0 前言

       脑组织间液（interstitial fluid, ISF）是存在于脑细胞外间隙（extracellular space, ECS）中的液体，脑ECS是存在于脑内细胞之间及细胞与血管之间的宽度约38～64 nm的不规则缝隙。脑ISF及其所在的ECS为神经细胞工作及生存提供了基本条件，构成了脑内重要的微环境，是脑内废物清除的重要途径，也是药物入脑后发挥作用的重要场所^[1]。ISF引流及物质转运的改变与阿尔茨海默病^[2]、帕金森病^[3]等脑病以及航天^[4]、发育认知^[5]等领域密切相关。大量研究表明，ECS内ISF流动和物质转运受到多种因素调控，如脑内动脉搏动^[6]、水通道蛋白4（aquaporin-4, AQP4）表达水平^[7]、睡眠^[8]等。其中，动脉搏动是ISF对流的主要动力之一，相位对比MRI研究表明，增强的颅内动脉搏动会促进对比剂分子在ECS内的转运^[9]。

       丘脑是重要的感觉传导中转站，也是脑卒中好发部位之一，因此研究丘脑ISF主动调控技术具有重要临床意义。硬膜外动脉贴敷术（epidural arterial implantation, EAI）是指将颞浅动脉游离出来后贴敷于硬脑膜表面，通过颞浅动脉的搏动对ISF进行调控。前期研究表明，EAI技术可以促进同侧尾状核区内ISF流动，尾状核区迂曲度下降，ECS内分子扩散增强，这可能与尾状核内ISF流向皮层密切相关^[10]。丘脑与尾状核紧密相邻，但两者ISF流动路径并不相同^[11]。丘脑区胞外分子无法跨越丘脑与尾状核之间的屏障结构，直接引流进入脑室和蛛网膜下腔^[12]。因此，EAI对丘脑内ISF的引流作用及其潜在机制目前尚未可知。笔者将通过研究EAI对丘脑区ISF引流作用及机制，建立该脑区ISF的主动调控手段，为治疗脑病开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

       本研究一共采用30只240～280 g雄性SD（Sprague Dawley）大鼠[于北京大学医学部动物房购入，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0013]，将大鼠分为空白对照组（control组）、EAI组（术后7 d、14 d分别为EAI7、EAI14组）、EAI对侧测量组（术后7 d、14 d分别为EAI7-C、EAI14-C组），共5组，每组均为6只。每组均进行磁示踪实验；control组、EAI14组检测顶叶局部脑血流量（regional cerebral blood flow, rCBF），control组、EAI7、EAI14每组进行旷场实验和新物体识别实验。饲养环境要求：清洁级，环境温度（22±1）℃，环境湿度60%±5%，正常喂养，饲养于12 h光/暗周期下。该研究由北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准，批准文号：LA2021507。

1.2 建立EAI大鼠模型

       EAI手术过程中大鼠全程使用异氟烷（恒丰强生物技术有限公司，中国）气麻，先使用4.5%诱导麻醉3 min，后改为2.0%维持麻醉，将大鼠右眼至右耳间的毛发用刀片刮净，用碘伏消毒手术区，在显微镜下用显微手术镊和显微手术剪将颞浅动脉分离出来，在右侧顶骨处开0.6 cm×0.4 cm椭圆形颅窗，暴露硬脑膜，将游离出来的颞浅动脉贴敷于硬膜上，最后还纳骨瓣，缝合伤口，并用碘伏消毒。

1.3 磁示踪实验

       将大鼠用复合麻药（戊巴比妥钠和水合氯醛混合）腹腔麻醉后（60 mg/kg），保证大鼠在实验过程中保持深度麻醉状态（翻正反射消失、痛觉刺激无反应），后期以20 mg/kg/h剂量维持麻醉状态，并根据实际情况追加。利用大鼠生理检测仪器（SA Instrument，美国）定期检测大鼠状态，直肠温度计（欧姆龙有限公司，中国）测量大鼠温度。扫描间隔期间将大鼠置于电热毯维持体温（39±0.5）℃。用德国3.0 T Siemens Magnetom trio MRI进行预扫描，配套腕关节线圈，采用T1快速采集梯度回波序列，具体扫描参数如下：反转时间900 ms、重复时间1500 ms、回波时间3.7 ms、回波间距8.8 ms、翻转角9°、矩阵512×512、体素0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm、带宽300 Hz/Px、激发次数2、扫描时间290 s、相位编码步数96。由大鼠两眼之间正中用手术刀切开，剥离软组织，暴露颅骨，使用立体定位仪（Stoeling公司，美国）标记丘脑区，control组以及EAI组的坐标为：前囟点后3 mm、右3 mm、深6 mm，EAI对侧测量组坐标为：前囟点后3 mm、左3 mm、深6 mm，注入2 μL的10 mmol/L示踪探针（Bayer Schering Pharma AG，德国），用颅骨钻在标记处钻孔，使微量注射针（Hamilton公司，美国）穿刺进入实质内，在目标位置将示踪探针注入，给药速率为0.2 μL/min。待注射完毕之后，停针10 min，缓慢拔针5 min，防止示踪探针返流。以示踪探针注射完毕开始计时，在注射示踪探针前及注射后第15、30、45、60、90、120、150、180、240 min进行MRI扫描，或者观察探针分子在图像上信号消失时停止扫描。室温低于20℃时采用加热毯对大鼠进行保温，使大鼠体温保持在（39±0.5）℃。

       收集所有时刻点图像，应用自主研发的纳德脑ECS测量分析系统2.1（纳德公司，中国）对图像进行分析，利用工作站动态测量得到ECS结构参数及其ISF引流参数：扩散速率D^*、迂曲度λ、容积占比α、半衰期T1/2，具体建模计算过程参考^{[13, 14, 15, 16]}。

       获取DECS-mapping和三维可视化图：将目前获取的核磁图像进行计算转换后显示，按照示踪剂的分布范围及扩散速率形成二维及三维的图像。同时利用自主研发的脑ECS图像处理系统，完成示踪剂在大鼠丘脑的扩散速率的测定，并采用光线投射法对感兴趣区域提取后的MR图像进行体绘制，实现三维可视化。

1.4 顶叶皮层局部脑血流测量

       将大鼠腹腔麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上，做一正中切口，暴露颅骨，用电钻在前囟后3 mm、右侧3 mm处钻孔，暴露硬脑膜。将激光多普勒血流仪（Moor Instruments，英国）探头垂直至于硬脑膜上，保持探头不动，得到较稳定的rCBF信号。记录1 min脑血流量，取其平均值做数据分析。

1.5 行为学实验

       旷场实验：该实验所用旷场试验箱尺寸为100 cm×100 cm×40 cm，周壁颜色为黑色，正上方驾摄像头，视野覆盖整个旷场。实验开始时，将大鼠放置在正中央格，同时进行摄像和计时，计时为5 min。实验室保持安静，室温为20℃左右，选用弱光照明。两次试验间用酒精擦拭试验箱内壁及底面，以免上次大鼠余留信息影响下次实验结果。将箱底分为16格，通过Visu Track动物行为分析软件（上海欣软信息科技公司，中国）获取活动参数：平均速度、中央格停留时间。平均速度反映大鼠的自主运动能力，大鼠在中央格停留时间表明其对周围环境好奇程度、以及对新环境的认知能力。

       新物体识别实验：实验第1～2 d为适应期，将大鼠放在无物体实验装置内自由运动10 min。实验第3 d为学习训练期，让大鼠自由探索两个相同的物体（两个物体对角线放置）10 min。间隔1 h后，进行测试，将其中一个更换为新物体，两物体位置保持不变，再次让大鼠进行探索，记录大鼠在各区域内运动的路程和时间。两次实验间及时清理大鼠粪便、尿液、气味等。检测指标为：区分系数=探索新物体时间/（探索新物体时间+探索旧物体时间），反映大鼠的学习、记忆能力。

1.6 统计学分析

       本研究数据表示方法为均值±标准差。均使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计。使用的统计方法为：两组间连续变量比较采用t检验；3组及3组以上的连续变量采用单因素方差分析，组内两两比较则采用Bonferroni检验。将不符合正态分布的数据进行对数转化，使其符合正态分布。统计结果中当P＜0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EAI对大鼠丘脑区ECS结构及ISF流动的影响

2.1.1 各组大鼠ISF流动及其MRI表现

       示踪探针导入后，MR图像上丘脑区信号明显增高，呈类球形，强化区域随时间逐渐消退（图1）。在三维可视化图像中可见探针颜色逐渐减淡（图2）。ISF引流宏观参数显示，EAI7组和EAI14组的半衰期较其余组缩短，差异具有统计学意义（control vs. EAI7，t=6.32，P＜0.001；control vs. EAI14，t=8.66，P＜0.001；EAI7-C vs. EAI7，t=3.73，P＜0.01；EAI14-C vs. EAI14，t=6.85，P＜0.001），EAI7、EAI14组的半衰期差异不具有统计学意义，表示EAI手术同侧丘脑区ISF流动加快（表1～2）。

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图1  各组大鼠不同时间点磁示踪轴位图。Control：对照组；EAI7-C：EAI术后7 d对侧测量组；EAI14-C：EAI术后14 d对侧测量组；EAI7：EAI术后7 d组；EAI14：EAI术后14 d组。
Fig. 1  Axial tracer-based MRI of rats in each group at different time points. Control: blank control group; EAI7-C: contralateral measurement group 7 days after EAI; EAI14-C: contralateral measurement group 14 days after EAI; EAI7: 7 days after EAI; EAI14: 14 days after EAI.

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图2  鼠脑三维可视化结果。Control：对照组；EAI7：EAI术后7 d组；EAI14：EAI术后14 d组。
Fig. 2  The results of rat brain three-dimension visualization. Control: blank control group; EAI7: 7 days after EAI; EAI14: 14 days after EAI.

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表1  各组大鼠丘脑区ISF引流参数及ECS结构参数
Tab. 1  Parameters of ISF drainage and ECS structure in rats′ thalamus

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表2  磁示踪结果的两两比较（P值）
Tab. 2  Pairwise comparison of tracer-based MRI results (P value)

2.1.2 导致ISF流动加快的ECS结构变化

       DECS-mapping技术显示，EAI7和EAI14组扩散速率峰值较其余组明显增高（图3），磁示踪实验各参数结果表明，EAI7组和EAI14组的扩散速率与其余组相比加快，差异具有统计学意义（control vs. EAI7，t=4.11，P＜0.01；control vs. EAI14，t=5.32，P＜0.001；EAI7-C vs. EAI7，t=3.92，P＜0.01；EAI14-C vs. EAI14，t=5.05，P＜0.001），EAI7、EAI14两组的扩散速率未见差异。EAI7组和EAI14组的容积占比较其余组上升，差异具有统计学意义（control vs. EAI7，t=4.12，P＜0.01；control vs. EAI14，t=5.32，P＜0.001；EAI7-C vs. EAI7，t=3.93，P＜0.01；EAI14-C vs. EAI14，t=5.05，P＜0.001），EAI7组和EAI14组的容积占比未见差异。EAI7组和EAI14组的迂曲度较其余组下降，差异具有统计学意义（control vs. EAI7，t=3.93，P＜0.01；control vs. EAI14，t=4.88，P＜0.001；EAI7-C vs. EAI7，t=3.63，P＜0.05；EAI14-C vs. EAI14，t=4.54，P＜0.01），EAI7组和EAI14组的迂曲度差异不具有统计学意义（表1～2）。

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图3  各组大鼠三维DECS-mapping。注：Control：对照组；EAI7-C：EAI术后7 d对侧测量组；EAI14-C：EAI术后14 d对侧测量组；EAI7：EAI术后7 d组；EAI14：EAI术后14 d组。
Fig. 3  Three-dimension DECS-mapping of rats in each group. Control: blank control group; EAI7-C: contralateral measurement group 7 days after EAI; EAI14-C: contralateral measurement group 14 days after EAI; EAI7: 7 days after EAI; EAI14: 14 days after EAI.

2.2 EAI对大鼠rCBF的影响

       control组脑血流为（315.0±70.70）PU，EAI14组为（303.7±38.43）PU，两组脑血流之间差异没有统计学意义（t=0.34，P=0.21），可以认为14 d内该手术未改变大鼠rCBF。

2.3 EAI对大鼠运动、学习和记忆功能的影响

       旷场实验结果表明，control组的运动速度为（4.97±1.50）cm/s，EAI7组为（4.72±2.02）cm/s，EAI14组为（5.51±1.54）cm/s，3组运动速度差异没有统计学意义（F=0.34，P=0.72）；control组在旷场中心区域时间为（9.01±5.45）s，EAI7组为（9.85±4.91）s，EAI14组为（11.40±3.35）s，3组中心区域时间差异没有统计学意义（F=0.41, P=0.67）。新物体识别实验中，control组、EAI7组、EAI14组的区别系数分别为0.56±0.24、0.64±0.21、0.56±0.11，3组区别系数差异没有统计学意义（F=0.41，P=0.67）。综上所述，行为学实验表明EAI未对大鼠运动、学习和记忆等能力产生影响（表3）。

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表3  大鼠行为学测试结果的差异性比较（单因素方差分析）
Tab. 3  Comparison of rat behavioral test results (one-way ANOVA)

3 讨论

       本研究应用磁示踪法证实了EAI可有效促进脑深部丘脑区ISF流动，并应用DECS-mapping技术探讨了其潜在机制；同时，本研究还证实EAI短期内不会改变术区rCBF，即EAI并非通过脑血流加速了ISF引流。另外，本研究还通过行为学实验排除EAI手术对大鼠自主运动、认知学习等功能造成影响。研究采用了磁示踪和DECS-mapping技术，这是现有ISF引流探测技术中唯一实现了脑深部ECS信号探测的技术，具有三维图像显示，以及无探测深度限制的优点，为丘脑区ECS的探测和加速ISF流动的研究分析不仅提供现象观察的技术手段，其DECS-mapping技术也为现象的结构基础和机制提供方法。

3.1 EAI加速丘脑ISF流动

       本研究结果表明EAI加速了丘脑ISF流动，我们认为潜在机制如下：（1）ECS的空间构象决定了ISF流动边界和扩散速率，ECS的空间构象并非静态且固定不变的，EAI通过改变ECS空间结构，即迂曲度下降、容积占比增大等，加快了ISF流动。蛛网膜下腔内的脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）是脑深部ECS分子转运和ISF流动的下游，目前研究认为CSF在脑间质系统的循环路径是“动脉周围间隙-脑组织间液-静脉血管周围间隙”^[17]，流动方向是从动脉周围至静脉周围，动脉周围间隙液与静脉周围间隙液之间的压力差是产生CSF流动的驱动力之一^[18]。（2）EAI通过将颞浅动脉贴敷于硬脑膜表面，利用动脉搏动增加蛛网膜下腔中CSF的压力，来驱动CSF流动。EAI加速丘脑区ISF流动的机制除了本研究所示ECS结构改变外，可能还与递质等蛋白分子改变相关^{[19, 20]}。

       本研究显示EAI未对大鼠行为学产生影响，CAI等^[10]通过神经系统评分和水迷宫实验发现EAI未损伤神经系统功能，与本研究结果一致。此外，本研究显示EAI在14 d时大脑rCBF未发生改变，表明EAI对脑血管不产生影响，EAI将动脉置于硬膜外，主要利用动脉的机械搏动对大脑ISF流动进行调控，是一种安全的调控手段。

3.2 EAI与其他ISF调控方法的比较

       ISF内分子运动的主动调控，按照结果分为加速流动的正向调控和减慢的负向调控，EAI属于物理干预的正向调控方法。脑深部核团神经元兴奋可引起ISF流速的减慢，具有负向调控作用，痛觉和嗅觉刺激分别导致丘脑和海马区ECS分子运动速度下降^{[19, 20]}。研究证实该机制是兴奋后递质释放，导致ECS局部化学环境改变^[21]。其他调控因素还包含睡眠，在非快速眼动睡眠期间，更多的CSF流入脑间质系统，大脑的代谢物清除效率明显高于清醒时^[8]。此外，全身麻醉是一种非生理和可逆的药物诱导状态，不同于自然睡眠。不同的麻醉剂对脑清除系统有不同的抑制作用。一些麻醉剂表现出与自发睡眠类似的积极调控作用，而有些麻醉剂则截然相反^{[22, 23]}。

3.3 EAI加速ISF流动的意义

       建立脑ECS内ISF分子运动主动调控手段对于经该途径的脑病治疗具有重要意义。高血压不仅是阿尔茨海默病以及帕金森病等神经退行性疾病的危险因素^{[24, 25]}，也常诱发出血性脑卒中等脑血管疾病，而肾上腺素诱导的急性高血压会导致动脉硬化，血管顺应性下降^[25]。在普通老年人群中，其动脉搏动由于动脉粥样硬化而减弱^[26]。这些改变都可能导致大脑清除功能障碍，引起β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein, Aβ）等有毒物质在脑ECS中的沉积^{[27, 28]}。有研究表明，特定波长红光通过打碎沉积在脑深部的Aβ蛋白，从而恢复了局部脑ECS内ISF引流速度，改善了脑细胞和神经网络的工作环境，从而达到治疗效果^[2]。睡眠质量差也是中枢神经系统疾病的一个危险因素，如阿尔茨海默病、偏头痛和痴呆，这可能与大脑溶质或者代谢物清除减少有关^{[29, 30]}。由此可见，探索ISF主动调控方式、调节大脑清除功能具有巨大潜在价值。加速脑ISF引流对于出血性脑卒中后血肿和废物的清除是否具有促进作用也将是我们未来的工作重点。

3.4 本研究的局限性

       AQP4是中枢神经系统中表达最多的水通道蛋白，在星形胶质细胞末端富集，在脑ISF清除系统中起着至关重要的作用^[31]。本研究中，我们没有关注到星形胶质细胞及AQP4对结果的影响，表现在：（1）长时间的EAI，是否将改变AQP4的极性分布或者数量，从而影响EAI大鼠大脑中ISF流动；（2）脑ECS内细胞外基质中各种化学物质，比如胶质纤维酸性蛋白等是否发生改变，以上不足均有待进一步探讨。

4 结论

       本研究证实EAI促进了大鼠丘脑区ISF引流，可以作为一种经ECS治疗脑病的主动调控手段。经ECS途径加快Aβ、tau蛋白等有害物质清除，调节大脑清除系统功能有望成为治疗脑卒中、阿尔茨海默症、帕金森病等脑病的新靶点，为脑病的发病机制和诊治策略带来新视角^[32]。