0 前言

       新型隐球菌是已知真菌大类中唯一重要的人类真菌病原体，对人类及动植物健康构成了日益严重的威胁^{[1, 2]}。新型隐球菌菌体可分布于人体内任何部位，常见感染部位为肺部及脑内，脑内感染后巨噬细胞很难将其吞噬，导致脑细胞外间隙（extracellular space, ECS）累积了较多细胞毒素。新近一项调查研究发现加大逆转录病毒治疗的人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）患者隐球菌感染仍是脑膜炎发病的主要病因^[3]，隐球菌脑膜炎发病率逐年增高且致死率居高不下^[4]，主要致死原因与蛛网膜下腔及细胞外间隙脑脊液内菌体难以有效杀灭有关。目前两性霉素B（Amphotericin B, AmB）及氟胞嘧啶联合作为脑膜炎诱导期的首选^[5]，AmB很难透过血脑屏障，AmB脂质体静脉给药可以提高药物疗效，但是HIV感染者10周死亡率仍高达24.8%^[6]。已有研究^[7]证实经脑ECS超微空间局部药物递送可明显减少药物使用剂量，将药物直接递送至目标靶区，提高药物疗效，给药方式包括对流增强给药技术及简单扩散给药技术。

       北京大学韩鸿宾教授设计的MRI示踪成像技术将MRI示踪剂作为分子探针研究ECS的方法是目前唯一可以动态提供3D可视化ECS引流全局的技术，已在脑胶质瘤、缺血性脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默病等领域研究取得一定成果^[8]，但是目前还未开展针对颅内感染性疾病的相关研究；本研究建立大鼠中枢神经系统（central nervous system, CNS）A型新型隐球菌感染模型，通过MRI示踪成像技术，动态显示CNS新型隐球菌感染大鼠ECS扩散特点，量化图像信号强度，与对照组对比分析隐球菌感染大鼠ECS改变，开拓脑ECS研究新领域，为经ECS给药治疗CNS新型隐球菌感染提供理论依据，有望成为降低隐球菌脑膜炎患者死亡率治疗新手段。

1 材料与方法

       本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理审查委员会审核批准（审批号：IACUC-20210115-13），在新疆医学动物模型研究重点实验室（P2）完成。

1.1 隐球菌颅内感染大鼠模型建立及分组

       研究选用清洁雌性SD（Sprgue-Dawley）大鼠50只，18～20周龄，体重250～300 g，由新疆医科大学动物实验中心提供。将其随机分为隐球菌颅内感染模型组（30只）和空白对照组（20只）。隐球菌颅内感染模型组：舒泰（注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮，50 mg/mL，法国维克动物保健品公司）与盐酸噻拉嗪（0.05 mg/mL，吉林省华牧动物保健品有限公司）1∶1配置悬液，按2 mg/100 g剂量于大鼠臀部肌肉注射，刺激大鼠尾部确定相关反射减弱或消失，视为麻醉成功，麻醉成功后剔除大鼠头顶部毛发，将大鼠平爬固定于立体脑定位仪（美国，Stoleting)，剪开大鼠头部皮肤，分离肌肉及筋膜，充分裸露颅顶骨，按照《大鼠立体脑定位图谱（第三版）》^[9]定位大鼠尾状核头部投射点（前囟前方1.0 mm，左侧旁开3.5～4.0 mm，深度4.5～5.0 mm），1号牙科钻头钻局部开孔，利用微量注射器将2 µL 1×10⁶ CFU浓度的新型隐球菌菌悬液（新疆医科大学皮肤科真菌保藏中心提供）以0.2 µL/min速率缓慢注入大鼠尾状核，注射针留置8 min，缓慢旋转拔针2 min，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合软组织。空白对照组：将大鼠按上述操作麻醉，不做其他处理。

1.2 MRI模型监测

       所有MRI扫描均在Siemens Skyra 3.0 T MRI成像仪上进行，使用16通道相控矩阵腕关节线圈。大鼠麻醉方法同上所述，麻醉成功后大鼠平爬于腕关节线圈，使用T2WI FS、T2 mapping、DWI序列监测颅内病灶形成情况，扫描参数分别为：T2WI FS序列（层厚2 mm，间隔2 mm，FOV 8 cm×8 cm，矩阵256×256。TR 2800 ms，TE 97 ms，翻转角120°）、T2 mapping（层厚1.5 mm，间隔2 mm，FOV 250 mm×250 mm，矩阵196×196，TR 1150 ms，TE 13.8 ms，翻转角180°）、DWI（采用平面回波技术，梯度因子b为800 s/mm²和0 s/mm²，TR 4000 ms，TE 83 ms，FOV 220 mm×220 mm，矩阵260×260，层厚2 mm，间隔0 mm，梯度场25 mT，三个正交方向上的弥散梯度持续时间30 ms，翻转角90°）。图像采集由一名经验丰富的高年资（具有10年工作经验）主管技师完成，所采集图像由两位医师（分别具有8及10年诊断经验）采用盲法分别进行诊断，其中一名为副主任医师，诊断有分歧时请另一名高年资CNS诊断主任医师裁定。

1.3 MRI示踪成像

       模型建立成功大鼠及对照组大鼠麻醉成功后，先行T1加权三维磁化强度预备梯度回波（T1 weighted imaging three dimensional magnetization prepared rapid acquisition gradient echo, T1WI 3D MP-RAGE）序列预扫描，记录为T0。预扫描后大鼠微穿刺尾状核头部，用微量注射器以0.2 µL/min的速率注射10 mmol/L浓度的钆喷酸葡胺（gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acid，Gd-DTPA，20 mL/9.38 g，分子量938.01，广州康臣药业）2 µL，于注射后15、45、90、120、180、240 min行T1WI 3D MP-RAGE序列扫描，标记为T15、T45、T90、T120、T180、T240。扫描参数：层厚0.43 mm，间隔0 mm，FOV 267 mm×267 mm，矩阵512×512，TR 1830 ms，TE 2.99 ms，TI 1100 ms，Flip Angle 9°，采集时长8 min 26 s，间隔2 h进行半剂量麻醉剂补充注射一次，有效避免图像运动伪影。

1.4 数据采用标准

       本研究两位诊断医师根据大鼠MRI表现裁定，观察节点为造模后28 d，纳入标准：（1）进针侧脑膜和（或）脑室管膜可见线样T2高信号，可伴有同侧脑室扩张；（2）进针侧脑实质内可见类圆形、结节状、片状长T1长T2异常信号影。排除标准：（1）不能明确诊断CNS新型隐球菌感染；（2）示踪成像穿对比剂注射中心偏离尾状核头部中心超过2 mm；（3）对比剂注射于脑脓肿或肉芽肿内部；（4）示踪成像过程中大鼠出现颅内出血、死亡，麻醉复苏后头部左偏等意外情况。最终病例组15只、对照组13只大鼠图像数据被采用入组。

1.5 图像后处理

       入组示踪成像图像以Dicom数据形式由成像仪主机直接下载后导入ITK-SNAP^[10]软件，校准后于冠矢轴垂直三平面垂直确定注射点中心，以注射点中心最大横截面绘制直径6 mm圆形感兴趣区（regions of interest, ROI），提取每个时间点信号强度分布频数统计量（x¯±s）。取对照组及病例组均数及标准差平均值，根据时间对应关系，绘制对应时间变化曲线。

1.6 统计学分析

       使用SPSS 25.0软件，计量资料以x¯±s表示，各时间点均数、标准差采用正态性检验，病例组及对照组使用独立样本t检验。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线，计算曲线下面积（area under the curve, AUC）。信号强度均值及标准差时间数据导入Origin 2021绘制时间-信号曲线。

2 结果

2.1 动物模型建立及监测结果

       至造模后28天，共有3只（10%）大鼠死亡，22只（73.3%）大鼠脑MRI出现异常改变。MRI常规检查T2WI FS、T2WI mapping、T1WI 3D MP-RAGE、DWI序列可清楚显示CNS新型隐球菌感染病变（图1）。

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图1  28 d模型建立监测，左侧尾状核头部A型新型隐球菌感染常规MRI扫描及伪彩处理。1A：DWI b=800 s/mm²，左侧尾状核病灶内见结节状高信号，水分子扩散受限增加；1C：T1 3D MP-RAGE，左侧尾状核病灶呈稍低信号；1E：T2WI FS序列，左侧尾状核病灶呈稍高信号，同侧硬脑膜受累；1G：T2 mapping序列，病灶呈稍高信号；1B、1D、1F、1H为1A、1C、1E、1G对应图像伪彩图。
Fig. 1  Left caudate nucleus head cryptococcus infection with conventional MRI and pseudo-color treatment (28 days after the establishment of the model). 1A: DWI b=800 s/mm², nodular high signal is observed in the lesions of left caudate nucleus, and water diffusion is limited and increased; 1C: T1 3D MP-RAGE, the lesion in left caudate nucleus shows slightly lower signal; 1E: FS sequence on T2WI, with slightly higher signal intensity in the left caudate nucleus and ipsilateral dura involvement; 1G: T2 mapping sequence, the lesion shows slightly higher signal; 1B, 1D, 1F and 1H are 1A, 1C, 1E, 1G pseudo-color maps of corresponding image.

2.2 MRI示踪图像信号强度分析结果

       基于MRI示踪成像图像信号强度标准差与时间呈线性关系，病例组注射后信号强度均值平均数高于对照组（图2A），病例组T0、T15、T45时刻标准差大于对照组，T180、T240时刻低于对照组（图2B）。独立样本t检验病例组与对照组T0、T15、T45、T90、T120、T180、T240 均数P值分别为：0.019、0.048、0.150、0.878、0.845、0.603、0.819；标准差P值为0.285、0.017、0.327、0.308、0.891、0.298、0.486（表1、表2）。T0均数AUC=0.815，P=0.011（图3、表3）。

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图2  病例组（2A）及对照组（2B）均值、标准差与时间关系曲线，病例组各时间点信号强度均值高于对照组，病例组T15、T30、T45标准差大于对照组，反映病例组扩散速率较对照组缓慢，T180、T240低于对照组，可能是A型新型隐球菌感染后细胞间质液增多稀释效应所致。
Fig. 2  Case group (2A) and control group (2B) in the mean, standard deviation and time relation curve, average signal strength at each time point of case group is higher than that of control group, cases T15, T30, T45 standard deviation is greater than the control group, reflect the slow diffusion rate than the control group, cases T180, T240 is lower than the control group. It may be due to the dilution effect of increased intercellular substance fluid after cryptococcus infection.

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图3  CNS新型隐球菌感染信号强度ROC曲线，AUC=0.815，P=0.011。
Fig. 3  ROC curve of signal intensity of cryptococcus CNS, AUC=0.815, P=0.011.

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表1  信号强度均数均值t检验
Tab. 1  Mean value t test of signal strength mean

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表2  信号强度标准差t检验
Tab. 2  Standard deviation t test of signal strength

3 讨论

       本次研究针对新型隐球菌颅内感染导致的ECS改变展开，实验设置的T2WI FS、T2 mapping、DWI采集参数可以满足大鼠CNS隐球菌感染情况监测，1×10⁶ CFU浓度的新型A型隐球菌引起颅内感染率为73.3%。病例组及对照组T0时刻T1WI 3D MP-RAGE序列信号强度均数统计量差异有统计学意义，均值信号强度可为鉴别感染受累区及给药靶区设置提供参考。病例组及对照组注射示踪剂后T15时刻信号强度均数及标准差差异均有统计学意义，反映病例组ECS扩散速率与正常对照组存在差异，表明短时间内病例组细胞外扩散速率明显低于对照组，经此间隙给药研究局部药物浓度观察节点不应低于15 min。

3.1 模型建立及原位注射技术

       本实验采用颅内手动原位注射建立隐球菌颅内感染模型，于第28 d行MRI常规检查确定模型建立情况，造模成功率达73.3%，立体定位仪下手动注射菌悬液，可以满足模型建立需求，最佳观察节点为21～28 d。以往隐球菌颅内感染动物模型建立相关研究所用菌株浓度为1×10⁴～1×10⁷ CFU不等，注射方式多为脑池内、侧脑室、脑实质或尾静脉注射^{[11, 12, 13]}。结果表明经脑池或侧脑室注射菌悬液浓度不超过1×10⁵ CFU时，因大鼠自身免疫脑脊液菌负荷降低，较难引起明显的病理改变^{[11, 12]}；浓度为1×10⁶ CFU时菌浓度可超过大鼠自身免疫，病程进展较慢，28 d存活率高；而浓度为1×10⁷ CFU时大鼠28 d死亡率达83.33%^[11]，不利于本实验后期MRI示踪扫描。因本实验旨在探讨隐球菌颅内感染情况下脑ECS变化，需于脑内引起较明显病理改变的同时保证较高的存活率，因此造模所用菌悬液浓度选择为1×10⁶ CFU，注射方式选择了直接、易感染致病且干扰因素少的脑实质原位注射，大鼠28 d存活率高达90%，致病率达73.3%，与其他研究结果类似^{[11, 12]}。

       本研究菌株及示踪剂注射均采用尾状核原位手动注射方式。MRI示踪成像过程中手动注射存在产生气泡、局部出血等并发症，造成异常信号影响后续分析，手动对比剂颅内原位注射存在失败风险，采用微量进样泵有望提高实验成功率。

3.2 隐球菌颅内感染ECS改变

       相邻神经细胞之间存在着一个不规则、曲折、狭窄的空间被称为ECS，其占脑组织容积的20%，内含有流动的细胞间质液（intercellular substance fluid, ISF）、细胞外基质以及脑细胞生存和行使功能所需的各种营养物质、离子及神经递质等^{[8, 14]}，最终汇入脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）。因此ECS在疾病病理阐述及局部给药技术中有重要地位。国内学者韩鸿宾教授团队研发的MRI示踪扫描技术是目前唯一能够三维各向异性建模的量化分析方法^[15]，其可动态观察疾病状态下ECS功能变化，有助于揭示发病机制，为经ECS治疗CNS病变提供理论依据。MRI示踪法已在脑胶质瘤^[16]、帕金森病^[17]、缺血性脑卒中^{[18, 19]}、脑ECS扩散改变及局部用药方面研究中卓有成效。但有关于CNS感染性疾病脑ECS研究目前还处于空白，因此本研究基于MRI示踪法探讨新型隐球菌颅内感染ECS引流改变，验证其信号强度反映示踪剂引流特点的效能，为经脑ECS局部给药治疗颅内感染性病变可行性奠定理论依据。

       近年来，MRI信号强度分析在颅内肿瘤分级、代谢性疾病诊断中发挥重要作用^{[20, 21, 22]}，已有研究发现信号强度随时间变化与组织病理学预后因素表达相关^{[23, 24, 25]}，其亦可反映骨质内有机物、无机物含量变化^[26]，动态增强MRI肝内信号强度变化与肝功能亦存在相关性^[27]。借此，本研究通过提取既定时间点ECS示踪剂信号强度统计量，绘制时间-信号曲线，发现信号强度与时间呈线性关系，病例组与对照组T0时刻及T15时刻信号强度差异具有统计学意义，病例组信号强度均值高于对照组，证实病例组示踪剂信号衰减缓慢，这与感染后脑ECS病理变化密切相关。新型隐球菌颅内感染的主要病理变化为脑膜浸润、脑组织水肿、脑积水等，主要机制是新型隐球菌荚膜多糖通过物理作用阻塞蛛网膜颗粒，影响CSF重吸收，ISF引流受阻^{[28, 29, 30]}，大量菌体积聚于ECS内增殖，导致溶质在ECS内引流阻力增加，引流受阻，因此示踪剂引流速度缓慢，表现为信号衰减速度缓慢，表明隐球菌颅内感染脑组织信号强度可以为鉴别诊断提供量化参考。

       除此之外，T180、T240标准差低于对照组，表明该时间点病例组信号强度离散程度低于对照组，考虑病例组因炎症反应细胞外基质增多，ECS内ISF增多，菌体阻塞ISF-CSF通路，ISF引流受阻，扫描后期ISF潴留更明显，导致示踪剂稀释，而稀释后示踪剂分布较病例组均匀，这预示着经ECS给药于180 min后药物浓度分布将趋于均匀，为有效药物开始发挥最佳疗效的时间点，研究测算该时间点药物浓度可为局部给药剂量提供参考。

3.3 局限性

       虽然信号强度可以初步阐述新型隐球菌CNS感染脑ECS改变，但是无法计算有效扩散系数（D^*）、清除速率常数（K）、迂曲度（λ）以及半衰期，后续进一步优化实验方案，参照韩鸿宾教授课题组C6胶质瘤模型试验建模方法^[31]，加入相同环境温度下琼脂内Gd-DTPA扩散参数作为对照，建立新型隐球菌CNS感染MRI示踪成像数学方程，计算D^*、K、λ、半衰期，进一步推进CNS感染性病变脑ECS研究。

4 结论

       综上所述，MRI示踪成像技术实时采集脑ECS扩散信息，有助于我们进一步深入研究CNS感染性疾病脑ECS扩散的生物学基础，为经ECS局部给药治疗CNS感染性疾病开辟新的方法与思路，有望降低死亡率，改善预后。