞增殖指标Ki-67指数相结合能够更加准确判断浸润区胶质瘤细胞增殖情况，对于临床拟定诊疗计划、评估预后提供更加稳定、准确的依据。此外，PARK等^[32]在一项纳入49例异柠檬酸脱氢酶野生型胶质瘤患者的研究中，对脑胶质瘤的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）等基因类型做了进一步探究，结果表明ADC值与EGFR扩增有关，且EGFR未扩增的肿瘤组织ADC值较高。

       本研究结果还表明，胶质瘤中心区的Cho/NAA与相应区域Ki-67阳性率呈正相关。当胶质瘤细胞大量增殖时，神经元被破坏、功能受损，NAA值降低，肿瘤细胞增殖引起细胞膜合成加快，Cho峰升高，相应的组织学结果则表现为Ki-67阳性率明显升高。因此，将Cho/NAA数值与Ki-67阳性率结合可提高胶质瘤诊断的准确性。ASL能够定量反映肿瘤微循环的灌注情况，且在一定程度上显示传统MRI无法检测的血流及新生血管。本研究将CBF结果与相应区域的血管内皮标志物阳性表达结果进行相关性分析，结果表明浸润区的CBF与CD105-MVD呈显著正相关。

3.4 本研究的局限性

       本研究的局限性有以下两点：（1）本研究样本量较少，结果存在一定的误差，有待扩大样本量做进一步研究；（2）对于MRS图像，ROI选取在操作过程中虽尽量避开坏死区，但部分病例无法完全避免内部的少量坏死，因此结果可能存在少许误差。

4 结论

       综上所述，多模态MRI能够反映大鼠胶质瘤瘤周浸润区的血液动力学、代谢等信息，其与病理学指标具有良好的相关性，有助于识别胶质瘤的瘤体及瘤周浸润区，为临床开展基于MRI的术前评估、诊疗方案制订及预后评估提供准确、有效的手段和理论依据，有益于临床个体化治疗。