0 前言

       脑组织通道是脑细胞外间隙（extracellular space, ECS）及其引流通道共同组成的跨尺度结构空间^[1]，占据了活体脑容积的15%～20%，远大于以往备受重视的脑血管所占据的3%～5%的容积空间，其内的类淋巴组织液（interstitial fluid, ISF）引流是维持脑工作微环境稳态的关键。ISF含多种有机、无机分子以及囊泡等微观结构，是脑内各种细胞最直接的生存和工作环境，其内部化学成分的稳定是脑细胞稳定工作的基础^[2]。研究表明，ECS内物质转运对维持环境稳态、传递药物和清除代谢废物^[3]等都至关重要，决定着睡眠、认知和感觉形成^[4]等重要的生理功能。几乎所有中枢神经系统状态的生理和病理改变都会导致ECS扩散特性的显著变化^{[5, 6, 7]}，然而ECS位于纳米尺度、活体探测困难，因而它的结构和功能均未被充分认识。为了解密该结构空间，国内外开展了多项针对脑ECS的探测技术的研究^[8]。国际上主流的ECS探测技术主要有电化学方法^[9]、荧光示踪法^{[10, 11]}、单碳纳米管探测法^{[12, 13, 14]}等，但这些方法都有着探测深度、灵敏度等的限制，无法探究脑深部ECS的结构参数以及ISF的引流情况。近年来，磁示踪探测技术快速发展并渐趋成熟，可以实现三维活体探测。北京大学韩鸿宾课题组已经应用该技术在发育^[15]、航天^[16]、脑病治疗^[17]等相关领域进行了大量的研究与探索，但该技术在初期设计阶段集成度不够，且仍有部分工程技术难题尚待解决，如磁共振图像信号强度与浓度之间准确转换关系的获取、采集的磁共振时间序列图像间的配准和分割等。原有图像配准模块配准精度不够，配准的不准确可能会错误地“认为”较大的扩散范围而过高地估计ECS内部的扩散能力，进而导致ECS参数测量不准确；此外分割、配准等模块过多地依赖人工交互，由此引入的随机误差使测量结果稳定性差。磁示踪法的推广与应用对该技术的性能指标提出了更高的要求，因此迫切需要优化测量与分析流程并进行相应的工程技术实现。本文将系统介绍磁示踪法探测技术的原理、实现以及脑组织通道磁示踪成像分析仪的整体架构设计，并初步评价分析仪的研制对测量质量提升的效果。本研究可以实现脑深部ECS结构的标准化、自动化测量，为脑的神经生物学研究和经ECS途径诊治脑病的新方法研究提供标准化的探测工具，对解析不同脑区ECS的超微结构特征、阐明脑深部ISF引流规律与机制等方面具有重要意义。

1 建模与仪器设计原理

       磁示踪法成像分析技术首先向ECS内导入特异性分布的顺磁性或光磁复合性探针，在磁场环境中，探针会改变水分子中氢原子核的纵向弛豫时间，在磁共振图像上表现为高信号，从而可以对探针导入前后探测采集的物理信号的变化进行建模与处理分析，进而求解出ECS的结构和功能特征参数。为描述探针导入后其在ECS内的分布转运规律，本系统主要建立三维各向异性扩散建模方程，见公式（1）：

       其中Q为注射的信号源，C表示在t时刻、位置（x,y,z）处的探针浓度，Dx、Dy、Dz分别表示x、y、z三个方向的扩散系数，k为与体内示踪剂代谢相关的清除系数，α为ECS占脑组织体积的百分比。有关该模型的建模、求解等详细过程具体可参考文献[18]。本系统在解决针对ECS内分子扩散三维各向异性建模求解难题的基础上，分别设计探针导入系统、射频信号采集系统、信号转换与定标系统，辅以基于深度学习的图像处理与计算系统等核心功能单元，最后通过系统集成与参数优化，研制成“脑组织通道磁示踪成像分析仪”。图1为仪器设计示意图，利用探针导入系统将探针导入ECS，采集时间序列磁共振图像，利用定标系统实现图像信号强度-浓度转换，再经过图像处理系统中的配准、分割等处理，获取不同时刻外源性探针的空间变化信息，然后通过最优化迭代和数值计算求解建立的扩散方程，最终获得目标参数扩散系数和容积占比。

点击查看大图

图1  脑组织通道磁示踪成像分析仪。1A：仪器各子系统设计图；1B：信号采集系统位于磁场工作环境中；1C：信号采集系统放大图。
Fig. 1  Brain tissue channel tracer-based magnetic resonance imaging analyzer. 1A: Design of each subsystem of the instrument; 1B: Signal acquisition system located in a magnetic field working environment; 1C: Enlarged view of the signal acquisition system.

2 材料与方法

2.1 分析仪关键部件的设计与研制

2.1.1 信号源（探针）与信号源导入系统

       本仪器信号源选用课题组前期通过将异硫氰酸荧光素（fluorescein isothio-cyanate, FITC）和金属钆离子（Gd³⁺）进行化学合成^[19]得到的光磁复合型探针Gd-DO3A-EA-FITC，该探针可同时采用适合活体动态成像与信号采集的磁共振成像系统和具有高分辨率的光学成像系统对脑ECS进行分析，并交叉验证，充分结合光学与磁学成像各自的优势，更好地服务于脑科学研究。

       信号源导入一般可以使用立体定位仪搭配微量注射针，选择采用对流增强或简单扩散的方式来进行。前者最早于20世纪90年代由Oldfield等提出^[20]，通过压力驱动探针导入^[21]，该方法要求导入过程速度缓慢且需要驻针，实验约40%都存在不同程度的针道逆流现象，这将导致扩散源项的不稳定，进而使得最终测量出现偏差；后者由HAN等^[22]提出，基于微透析原理实现半透膜循环扩散给药，采用市场可购置的磁共振对比剂给药泵和三通内循环导入头端设计，以浓度驱动替换压力驱动导入，可以解决压力给药导致的药物逆流和计算误差等问题。

2.1.2 信号采集系统

       本研究磁场采用中科院电工所研制的3 T无液氦挥发超导磁体，室温孔径300 mm，磁场均匀性在18 cm的球体容积直径（diameter of spherical volume, DSV）内约为8 ppm，具有变场功能。变场功能中由于磁场强度变化导致拉莫频率变化，射频激发及接收频率需相应变化，对此采集系统信号处理部分区别于传统的直接发射/接收，采用混频模式，通过设置多种频率的本振信号，结合标准频率综合器，上混频或下混频到工作频率，该方法可快速灵活地切换整体系统的工作频率，实现系统变场及X核成像。

       整体信号采集系统（图2A）分为电子系统及采集系统两部分。电子系统中的谱仪控制台为核心设备，可实现序列编程及原始数据采集，便于新序列及算法的开发应用，主要执行磁共振成像序列，包括射频激发、梯度发生、信号采集、外部门控触发等功能。射频/梯度控制信号经由对应的放大器馈入射频/梯度线圈，产生实际的射频B1场及梯度场，进行磁共振信号激发及信号编码。采集系统部分实物图如图2B所示，射频线圈电路^[23]为经典的并联调谐电路，射频线圈部分等效为电感L及电阻R，通过两个可调电容分别调节线圈的谐振频率和端口阻抗。梯度线圈设计梯度强度为200 mT/m，约为商用人体系统梯度强度的3倍，可支持更高时间及空间分辨率的序列成像。此外，该系统独立配有水冷系统，用于梯度线圈的散热。

       为了获得实时且标准的信号强度-浓度转换关系，本研究设计定标系统。定标系统（图3）是实现信号-浓度转换的关键部件，其核心目的是通过定标探针确定目标探测位置的真实准确浓度。该系统主要由定标器、温度控制系统与软件分析系统组成。根据探测要求，示踪探针导入的浓度为10 mmol/L，导入ECS后，浓度将随着探针的扩散分布逐步减低，探针对周围水分子的弛豫作用会从横向弛豫为主的T2效应向纵向弛豫为主的T1效应逐步转换，需要通过对不同浓度载药柱动态扫描成像，绘制载药柱信号-浓度曲线作为标准曲线，提供T1/T2效应拐点或平台区间，为ECS参数计算提供有效浓度范围及信号浓度系数。磁示踪法需要长时间对测量对象进行同一序列扫描，可能因弛豫饱和导致信号强度不准确，因此本系统设计环形定标器（图3A），环形部分设置浓度梯度定标探针载体腔（要求材质核磁下无信号或弱信号），环形以内空心处放置测量对象，从而实现测量对象与定标探针同步扫描。

       本研究专门设计与定标系统兼容的收发一体射频线圈（图3B、图3C），高灵敏度地探测ECS射频信号。发射线圈位于外层为鸟笼形发射天线，得到小范围均匀射频场，其内层为8通道相控阵接收单元，用于接收磁共振信号，内置低噪声高增益放大器，保证成像质量。线圈最小孔径30 mm，最大孔径160 mm，可根据实验样品尺寸灵活选择，获得最佳信噪比。

       考虑到纵向弛豫时间的温度依赖性，为保持探针载体腔内探针温度与测量对象温度一致（磁共振扫描环境下精度±1℃），本研究采用水循环方式进行温度控制，将定标器中设置的恒温液体流入口和流出口作为水循环的出入口。温控系统主要包含上位机、水箱、单片机、光纤温度传感器、调压器与加热棒、温度开关、蠕动泵、散热水排、数码管显示器等部件。上位机发送指令设定定标器目标温度，当水箱内温度低于目标设定温度时，单片机控制加热器（调压器+加热棒）对水箱内的液体进行加热，同时蠕动泵运行将加热的液体泵至定标器内对定标器进行加热。利用光纤传感器实时检测定标器内液体的温度，当检测温度接近目标温度时逐渐降低蠕动泵转速直至停止，最终等待定标器内温度稳定。降温过程则将蠕动泵反转，把水箱的液体泵至散热水排中，同时水排的散热风扇启动，通过气流对水排进行冷却从而达到降温的目的。

点击查看大图

图2  整体信号采集系统架构图（2A）与采集系统实物图（2B）。
Fig. 2  Overall structure block diagram of signal acquisition system (2A) and physical picture of acquisition system (2B).

点击查看大图

图3  定标系统示意图。3A：环形定标器；3B：与定标器兼容的收发一体线圈设计图；3C：与定标器兼容的收发一体线圈拆解示意图。
Fig. 3  Diagram of calibration system. 3A: Ring calibrator; 3B: Design of transceiver integrated coil compatible with the calibrator; 3C: Disassembly diagram of transceiver integrated coil compatible with the calibrator.

2.1.3 图像处理与建模计算系统

       设计图像处理与建模计算系统对采集到的时间序列鼠脑磁共振数据进行后处理，具体包括感兴趣区域（region of interest, ROI）选择、配准校正、定标、扩散建模等子模块。本系统采用客户端/服务器（client/server, C/S）架构模式进行开发与设计，采用MySQL（My Structured Query Language, MySQL）进行数据库的管理，服务端主要基于Spring Boot框架，前端界面框架基于PyQt5，各图像处理子功能模块采用Python 3.X进行独立开发与设计，相对独立的设计便于后期对各功能子模块进行升级与拓展，温度控制模块主要利用C语言进行嵌入式开发。图4所示为本仪器依托的软件平台的整体架构，实现整体实验测试流程、用户、权限的管理以及不同功能子模块之间数据的存储、交互和传输等。

       各软件模块的详细设计如下：

       （1）实验新增：本系统支持PACS数据导入与本地文件导入新增两种模式。

       （2）ROI选择与配准：由于本研究实验时间跨度较长，因此多个时间点采集的图像可能会出现较大形变，如图5A所示。为了能够关注同一区域的扩散变化，需要尽可能保证时间序列间图像的对齐精度。为此，设计如图5B所示的主要处理流程，包含两阶段配准框架。首先对图像进行刚性对齐，以修正不同时间点扫描引起的大幅位移偏差，随后通过开发的人工辅助分割模块进行ROI的勾画，训练鼠脑检测模型，裁减出检测边框实现ROI的提取。在此基础上在鼠脑及其周围区域进行无监督^[24]精细配准（图5C、图5D）。配准后进一步训练3D UNet鼠脑分割模型，获取仅包含鼠脑的精细的ROI，用于容积占比的计算。

       （3）区域分割与图像重建：本研究通过对体素值的分析实现注射点源的自动选择，同时三方位展示图像，并利用3D体绘制技术实现鼠脑示踪剂增强区域的可视化来进一步辅助支持注射点的手动选择，以保证注射点的准确选择。注射点选择基于注射探针后的第一个时间点。此外利用6邻域区域生长实现不同时间点增强区域的分割，得到时间序列扩散区域图像。注射点与扩散区域图像将作为后续扩散建模计算模块的输入。

       （4）建模计算与结果可视化：对定标模具进行磁共振成像后，训练基于Mask R-CNN^[25]的定标液检测模型，检测并确定不同载药柱内标准信号强度与浓度之间的关系。结合定标与配准后对减的步骤等结果，获取不同时刻不同位置处的浓度，通过方程计算求解出扩散区域平均扩散系数、不同坐标点处的扩散系数等。最后利用可视化工具包绘制ECS扩散系数参数图（diffusion mapping of ECS, DECS-mapping）。

点击查看大图

图4  系统软件整体架构。
Fig. 4  Overall architecture of system software.

点击查看大图

图5  ROI选择与配准示意图。5A：磁示踪法实验数据，固定图像-以预扫描图像作为配准的基准图，n个时间点浮动图像-注射后间隔一段时间的扫描图像；5B：ROI选择与配准阶段主要流程图；5C：两阶段配准框架示意图；5D：基于深度学习的配准模型，包括一个UNet层，一个微分同胚积分层和一个空间变换网络。ROI：感兴趣区域；Ti：某一个时间点浮动图像向固定图像的空间变换，i为1～n；Rigid：刚性配准；Pre：预处理阶段，包括刚性配准和ROI提取两部分；UNet：一种广泛用于图像分割的模型；L：总损失函数；Lsim：相似性损失；LR：正则项损失；λ：正则项损失超参数；w：3D 磁共振图像的宽度；h：3D MR磁共振的高度；d：3D 磁共振图像的深度。
Fig. 5  Diagram of ROI selection and registration. 5A: Experiment data of tracer-based magnetic resonance imaging, fixed images-“Pre-scanned” images were used as the reference images for registration, n time points' moving images-scanned images with an interval of time after injection were used as moving images; 5B: Main flow chart of ROI selection and registration stage; 5C: Schematic diagram of two-stage registration framework; 5D: The registration model based on deep learning, including an UNet layer, a differential homeomorphic integration layer and a spatial transformation network. ROI: region of interest; Ti: a spatial transformation from moving images at a certain time point to fixed images, i ranges from 1 to n; Rigid: rigid registration; Pre: pre-processed stage, including rigid registration and ROI extraction; UNet: A model widely used for image segmentation; L: total loss function; Lsim: similarity loss; LR: regularization loss; λ: the hyperparameter of regularization loss; w: width of 3D magnetic resonance image; h: height of 3D magnetic resonance image; d: depth of 3D magnetic resonance image.

2.2 分析仪效果实验验证

2.2.1 研究对象

       本研究获得北京大学医学部生物医学伦理委员会批准（LA2020356），所用对象为12只成年雄性斯普拉-道来氏（Sprague Dawley, SD）大鼠，体重250～300 g。SD大鼠均由北京大学医学部实验动物科学部提供[实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0013]，且符合北京大学医学部实验动物护理与使用指南。将12只大鼠随机分成传统方案组（n=6）与本研究系统组（n=6）。所有大鼠均进行12 h光/暗周期饲养，可自由获取食物和水，所处环境温度（22±1）℃、湿度为60％±5％。

2.2.2 实验操作

       本研究选用压力驱动给药方式进行探针导入。在实验正式开始前，对大鼠进行磁共振扫描，获取基准图像。随后将大鼠固定在标准脑立体定位坐标仪（Stoelting公司，美国）中，暴露前囟后找到相应坐标钻孔。准备体积为2 μL、浓度为10 mmol/L 的探针溶液，使用微量注射针（Hamilton公司，美国）并应用立体定位注射技术以0.2 μL/min的速度向尾状核区域进行注射，注射坐标参考大鼠脑定位图谱^[26]获得，全部注射完成后针停留5 min左右，防止引起反流。在注射后的15、30、45、60 min等时间点，进行重复扫描，直至磁共振图像中增强区域部分基本消失。成像序列及参数与基准图像采集保持一致。随后对采集到的图像进行后期图像处理与建模计算，求解扩散系数和体积分数两个指标参数。图6所示为磁示踪法探测技术实施主要流程。

       采用改良的磁共振三维扰相梯度回波序列^[27]扫描图像，主要采集参数如下：TI 900 ms，TR 1500 ms，TE 3.7 ms，回波间距8.8 ms，翻转角9°，FOV 267 mm×50 mm，矩阵96×512，带宽300 Hz/Px，激发次数2，相位编码步数96，扫描时间290 s。

点击查看大图

图6  磁示踪法探测技术实施主要流程。
Fig. 6  Main process of implementation of tracer-based magnetic resonance imaging detection technology.

2.3 统计学分析

       本文采用Python 3.7进行统计分析，对数据进行柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫（Kolmogorov-Smirnov）正态性检验和方差齐性检验，正态数据用均数±标准差表示，非正态数据用中位数（四分位数间距）表示。对各指标参数进行两两比较，两组正态分布且满足方差齐性的数据之间采用独立样本t检验，两组非正态性数据及正态性与非正态性数据之间采用Mann-Whitney U检验，检验水准为双侧α=0.01，P＜0.01为差异有统计学意义。

3 结果

       本研究系统组与传统方案组相比，测得的ECS内分子扩散系数减小（t=-3.498，P＜0.01），ECS容积占比减小（t=-3.539，P＜0.01），差异均具有统计学意义，且两项参数的标准差均小于传统方案组，代表本研究系统组测量结果之间差异度更小，结果更稳定、更趋向于真实水平。

       利用区域生长与体绘制模块实现ISF引流可视化（图7A）。扩散建模计算模块输出ROI内各个坐标点的扩散系数，并通过软件平台中的可视化模块，绘制主要扩散区域切片的DECS-mapping（图7B）。

点击查看大图

图7  结果可视化。7A：ISF引流随时间的变化；7B：示例数据DECS-mapping结果示意图，从左到右依次为第20~22层矢状位切片。ISF：组织液；PRE：预扫描图像；DECS-mapping：ECS扩散系数参数图；ECS：细胞外间隙。
Fig. 7  Results visualization. 7A: Changes of ISF drainage with time; 7B: Example of DECS-mapping results (from left to right, the 20th-22th sagittal section). ISF: interstitial fluid; PRE: pre-scanned images; DECS-mapping: diffusion mapping of ECS; ECS: extracellular space.

点击查看表格

表1  两组SD大鼠脑尾状核区ECS参数结果
Tab. 1  Brain ECS parameters in caudate nucleus of SD rats in two groups

4 讨论

       本文首先详细且系统地介绍了脑组织通道磁示踪成像分析仪的实施方案与整体架构，围绕ECS扩散参数求解中目标函数优化的核心问题，设计信号源合成、信号源导入、ECS射频信号采集、图像处理、建模计算等多个子系统，优化核心处理算法，进而集成脑组织通道磁示踪成像分析仪，解析ECS结构参数并实现ISF引流过程可视化。最后在具体实验中证实新系统的测量结果稳定性高于原系统，得到的ECS内部分子扩散系数和ECS结构参数更接近真实水平。

       既往采用磁示踪法进行研究的过程中，ROI选择模块与图像配准^[28]需要操作者对多个时间点进行手动勾画，同一操作者前后操作的不稳定以及不同操作者之间不一致等均会导致测量结果存在偏差。本研究训练自动检测与分割模型实现ROI提取，减少过多的人工交互、大大降低人工成本，同时标准化处理流程保证了处理的一致性，使得结果更加稳定。原系统中图像配准精度不够，无法准确获取同一位置信号强度随时间的变化，各时间点图像之间未对齐的体素会被程序误认为是造影剂扩散至的区域，因此测量出的扩散系数容积占比比实际值偏高。本研究的图像配准部分建立基于刚性对齐与深度学习相结合的两阶段配准框架，解决磁示踪法ECS结构动态三维成像图像配准存在大形变和非刚性形变的技术难题，使得配准过程更加精准高效，测量结果更加准确可靠。此外，本次研究设计了专用定标模块，建立了不同空间位置处造影剂信号强度增量与其浓度之间的映射关系，并在此基础上对时间序列图像分析，获得了不同位置浓度随时间的变化规律，进一步保证测量结果的准确性。

       近年来，ECS研究领域飞速发展，脑组织通道探测技术经历了技术上的发展与创新^[29]。Nicholson团队发明的实时离子导入法（real-time iontophoresis, RTI），利用四甲基铵（tetramethylammonium, TMA）阳离子探针，通过测量电位变化表征脑内两点间ECS的结构信息，该方法仅具有一维、局部探测能力，无法进行跨尺度分析^[9]；集成光学成像法（integrative optical imaging, IOI）^[7]同样由Nicholson团队发明，该方法利用荧光成像可以实现二维探测，但仅能探测200 μm以内的浅表区域，且需要在离体环境下进行。除RTI-TMA⁺、IOI方法外，电阻抗成像法^[30]根据生物体内不同组织以及组织在不同功能状态下具有不同电阻抗的原理，通过测量成像区域边界电压值的变化，对成像区域中电导率分布进行重构，反应生物体内结构及其组织器官功能，该方法具有功能成像、无损伤性等特点，但数据采集量受电极数量限制，同样只能进行二维采集。磁示踪法是由本课题组自主研发、基于磁共振成像技术对脑细胞微环境进行探测与解密的新型测量方法。得益于磁共振成像无电离辐射、成像序列丰富、参数灵活且全脑成像等特点^[31]，磁示踪法是目前唯一突破检测深度限制，能够对全脑范围内ECS进行检测的技术。Nicholson等作为ECS探测技术领域的先驱者、开拓者，然而其技术目前并未得到广泛推广与应用，除探测技术的限制外，还缺乏一体化专用仪器规范、简化实验流程。本研究基于磁示踪法，自主研发硬件系统并搭载专用软件平台对实验数据进行标准化处理，保证了数据流传输的连贯性，同时使得整体实验过程与后处理分析更加简洁、一体化，提升处理效率，便于普及与推广。此外，统一的数据管理便于后期的数据挖掘与分析工作，以更好地指导磁示踪探测技术的可持续升级和更新。

       本研究仍具有一定的局限性。本仪器中的数学模型主要基于扩散建模，然而只包含扩散因素的数学模型一定程度上不够精准^{[32, 33]}，未来将进一步优化建立对流扩散模型，以求能够精准描述ECS内物质分布与转运的规律，为经ECS途径给药提供新方法与依据^[34]，实现精准调控。此外，磁共振成像虽然可以实现三维探测，但其分辨率较低、成像过程中易受设备噪声影响，而荧光成像具有高分辨率，核素成像具有较高的探测灵敏度，阻抗成像具有功能成像等优势，因此未来在ECS领域结合不同成像方式的多模态探测分析技术值得期待^[35]。

5 结论

       本研究为后续兼容电阻抗、化学等多种信息的ECS探测仪器研发奠定了基础，以提供更加丰富、灵敏、准确的大脑生理学参数。