0 前言

       肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种以皮质脊髓束上运动神经元、脑干和脊髓前角下运动神经元的神经变性和丢失为特征的难治性进行性神经退行性疾病^[1]，会导致显著的运动障碍。同时，ALS患者还存在运动外变性，部分在临床和病理上与额颞叶痴呆重叠，表现为认知或行为异常^{[2, 3]}。

       扩散张量成像（diffusion tensor imaging, DTI）是一种成熟的非侵入性的神经成像技术^[4]，已被广泛用于检测患者的脑白质微观结构的变化，并评估大脑中白质纤维束的完整性。目前多应用基于体素的形态学（voxel-based morphometry, VBM）^[5]或基于纤维束空间统计（tract-based spatial statistics, TBSS）^{[6, 7]}的方法分析ALS疾病的神经影像学特征，但是前者存在配准误差、平滑问题，而后者仅能评估整个纤维束平均扩散变化，缺乏对个体的精确定位。自动纤维定量（automatic fiber quantification, AFQ）方法克服了两者的局限性^{[8, 9]}，使用全脑确定性纤维束成像方法重建纤维束，沿纤维轨迹的100个解剖等效位置估计每个特定纤维束的逐点扩散参数，为定量分析研究提供更多准确信息^[10]。基于机器学习算法已应用于各领域，支持向量机（support vector machine, SVM）是一种经典的机器学习算法，用于解决监督分类问题，多用于二分类，具有良好泛化性能、稳健分类能力及对小样本数据的处理能力优异等特点^{[11, 12, 13]}。目前，国内还没有基于AFQ方法研究ALS患者脑白质的改变，本研究拟采用AFQ法识别并分析ALS患者的脑白质纤维特性，并将其作为特征变量，结合SVM算法的机器学习探究其在ALS疾病的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       前瞻性纳入2021年9月至2022年12月在苏州大学第一附属医院就诊的29例（男18例，女11例）门诊或住院ALS患者（ALS组）。ALS组纳入标准：符合世界神经病学联盟的修订版EI Escorial^[14]诊断标准并且能够完成MRI检查及神经心理学评估。排除标准：（1）高血压、脑血管病及其他神经精神疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症或癫痫；（2）服用精神类药物或药物滥用；（3）患有急性或严重威胁生命的疾病。

       通过社会招募的方式纳入性别、年龄和受教育年限等相匹配的29例（男13例，女16例）健康对照者（healthy controls, HCs）（HCs组）。HCs组纳入标准：（1）神经或精神科诊断临床检查正常；（2）右利手。排除标准：（1）有头部损伤史；（2）存在MRI检查禁忌。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经苏州大学附属第一医院医学伦理委员会批准，批准文号：2022-409，全体受试者均签署了知情同意书。

       所有ALS患者在MRI检查当天均接受了标准化临床神经学检查，采用修订版肌萎缩侧索硬化功能评分量表（Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale-Revised, ALSFRS-R）^[15]评定患者功能状态及病情严重程度等，ALSFRS-R评分结构分为四部分，包括延髓域、精细运动域、粗大运动域及呼吸域，使用ΔALSFRS-R=（48-ALSFRS-R评分）/病程（月）评估DTI扫描时的疾病进展率。采用汉化版的爱丁堡ALS认知行为量表（Edinburgh Cognitive and Behavioural ALS Screen, ECAS）^{[16, 17]}评估患者与HCs的认知及行为特征。

1.2 检查方法

       图像采集于德国Siemens Magnetom Skyra 3.0 T MRI系统及头部36通道相控阵线圈。所有受试者在扫描过程中头部用海绵垫固定以减少运动伪影，双耳置入橡胶耳塞以减低机器噪音，且均先行常规头颅MRI结构像扫描，以除外神经系统器质性疾病。高分辨T1加权结构像采用磁化快速梯度回波序列进行扫描，为前后联合的定位提供解剖学信息。扫描参数为：TR 5000 ms，TE 2.98 ms，TI 700 ms，层厚1.0 mm，层数176层，体素大小1 mm×1 mm×1 mm，视野256 mm×256 mm，翻转角1/2 4°/5°。DTI采用平面回波成像序列，扫描参数为：TR 5000 ms，TE 103 ms，层厚2.0 mm，矩阵100×100，体素大小2 mm×2 mm×2 mm，视野240 mm×240 mm，64个扩散梯度方向（b值=1000 s/mm²）以及一个b0图像。

1.3 数据预处理

       利用dcm2nii.exe组件将图像从DICOM格式转换为NIFTI格式文件；使用FMRIB软件库（http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl）软件扩散工具箱（FMRIB's Diffusion Toolbox，FDT）将扩散加权图像线性配准对齐至b0图像，消除扫描过程中的头动以及由头动和涡流所引起的简单形变，使用b0图像估计脑模板；利用脑提取工具（Brain Extraction Tool, BET）去除扩散加权图像及T1序列图像的头皮、颅骨等非脑组织，采用FSL中的dtifit功能计算各向异性分数（fractional anisotropy, FA）及平均扩散系数（mean diffusivity, MD）、径向扩散系数（radial diffusivity, RD）、轴向扩散系数（axial diffusivity, AD）等DTI参数值。

1.4 自动纤维定量分析

       应用基于Matlab的AFQ软件包（https://github.jyeatman/AFQ）自动提取全脑20条主要白质纤维束，同时对纤维束进行精细划分，并将FA等指标映射到纤维束的每一个细分区段进行定量分析。根据YEATMAN等^[8]提出的自动纤维量化方法，主要步骤如下：（1）运用自动确定流线型跟踪算法（streamlines tracking algorithm, STT）进行全脑纤维束跟踪；（2）通过自动感兴趣区进行全脑纤维束分割，定义纤维束运动轨迹；（3）同标准概率纤维束图谱比较细化纤维束，将概率性图谱转换到个体空间上；（4）根据纤维束组表示为3D高斯分布定义纤维束核心，清除明显偏离纤维束核心的杂散纤维束；（5）沿纤维束中央重采样100个等距节点，计算每个节点在纤维组核心中的平均位置，通过加权平均值计算每个节段的扩散张量参数值。

1.5 支持向量机分类模型

       根据统计结果分析，选取ALS患者与HCs组间存在差异的节点作为特征集合，包括45个FA值、78个MD值、40个AD值及79个RD值，共242个特征值。从Python开源的sklearn库里直接调用SVM，经预训练后对比效果，选择径向基核函数（radial basis function, RBF）构建分类模型。为了防止由于训练使用特征值过多，拟合过度泛化，采用主成分分析（principal component analysis, PCA）方法对特征进行降维操作。全体样本包括29位患者和29位对照组，被分为训练集（80%）和测试集（20%），且由于样本数较少，为避免随机划分产生的测试集中仅存一类的情况，使用分层交叉验证，即确保训练集与测试集均含有50%的ALS患者和50%的HCs，每次更换训练集和测试集进行训练与测试，重复进行五次，并对五次学习的结果进行平均处理作为最终结果。

1.6 统计分析

       采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。连续变量以均值±标准差或中位数（四分位间距）表示，计数资料用例（%）表示，定性资料用频数表示。两组间比较时，正态分布定量资料采用独立样本t检验，非正态分布定量资料采用Mann-Whitney U检验，定性资料比较采用χ²检验。对追踪出的纤维束DTI扩散指标随机进行置换检验逐点分析，使用错误发现率（false discovery rate, FDR）进行多重比较校正。采用偏相关分析，控制年龄、性别及受教育年限为潜在协变量，研究DTI差异节段指标均值与ALS患者临床指标的相关性。P＜0.05表示差异有统计学意义。应用敏感度、特异度、准确率及受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线及ROC曲线下面积（area under the　curve, AUC）评估支持向量机模型的性能。

2 结果

2.1 人口统计学信息统计及结果

       本研究共纳入受试者58例，ALS组和HCs组各29例，其中ALS患者球部起病者3例（10.34%），肢体起病者26例（89.66%），发病年龄为（59.38±10.28）岁，病程中位数10.00（6.50～24.50）个月。两组间在年龄、性别及受教育年限上差异均无统计学意义（P均＞0.05），ALS组ECAS评分明显低于HCs组（P＜0.05）（表1）。

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表1  人口学及主要临床特征统计表
Tab. 1  Statistic table of the main clinical characteristics and demographic information

2.2 AFQ分析全脑白质纤维束结果

       成功追踪的18条纤维束包括双侧丘脑放射束、双侧皮质脊髓束、双侧扣带束扣带回、胼胝体束膝部和压部、双侧额枕下束、双侧弓形束、双侧钩状束、双侧上纵束和双侧下纵束，双侧扣带束（海马旁）未追踪出。相较于HCs组，ALS组在左侧皮质脊髓束的大脑脚、内囊及放射冠区（节点1-6，14-19，28-60）FA值降低，左侧皮质脊髓束内囊（节点38-52）AD值降低，左侧额枕下束偏前部（节点79-82）、右侧上纵束偏后部（节点80-100）AD值增高；左侧皮质脊髓束初级运动皮质区（节点68-96）、右侧皮质脊髓束初级运动皮质区、放射冠及内囊区（节点14-28，62-95）MD值增高，双侧皮质脊髓束初级运动皮质区、大脑脚区（节点29-61，68-75）及（节点13-33，63-74，88-92）RD值增高，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

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图1  利用AFQ技术获得的扩散加权成像（DTI）组间差异结果及三维渲染。X轴表示第1至第100个纤维节段，左侧Y轴表示平均DTI参数。实线代表均值，虚线代表均值的标准差，绿色代表肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者，红色代表健康对照（HC）组，图中紫色区域表示P＜0.05。CST：皮质脊髓束；IFOF：额枕下束；SLF：上纵束；L：左；R：右；FA：各向异性分数；AD：轴向扩散系数；MD：平均扩散系数；RD：径向扩散系数。
Fig. 1  Group differences for diffusion tensor imaging (DTI) and 3D rendering obtained by AFQ technology. The X-axis represents the 1st to 100th fiber segments, and the left Y-axis represents the average DTI parameters. In the figure, solid lines represent the mean, dashed lines represent the standard deviation of the average, green for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients, red for healthy control (HC), and purple regions in the plot indicate P＜0.05. CST: corticospinal tract; IFOF: inferior fronto-occipital fasciculus; SLF: superior longitudinal fasciculus; L: left; R: right; FA: fractional anisotropy; AD: axial diffusivity; MD: mean diffusivity; RD: radial diffusivity.

2.3 相关性结果

       ALS组中受损纤维节段的扩散张量指标值与患者临床特征进行相关性分结果显示：左侧皮质脊髓束平均FA值与ALSFRS-R评分中的精细功能域得分呈正相关（r=0.386，P=0.046），右上纵束平均AD值与ALSFRS-R评分中的延髓功能域得分呈正相关（r=0.422，P=0.028），且右侧皮质脊髓束平均MD值、RD值均与ECAS评分呈负相关（r=-0.428，P=0.026；r=-0.416，P=0.031），而各扩散张量指标与病程、疾病进展率等无明显相关性（图2）。

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图2  相关性分析结果。2A：左侧皮质脊髓FA值与精细功能域得分呈正相关；2B：右上纵束AD值与延髓功能域得分呈正相关；2C、2D：右侧皮质脊髓束MD值、RD值与ECAS评分均呈负相关。CST：皮质脊髓束；SLF：上纵束；L：左；R：右；FA：各向异性分数；AD：轴向扩散系数；MD：平均扩散系数；RD：径向扩散系数；ECAS：汉化版的爱丁堡肌萎缩侧索硬化症认知和行为量表。
Fig. 2  Results of the correlation analysis. 2A: The FA value of left corticospinal tract FA was positively correlated with the fine functional domain score; 2B: The AD value of right superior longitudinal fasciculus was positively correlated with the bulbar functional domain score; 2C and 2D: The MD and RD values of right corticospinal tract were negatively correlated with ECAS scores. CST: corticospinal tract; IFOF: inferior fronto-occipital fasciculus; SLF: superior longitudinal fasciculus; L: left; R: right; FA: fractional anisotropy; AD: axial diffusivity; MD: mean diffusivity; RD: radial diffusivity; ECAS: Edinburgh Cognitive and Behavioural ALS Screen; ASL: amyotrophic lateral sclerosis.

2.4 SVM分类结果

       采用组间差异的节点FA值、AD值作为特征时明显优于MD值及RD值，AUC值分别为0.81、0.88，分类的准确率达72.33%、75.33%，且具有较高的敏感度和特异度；所有纤维束具有组间差异的节点作为分类特征时效果最佳，AUC达0.90，准确率高达81.00%，敏感度为72.67%，特异度为88.66%（表2，图3）。

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图3  不同DTI指标在支持向量机模型中的ROC曲线。横轴表示假阳性率（1-特异度），纵轴则表示真阳性率（敏感度），曲线下面积（AUC）代表了正确分类的效能。FA、MD、AD及RD分别为各向异性分数、平均扩散系数、轴向扩散系数及径向扩散系数的组间差异值；ALL为所有受损纤维束组间差异值。
Fig. 3  The ROC curves of the different DTI metrics in the SVM model. The horizontal axis represents the false positive rate (1-specificity), the vertical axis represents the true positive rate (sensitivity), and the area under curve (AUC) represents the efficacy of the correct classification. FA, MD, AD and RD are the group difference values of fractional anisotropy, mean diffusivity, axial diffusivity and radial diffusivity, respectively; ALL is the group difference values of all damaged fiber bundles.

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表2  SVM分类结果
Tab. 2  The SVM classification results

3 讨论

       本研究基于AFQ技术检测ALS患者白质纤维束微结构特性的变化，并进一步探讨了与ALSFR-R、ECAS量表评分等的相关性。主要研究结果表明，脑白质损伤，尤其是皮质脊髓束的损伤是ALS的常见部位，可能导致运动神经元功能异常和认知及行为功能障碍，基于AFQ方法分析获得的DTI指标可作为ALS的诊断生物标志物，且结合支持向量机方法诊断预测ALS疾病是可行的。

3.1 AFQ技术检测到ALS患者脑白质纤维完整性改变

       皮质脊髓束是从大脑皮层延伸到脊髓的运动通路，是ALS在中枢神经系统的主要病理部位^[18]。DTI技术能够从微观到宏观层面探索复杂的结构特征^{[19, 20, 21]}，其四个指标中，FA值是DTI中应用最广泛的标量，反映了轴突纤维的各种特征，当它减低时通常代表纤维束脱髓鞘和轴突完整性受到破坏，MD值的增加已被证明与轴突丢失而导致的细胞外间隙水扩散的变化有关，AD值和RD值是分别代表平行和垂直方向纤维束扩散的直接指标，提供了关于FA值或MD值的更具体的神经生物学信息。基于DTI的AFQ分析方法通过将皮质脊髓束划分成亚段，使损伤的定位更加精确。本研究结果显示ALS患者在左侧皮质脊髓束尤其是内囊、放射冠和大脑脚区FA值较HCs显著减低，双侧皮质脊髓束均有MD值增高，这与先前众多研究报道一致^{[22, 23]}。同时，皮质脊髓束AD值及RD值也具有相应改变，提示AD值及RD值变化可作为ALS患者DTI检查的补充信息，探明了髓鞘形成和轴突胞体广泛异常的原因，与既往研究结果相似^[24]。除皮质脊髓束外，本研究发现ALS患者在左侧额枕下束偏前部及右侧上纵束偏后部也存在AD值的异常改变，这些联络纤维的损伤可能提示ALS患者潜在的语言功能障碍，导致语义性失语以及语言和非语言理解的缺陷^{[25, 26, 27]}。

3.2 ALS患者受损纤维节段的扩散张量指标值与临床特征的相关性

       ALSFRS-R评分是评估ALS患者功能状态和变化的有效工具^[28]。皮质脊髓束作为ALS主要病理改变，基于其与FA变化的稳定相关性，可能是最适合监测疾病严重程度的区域^{[29, 30]}。多数研究应用ALSFRS-R评分对上、下运动神经元状态进行综合估计，而本研究对ALSFRS-R功能域评分更加细致化，结果发现左侧皮质脊髓束FA值的减少与ALSFRS-R的精细功能域评分呈正相关，同时，右上纵束的AD值与ALSFRS-R的延髓功能域评分呈正相关。因此，除了广泛使用的FA值之外，AD值可能是评估ALS临床严重性的一个很好的选择。本研究中，DTI指标的差异节段与病程及疾病进展率没有明显相关性，原因可能是纳入的患者人数较少，没有根据临床严重程度及疾病进展速度对ALS患者进行具体亚组分析，这同BAO等^[31]研究结果一致。BAEK等^[32]对96例可能或确诊的ALS患者进行研究，证实了DTI指标与代表疾病进展速度的ALSFRS-R评分相关，并且亚组分析显示在快速进展的ALS中观察到更严重和更广泛的脑白质微结构损伤。此外，多数额颞叶变性患者存在皮质脊髓束细微结构改变^[33]，本研究结果显示ALS患者的ECAS评分明显低于HCs，且ALS患者的右侧皮质脊髓束MD值、RD值与ECAS评分呈显著负相关，提示ALS患者整体认知功能受损，且皮质脊髓束特定节段的改变可能与其有关。

3.3 AFQ技术联合SVM方法识别ALS疾病的可行性

       目前，机器学习方法结合神经成像数据已多数成功应用于ALS的预测建模，如WELSH等^[34]使用静息态功能磁共振成像数据训练支持向量机分类器准确率达71.5%；SARICA等^[24]应用DTI张量指标的随机森林方法建立ALS和HCs之间的区分模型准确率达80%。本研究中，在支持向量机算法下，运用DTI多种参数对模型进行训练，与MD、RD参数相比，基于FA、AD参数的学习模型准确率达70%以上，提示在ALS微结构异常中，FA及AD测量似乎比其他参数对轴突结构完整性更敏感。另外将所有具有组间差异的值作为分类特征取得了较好的效果，总体准确率达81%，具有综合更好的敏感度、特异度，且AUC值最大。上述结果表明，基于AFQ方法获取的神经影像特征构建的SVM模型可以将ALS患者和HCs区分开来，且获得较好的分类效果，后续可以将DTI指标与其他神经成像数据结合，系统比较各种机器学习方法的诊断性能，真正能够高准确地区分ALS患者和HCs^{[35, 36]}。

3.4 局限性

       本研究存在一些不足之处：首先，样本较小，需要扩大样本量及多中心进一步验证并分组研究；其次，DTI技术为基于高斯模型的单指数扩散成像，难以检测到白质区域中交叉纤维结构，后续需要更先进的扩散成像技术，如NODDI或DSI研究证实ALS患者脑白质微结构损伤。

4 结论

       基于DTI的AFQ方法对分析ALS神经影像特征是一种很有前途的工具，DTI的张量指标可作为ALS诊断的敏感生物标志物，可同时显示运动和运动外区域的变化，而皮质脊髓束可作为临床监测病情的可靠区域，基于AFQ方法联合SVM算法对鉴别ALS患者与HCs具有可行性和有效性。