0 前言

       睡眠剥夺（sleep deprivation, SD）是指由于各种原因导致的睡眠缺失，并引起一系列生理、心理及行为的变化，主要表现为微睡眠次数增多、注意力不集中、反应时间延长及工作效率降低等^{[1, 2]}。在行为认知方面，SD主要对工作记忆、设计决策、运动控制及注意力等产生不利影响，其中以持续注意力受损最严重^{[3, 4, 5]}。随着经济社会的快速发展，长期SD成为部分工作者的常态化工作模式，由此所带来的一系列问题已发展为现代社会不容忽视的公共卫生问题^[6]。基于SD对人体健康造成的诸多影响，有研究提出将长期SD定义为一种典型的亚健康状态，因此探讨SD对人体的影响机制以及相应的干预治疗措施具有重要的临床意义^[7]。近年来，随着神经影像学技术的快速发展，功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）已被广泛用于研究SD引起的注意力受损机制。既往fMRI研究发现，SD后左侧顶叶上回、右侧额下回、左侧中央旁小叶、双侧额中回及右侧补充运动区等脑区的激活程度较正常睡眠后显著降低^{[8, 9, 10]}。然而，以往的SD研究大多只采集正常睡眠后以及SD后两个时间点的数据来探索SD对认知的影响，很少关注在SD过程中，随着睡眠压力的增加以及节律觉醒信号的变化，大脑自发性活动及行为认知表现的逐步变化过程。作为一种反映神经元的活动强度的指标，百分比振幅（percent ampliltude of fluctuation, perAF）从能量角度衡量静息态大脑自发活动水平的高低^[11]。与传统的低频振幅方法及比率低频振幅方法相比，perAF具有更高的敏感性和特异性，因此在中枢神经系统相关疾病的研究中得到广泛应用^[12]。在此背景下，本研究采用重复磁共振扫描方法，应用perAF脑功能指标，观察在一晚上的SD过程中大脑自发活动及睡意水平的动态变化过程。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本试验主要以微信朋友圈方式在西安市各大中高院校招募在校本科生及研究生志愿者参与。试验纳入标准：（1）右利手；（2）18～30岁；（3）智力水平正常；（4）无磁共振扫描禁忌。排除标准：（1）酒精或药物滥用史；（2）存在神经系统或精神疾病；（3）睡眠障碍者；（4）极端“清晨型”或者极端“夜晚型”。这里要求被试填写在工作日以及休息日的睡眠时间和起床时间，然后依据《慕尼黑大学睡眠类型测量表》将被试分为严重早起型、中度早起型、轻度早起型、中间型、轻度晚起型、中度晚起型和严重晚起型，进而确定极端“清晨型”与极端“夜晚型”。本研究共招募到符合试验条件的健康志愿者54例，男29例，女25例，年龄（22.46±1.81）岁。试验开始前每名参与者均被告知本研究的目的和意义，并签署知情同意书。所有受试者均被告知在磁共振扫描前1周禁止摄取含有咖啡因或酒精的刺激性饮料。此外，所有受试者的匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI）测验得分均小于5分，表明睡眠质量良好。本研究依据《赫尔辛基宣言》进行，获得空军军医大学第一附属医院临床试验伦理委员会批准（批件号：KY20183005-1号）。

1.2 研究设计

       所有参与者在试验过程中总共被要求到访实验室两次。在试验正式开始前的一周，志愿者首次到访实验室。期间，试验人员向志愿者简要介绍试验方案，征得志愿者同意后签署知情同意书，然后向每个志愿者提供腕表（Philips Respironics, Mini Mitter）。在接下来的一周内，志愿者被要求每天保持正常的睡眠习惯，并通过腕表记录他们的睡眠模式。志愿者第二次到访实验室进入正式试验，他们被要求不迟于下午6点到实验室报到。在接下来的试验过程中，他们被允许阅读、看电视和上网，但不能进行剧烈活动，亦不能离开试验室，同时由两名试验人员共同监视避免参与者入睡。由晚上10时至早上6时，每隔2 h（t1=22时，t2=24时，t3=2时，t4=4时，t5=6时）志愿者进行一次磁共振扫描，收集静息态fMRI数据，每个人总共进行5次扫描。磁共振扫描期间同时采集心率和呼吸频率，确保参与者在此过程中没有睡着。每次扫描结束后，志愿者被要求完成斯坦福嗜睡量表（Stanford Sleepiness Scale, SSS），从7个最能描述他们当前警觉状态的陈述中选择一个。

1.3 磁共振数据采集

       本试验使用GE Discovery MR750 3.0 T超导型磁共振扫描仪及8通道头线圈采集数据。在扫描过程中，使用橡胶垫与专用耳塞来固定被试头部和降低噪音。扫描过程中参与者被要求全程保持睁眼状态。扫描完成后，操作者需要询问参与者在扫描过程中是否保持清醒。静息态fMRI扫描参数如下：采用单次激励自旋平面回波成像序列，轴位扫描，扫描角度与前后联合连线平行，TE 30 ms，TR 2000 ms，层厚3.0 mm，层数36，连续扫描无间隔，FOV 240 mm×240 mm，翻转角 90°，矩阵128×128，扫描的总采集时间为7 min，共采集210幅图像。由三位高年资放射科主治医师依据临床常规T2WI、T2液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery, FLAIR）序列与扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）序列评估MRI图像质量，以确保所有研究对象无器质性病变。

1.4 图像预处理

       基于Matlab 2016b平台，使用脑成像数据处理与分析工具箱（DPABI,http://rfmri.org/DPABI）和统计参数图（SPM 12,http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）对fMRI数据进行预处理。预处理步骤主要包括：（1）将原始DICOM数据格式转换为可分析的NIFTI格式；（2）移除每个受试前10个时间点的fMRI数据；（3）通过时间层校正消除因采集时间不同导致的层间信号差异；（4）头动校正，将数据采集过程中平移超过3 mm和（或）旋转大于3°的受试排除；（5）空间标准化，将个体空间的fMRI图像配准到蒙特利尔标准模板空间并将配准后的图像重采样成3 mm×3 mm×3 mm；（6）使用一般线性模型，将白质、脑脊液和Friston 24个头部运动参数作为协变量进行回归分析；（7）使用频域带通滤波（0.01～0.10 Hz）与去线性漂移降低无关噪声信号对真实信号的干扰；（8）应用6 mm×6 mm×6 mm半高全宽的高斯核滤波器对上述步骤处理后的图像进行平滑处理。在数据预处理基础之上，利用RESTplus V1.4（http:/www.restfmri.net）工具计算perAF值，具体过程为：首先通过计算每个体素的时间信号强度相对于该体素平均信号强度的波动幅度百分比获取每个体素的perAF值；然后将每个体素的perAF值除以全脑所有体素perAF值的平均值进行均一化处理获得每个体素对应的标准化perAF值。

1.5 统计学处理

       使用IBM SPSS Version 24.0软件对人口学数据进行统计分析。由于本试验为多时间点纵向研究，因此采用单因素重复测量方差分析比较多时间点间SSS值的差异，事后分析被用来分析任何两个时间点间SSS的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。对呈正态分布的计量资料以均数±标准差表示。利用统计参数图软件SPM 12对多时间点的全脑perAF值进行统计学分析。首先，应用SPM 12软件中因子设计模块的单因素重复测量方差分析基于默认的大脑灰质模板比较多时间点间perAF值存在差异的脑区，使用FDR方法进行多重比较校正。然后，提取每个时间点差异脑区的perAF值进行事后分析。使用Pearson相关分析对差异脑区的perAF值与SSS值进行相关性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学结果

       本试验最终有36名志愿者完成SD试验。腕表数据显示，所有志愿者都有良好的睡眠习惯，过去一周内入睡时间为22:29±0:17，起床时间为6:27±0:11，整晚睡眠时间为（7.3±1.5）h。对SSS的单因素重复测量方差分析结果显示存在显著的时间主效应，即在t1-5 5个时间点中至少有两个时间点的SSS数据存在显著性差异（F4,140=44.5，P＜0.001），见图1。事后分析表明，t1与t2-5的SSS、t2与t1和t4-5的SSS、t3与t1和t4-5的SSS、t4与t1-3的SSS、t5与t1-3的SSS均存在显著性差异，见图1。

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图1  五个时间点的斯坦福嗜睡量表分数单因素重复测量方差分析结果。△代表所标记时间点与t1时间点存在显著差异，+代表所标记时间点与t2时间点存在显著差异，^代表所标记时间点与t3时间点存在显著差异，○代表所标记时间点与t4时间点存在显著差异，□代表所标记时间点与t5时间点存在显著差异。
Fig. 1  Results of one-way repeated measures ANOVA for SSS scores at five time points. △ represents that the marked time point is significantly different from the t1 time point, + represents that the marked time point is significantly different from the t2 time point, ^ represents that the marked time point is significantly different from the t3 time point, ○ represents that the marked time point is significantly different from the t4 time point, □ represents that the marked time point is significantly different from the t5 time point.

2.2 SD过程中perAF动态变化的活动模式

       使用单因素重复测量方差分析比较SD过程中全脑各个脑区自发性活动的变化，结果显示，双侧丘脑、右侧中央前回、右侧顶上小叶、左内侧前额叶及右侧颞上回的perAF值存在显著的时间主效应，即上述脑区的perAF值在t1至t5 五个时间点差异具有统计学意义（F4,140＞31.7，P＜0.01，FDR校正），见图2。其中，对于左内侧前额叶，t5与t1-4、t4与t1-2、t3与t1-2、t1与t2的perAF值均存在显著性差异；对于右侧顶上小叶，t5与t1-3、t4与t1-3、t2与t3的perAF值均存在显著性差异（P＜0.05）；对于左侧丘脑，t5与t1-4、t4与t1-2、t3与t1的perAF值均存在显著性差异（P＜0.05）；对于右侧额上回，t5与t1-4、t4与t1-2、t3与t1-2、t1与t2的perAF值均存在显著性差异（P＜0.05）；对于右侧中央前回，t5与t1-4、t4与t1-2、t1与t2的perAF值均存在显著性差异（P＜0.05）；t5与t1-3、t4与t1-3、t3与t1、t1与t2的perAF值均存在显著性差异（P＜0.05），见图3。

       为了排除个体差异影响，基于每个时间点SSS分值的高低将所有被试分为高SSS分值组与低SSS分值组，在每个时间点对两组被试的大脑活动进行统计分析，经FDR校正后未发现显著性差异脑区。此外，未发现t1至t5时间点磁共振扫描期间心率和呼吸频率的差异具有统计学意义，见表1。

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图2  全脑百分比振幅值的单因素重复测量方差分析结果。
Fig. 2  Results of one-way repeated measures ANOVA for whole brain percent ampliltude of fluctuation, values.

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图3  单因素重复测量方差分析差异脑区各个时间点（t1～t5分别为22时、24时、2时、4时、6时）的百分比振幅值柱状图。3A～3F分别表示左内侧前额叶、右侧顶上小叶、左侧丘脑、右侧颞上回、右侧中央前回、右侧丘脑。
Fig. 3  Bar graph of percent ampliltude of fluctuation values of different brain regions at each time point (t1-t5 are 22:00 pm，24:00 pm, 02:00 am, 04:00 am, and 06: 00 am respectively) by one-way repeated measures ANOVA. 3A-3F show the left medial prefrontal lobe, right parietal lobule, left thalamus, right superior temporal gyrus, right precentral gyrus, and right thalamus, respectively.

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表1  磁共振扫描期间心率和呼吸频率信息
Tab. 1  Information of heart rate and respiratory rate during MRI scan

2.3 个体嗜睡程度与差异脑区perAF的相关性分析

       为了考察SD过程中个体嗜睡程度的变化对大脑自发活动的影响，采用Pearson相关分析方法评估个体睡意水平与上述差异脑区perAF值的相关性。结果表明，在t1与t5时间点右侧颞上回及左内侧前额叶的perAF值与SSS分数呈显著正相关。未发现其他时间点双侧丘脑、右侧中央前回及右侧顶上小叶的perAF值与SSS分数显著相关，见图4。

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图4  右侧颞上回及左内侧前额叶的perAF值与斯坦福嗜睡量表分数的相关性。4A～4D分别表示右侧颞上回t1时间点、右侧颞上回t5时间点、左内侧前额叶t1时间点及左内侧前额叶t5时间点。perAF：百分比振幅；t1、t5分别为22时、6时。
Fig. 4  Correlation between perAF values in right superior temporal gyrus and left medial prefrontal lobe and Stanford Sleepiness Scale scores. 4A-4D represent t1 of the right superior temporal gyrus, t5 of the right superior temporal gyrus, t1 of the left medial prefrontal lobe and t5 of the left medial prefrontal lobe, respectively. PerAF: percent ampliltude of fluctuation; t1, t5 are 22:00 pm and 06:00 am respectively.

3 讨论

       本研究借助perAF脑功能指标，在SD过程中采用五个时间点（22时、24时、2时、4时、6时）来动态观察大脑自发性活动及行为认知表现的变化过程。相较于以往SD前后的对比研究，本研究采用的多时间点动态研究方法，不仅可以观察到SD对大脑功能的影响，还可以观察到随着睡眠压力和节律信号的改变大脑活动的动态变化。本研究结果显示，在SD过程中，双侧丘脑、右侧中央前回、右侧顶上小叶、左内侧前额叶及右侧颞上回的perAF值存在显著的差异，且差异脑区的perAF值呈递增改变。同时发现，右侧颞上回及左内侧前额叶的perAF值与个体的嗜睡程度显著相关。这些异常活动脑区的发现可能为后续临床干预治疗（如重复经颅磁刺激中靶点的确定）提供一定的辅助。

3.1 SD过程中额顶网络与默认网络的异常活动

       在SD期间，内侧前额叶及颞上回的自发性活动持续性增高，表明内侧前额叶与颞上回在此过程中对睡意的形成发挥着重要作用。内侧前额叶及颞上回被认为是默认网络的核心脑区，是涉及多种行为认知活动与生理活动的重要区域，与机体清醒、注意导向、自我认知及情景记忆的维持等功能密切相关^{[13, 14, 15]}。既往使用独立成分分析和基于种子点相关分析的研究也发现默认网络内部及默认网络与其他大脑网络之间异常的功能耦合^{[16, 17]}。我们之前的研究发现，在精神运动警觉性任务的反应时最慢事件中默认网络的激活程度呈线性增加，表明默认网络活动的增强可能导致机体注意力不集中并出现走神行为^{[18, 19]}。多项神经影像学研究发现SD后额顶网络的功能活动较正常睡眠后发生异常改变。例如，DRUMMOND等^[20]发现SD后前额叶皮层、顶叶和前运动皮层的激活程度明显降低。一项正电子发射断层显像（positron emission tomography, PET）研究也发现SD后个体前额叶皮层、顶叶区域及丘脑等区域的葡萄糖代谢水平明显下降且与认知表现显著相关^[21]。考虑到中央前回及顶上小叶是额顶注意力网络的重要组成部分，本研究中其活动的增加可能反映了SD期间机体应对注意力下降的一种代偿^[22]。

3.2 SD过程中丘脑的异常活动

       丘脑在中枢神经系统主要负责控制从脑干处上行的觉醒信号的传输，是维持机体觉醒状态的重要脑区^{[23, 24, 25]}。丘脑在睡眠和觉醒控制等意识维持方面的重要性已经被来自生理学、药理学和遗传学的多项研究所证实^[26]。根据“不稳定状态”理论，丘脑是SD影响认知功能的重要节点，SD会导致丘脑的活动变得不稳定，当丘脑活动增强时，脑干上行觉醒信号能正常传输到默认网络与注意网络，用于维持两者正常的拮抗关系；当丘脑的激活降低时，觉醒信号会在丘脑处被拦截无法上传，导致默认网络与注意网络两者间的拮抗关系陷入混乱^{[27, 28, 29, 30, 31]}。本研究发现，在SD期间丘脑的活动性持续增强，这可能是机体为了弥补SD带来的损伤而产生代偿性改变，以帮助个体维持正常的行为表现，也进一步表明丘脑作为SD过程中机体维持清醒状态的重要性。

3.3 当前研究的局限性

       首先，试验被试主要来自本地高校大学生，年龄以19～26岁为主，不能很好地代表广大人群；其次，虽然磁共振扫描期间同时采集心率和呼吸频率，以证实参与者在此过程中没有睡着，但不能百分之百保证没有出现微睡眠或短暂的睡眠状态，后续的试验中可以使用磁共振兼容的脑电设备精准监测参与者的睡眠状态；最后，机体的睡眠状态受多种因素的影响，如个体年龄、性别、作息方式、身体素质、心理状态及周围环境等，因此本研究结果的稳定性尚需要后续多中心大样本数据的再次验证与补充。

4 结论

       综上所述，本研究使用perAF的方法发现在SD过程中个体默认网络与额顶网络部分脑区以及丘脑功能活动逐渐增强，并且其中右侧颞上回与左内侧前额叶的功能活动与机体嗜睡程度存在显著正相关。这些发现表明上述脑区的异常活动可能是SD过程中个体嗜睡程度增加与注意力下降的重要神经机制，同时也可能为后续SD的干预治疗提供临床辅助。