0 引言

       2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）已成为最常见的慢性代谢性疾病之一，2021年全球约有5.37亿患者，2045年预计可增至7.83亿^[1]。持续高血糖可引起包括中枢神经系统在内的多系统损伤^[2]，因此T2DM被认为是导致轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）和痴呆的重要因素^[3]，较健康人群存在更高的认知障碍风险^[4]。研究表明T2DM患者肠道菌群代谢物中短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）变化与其认知功能障碍之间存在关联性^[5]。有研究通过扩散MRI发现T2DM患者存在丘脑区域的微观结构改变，丘脑是影响认知功能的重要区域^[6]，但是有关肠道SCFAs与丘脑微观结构关系的研究未见明确报道，而扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging, DKI）可反映脑组织非高斯分布方式扩散的水分子运动，从而能够更为敏感地描述与反映脑灰白质微观结构的细微病理改变^{[7, 8]}。本研究利用DKI探究不同认知功能的T2DM患者丘脑微观结构改变及其与肠道SCFAs变化的相关性，旨在为研究T2DM短链脂肪酸影响脑微观结构的肠-脑轴生理机制提供影像学支持，并为临床干预T2DM相关神经系统并发症提供潜在治疗手段。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究收集2021年8月至2022年8月在本院内分泌科诊治的T2DM患者。纳入标准：（1）T2DM诊断需满足2021年美国糖尿病协会（American Diabetes Association, ADA）制订的“糖尿病医学诊疗标准”^[9]；（2）既往无明确的脑部病变及精神疾病；（3）近1个月无抗生素、益生菌及益生元等药物服用史，无便秘、腹泻等胃肠道症状；（4）受教育年限≥6年；（5）右利手；（6）30~70岁。按2004版蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）评分将其分为2组：MoCA评分<26分者为T2DM伴MCI组（T2DM-MCI组）；MoCA评分≥26分者为T2DM不伴MCI组（T2DM-nonMCI组）。健康对照（healthy control, HC）组纳入标准：（1）无认知功能障碍；（2）无糖尿病等代谢疾病；（3）既往无精神障碍史和精神创伤史；（4）近1个月无抗生素、益生菌及益生元等药物服用史，无便秘、腹泻等胃肠道症状；（5）受教育年限≥6年；（6）右利手；（7）30~70岁。T2DM和HC组的排除标准：（1）不能配合完成MRI检查或MoCA测试者；（2）阿尔茨海默病、帕金森病、路易体痴呆患者；（3）常规MRI检查显示脑内有病变者；（4）其他代谢性疾病者。本研究经大连大学附属中山医院伦理委员会审批通过（批准文号：2020017），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 仪器与方法

1.2.1 仪器

       采用Siemens 3.0 T超导磁共振扫描仪（Magnetom Skyra），32通道头颅专用相控阵列线圈。首先行T2WI扫描，扫描参数：TR 3 610 ms，TE 112 ms，层数20，层厚5.5 mm，视野230 mm×186 mm，矩阵384×218，扫描时间54 s。符合纳入标准者行DSI序列检查，扫描参数：TR 5 100 ms，TE 109 ms，体素大小2.1 mm×2.1 mm×2.0 mm，层数70，层厚2.0 mm，视野230 mm×230 mm，矩阵110×110，扫描时间683 s，b值为0~3 000 s/mm²。

1.2.2 图像处理及分析

       使用后处理软件NeuDiLab进行计算与分析，其流程包括：（1）去除头骨；（2）校正涡流和运动伪影；（3）平滑处理（半峰全宽为3 mm)；（4）由DIPY（Diffusion Imaging in Python）法通过扩散谱成像（diffusion spectrum imaging, DSI）序列拟合并自动生成相应的DKI功能彩图（图1），即各向异性分数（fractional anisotropy, FA）值、平均峰度（mean kurtosis, MK）值、径向峰度（radial kurtosis, RK）值及峰度分数各向异性（fractional anisotropy of kurtosis, FAK）值。感兴趣区（region of interest, ROI）由2位具有5年工作经验的神经影像主治医师共同测量完成，在双侧丘脑横断面显示最清晰、面积最大的层面放置ROI，双侧ROI位置对称，大小为4 mm×4 mm，尽量避免邻近脑脊液、骨骼、大血管、窦腔空气等结构。取2名主治医师测量的平均值作为最终结果。

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图1  女，63岁，2型糖尿病伴轻度认知障碍组患者，MoCA评分24分。1A：FA图；1B：MK图；1C：KFA图（红、绿色方框分别表示为右、左侧丘脑感兴趣区）。MoCA：蒙特利尔认知评估量表；FA：各向异性分数；MK：平均峰度；KFA：峰度分数各向异性。
Fig. 1  Female, 63 years old, type 2 diabetes mellitus with mild cognitive impairment group patient, MoCA score 24. 1A: FA map; 1B: MK map; 1C: KFA map. Red and green boxes indicate right and left thalamus regions of interest, respectively. MoCA: Montreal Cognitive Assessment; FA: fractional anisotropy; MK: mean kurtosis; KFA: kurtosis fractional anisotropy.

1.2.3 神经心理学测试

       在头颅MRI检查前，在密闭安静环境中行MoCA量表测试以评估受试者认知功能，满分为30分，评分≥26分为正常，评分<26分为MCI；随后再行画钟测试（Clock Drawing Test, CDT）、连线测验A（Trail Making Test, TMT-A）、词语流畅度测试（Verbal Fluency Test, VFT）等认知专项测试及焦虑自评量表（Self-Rating Anxiety Scale, SAS）、抑郁自评量表（Self-Rating Depression Scale, SDS）、匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI），总时长约30 min。

1.2.4 SCFAs检测

       于MRI检查前一天采集受试者粪便样本，并置于-80 ℃液氮罐保存备用。SCFAs检测分析由深圳微科盟生物组学团队按常规操作进行。取适量样本于1.5 mL离心管中，加500 μL蒸馏水，加入100 mg玻璃珠，匀浆1 min，于4℃ 12 000 rpm离心10 min，取200 μL上清液，加100 μL 15%磷酸，再加375 μg/mL的内标（4-甲基戊酸）溶液20 μL和乙醚280 μL匀浆1 min，于4 ℃ 12 000 rpm离心10 min，收集上清液并用于检测SCFAs。在全扫描和SIM模式下，使用气相色谱仪Thermo Trace 1 310和质谱仪Thermo ISQ LT测定SCFAs的浓度。

1.2.5 实验室指标检测

       采集受试者血液并行如下生化指标检测，包括空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin, HbAlc）、甘油三酯（glycerin trilaurate, TG）。

1.3 统计学分析

       采用SPSS 26.0统计分析软件。所有计量资料均进行正态分布检验，方差齐性检验，符合正态分布的用均数±标准差表示，采用单因素方差分析；不符合正态分布的用中位数（上下四分位数）表示，非正态分布采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。将年龄、性别作为协变量，采用Spearman偏相关性分析探讨DKI参数值与认知相关量表评分及SCFAs之间的相关性，记录相关系数r值及P值，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料及MoCA量表评分比较

       3组间受教育年限、SAS、SDS、PSQI评分的差异均无统计学意义（P均>0.05）;而3组间年龄、FPG、HbA1c、TG、MoCA、CDT、VFT、TMT-A评分差异均有统计学意义（P均<0.05），详见表1。其中T2DM-MCI组MoCA、CDT及VFT评分最低，TMT-A评分最高，且与T2DM-nonMCI和HC组的差异均有统计学意义（P<0.05）。

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表1  3组受试者一般资料指标及MoCA认知量表评分的比较
Tab. 1  Comparison of general subject characteristics and MoCA cognitive scale scores among the three groups of participants

2.2 3组间DKI定量参数值的比较

       本研究显示，T2DM-MCI组左侧丘脑MK值均低于另两组，且T2DM-MCI与T2DM-nonMCI组间差异具有统计学意义（P<0.05）。与HC组比较，T2DM-MCI组左侧丘脑RK、右侧丘脑FA、KFA值均普遍减低（P<0.05），两两比较显示，左侧丘脑RK值在HC与T2DM-nonMCI组间差异有统计学意义（P<0.05），右侧丘脑FA、KFA值在T2DM-nonMCI与T2DM-MCI组间差异有统计学意义（P>0.05）。但左侧丘脑FA、KFA和右侧丘脑RK、MK在3组间差异均无统计学意义（P均>0.05），详见表2。

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表2  3组受试者双侧丘脑DKI定量参数值比较
Tab. 2  Comparison of quantitative DKI parameter values in bilateral thalami among the three participant groups

2.3 3组间SCFAs多样性比较

       3组间比较仅显示异丁酸、异戊酸浓度差异具有统计学意义（P均<0.05），其余代谢物SCFAs在3组间差异均无统计学意义（P均>0.05），详见表3。

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表3  3组受试者肠道代谢物SCFAs系列的比较
Tab. 3  Comparison of intestinal metabolites, SCFAs series, among the three groups of participants

2.4 T2DM患者组DKI参数值与认知功能评分及SCFAs相关性

       在T2DM患者中，右侧丘脑FA、FAK值与MoCA评分呈正相关（r=0.328，P=0.015；r=0.435，P=0.001）；左侧丘脑RK值与己酸浓度呈正相关（r=0.431，P=0.001）；左侧丘脑MK值与MoCA评分及己酸浓度呈正相关（r=0.294，P=0.030；r=0.287，P=0.033）；右侧丘脑FAK值与TMT-A评分呈负相关（r=-0.318，P=0.018）。其余DKI参数值与CDT、VFT评分、其他SCFAs浓度相关性均无统计学意义（P>0.05），详见图2、3。

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图2  双侧丘脑扩散峰度成像参数与认知量表评分的相关性热图。*表示P<0.05；**表示P<0.01；MoCA为蒙特利尔认知评估量表；CDT为画钟测试；VFT为词语流畅度测试；TMT-A为连线测验A；FA为各向异性分数；MK为平均峰度；RK为径向峰度；KFA为峰度分数各向异性。
Fig. 2  Correlation heatmap between bilateral thalamic, cerebellar hemisphere diffusion kurtosis imaging parameters, and cognitive scale scores. * indicates P<0.05; ** indicates P<0.01; MoCA: Montreal Cognitive Assessment; CDT: Clock Drawing Test; VFT: Verbal Fluency Test; TMT-A: Trail Making Test Part A; FA: fractional anisotropy; MK: mean kurtosis; RK: radial kurtosis; KFA: kurtosis fractional anisotropy.

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图3  双侧丘脑扩散峰度成像参数值与肠道短链脂肪酸的相关性分析热图。*表示P<0.05；**表示P<0.01；Acetic acid为乙酸；Butyric acid为丁酸；Caproic acid为己酸；Isobutyric acid为异丁酸；Isovaleric acid为异戊酸；Propionic acid为丙酸；Valeric acid为戊酸；FA为各向异性分数；MK为平均峰度；RK为径向峰度；KFA为峰度分数各向异性。
Fig. 3  Correlation analysis heatmap between bilateral thalamic diffusion kurtosis imaging parameter values, and intestinal short-chain fatty acids. * indicates P<0.05; ** indicates P<0.01; FA: fractional anisotropy; MK: mean kurtosis; RK: radial kurtosis; KFA: kurtosis fractional anisotropy.

3 讨论

       在本研究中，我们采用DKI技术对伴或不伴认知功能障碍的T2DM患者丘脑微观结构的改变进行了探究，并分析其参数改变与认知量表评分及SCFAs之间的关系。结果发现合并认知障碍的T2DM患者丘脑区域存在更加广泛与严重的组织微观结构损伤，T2DM患者丘脑微观结构完整性损伤与认知评分减低之间存在一定关联。同时在所有T2DM患者中左侧丘脑MK、RK值与己酸浓度呈正相关，但二者之间的具体关系及相互作用机制仍需不断进行深入研究，以期在未来通过干预肠道菌群及其代谢产物减轻T2DM对中枢神经系统带来的损伤。

3.1 T2DM患者丘脑DKI差异指标与认知量评分相关性

       丘脑是认知功能相关的重要脑区，具有学习、记忆和信息处理等功能^[10]，大量研究通过DTI发现丘脑容易受异常代谢影响，是T2DM微观结构损伤最常见的区域^{[11, 12]}，而DKI模型相对于传统DTI技术对于微观结构的反映具有更高的敏感性^[13]，在研究丘脑这样由灰质核团和白质纤维构成的复杂区域的微观结构变化方面具有一定优势。

       本研究结果显示，与HC组相比，T2DM-MCI组右侧丘脑FA、KFA值存在下降趋势，二者可以反映水分子的各向异性，当FA、KFA值减低说明白质纤维髓鞘丢失引起水分子轴向与径向扩散差异下降，可能是由于T2DM患者因大脑神经元长期处于高糖或胰岛素抵抗状态，使得白质纤维及灰质核团结构受损^[14]，而DKI技术能够敏感地检测出这种微观结构变化。在本研究中，T2DM-MCI与T2DM-nonMCI组左侧丘脑MK、RK值均逐渐降低，且前者显著大于后者，MK值反映水分子的受限程度，MK值降低说明相关区域微观结构复杂性减低，可能与轴突/髓鞘的丢失有关^[4]，也可能与丘脑区域脑细胞分区化不足和膜通透性增加有关^[15]。因此，DKI对早期评价尚未出现明显认知障碍临床症状的T2DM患者的丘脑微观结构异常改变具有潜在临床价值。此外，本研究还发现T2DM患者左侧丘脑MK值、右侧丘脑FA及FAK值与MoCA评分呈正相关，右侧丘脑FAK值与TMT-A评分具有负相关性，丘脑是大脑重要的信息传递中枢，它对整个大脑皮层具有相互投射作用^[16]，并且在感觉，运动和联想区域之间的信息处理和传输中起着主要作用^[17]，本研究从影像学角度进一步证明丘脑微观结构的完整性与T2DM患者认知功能及信息处理能力之间存在密切关联。这与LI等^[18]评估T2DM患者丘脑灰质区与认知功能具有相关性，并发现灰质微观结构破坏越严重其认知障碍越明显的结论基本相符。

3.2 T2DM患者SCFAs异常改变及其与DKI参数相关性

       肠-脑轴是肠道与大脑的双向作用通路^[19]，先前研究表明肠道内微生物及其代谢产生的SCFAs可以通过神经、体液及免疫等途径作用于脑组织，被认为是神经系统及脑肠疾病新药开发的重要靶标^{[20, 21]}。本研究发现T2DM患者肠道代谢物SCFAs中的异丁酸、异戊酸水平均低于HC组，这与此前研究结果基本相符^[22]，而SCFAs水平异常可能会加重T2DM中枢神经系统的胰岛素抵抗和炎性反应^{[23, 24]}。此外，本研究还发现T2DM-MCI患者肠道中异丁酸、异戊酸浓度高于T2DM-nonMCI患者，但是异丁酸、异戊酸水平增高与认知功能减低的关系尚缺乏有力证据。

       本研究中还显示所有的伴或不伴认知障碍的T2DM患者左侧丘脑MK、RK值与己酸呈正相关，但是T2DM患者与健康受试者之间己酸含量未见显著差异，这或提示只有在T2DM患者中己酸可以发挥丘脑区域的神经保护作用，这可能是由于T2DM内皮功能障碍可以引起血脑屏障透过度增高^[25]，从而使肠道中产生的己酸可以更高效地通过肠脑轴作用于中枢神经系统。有学者^[26]研究也证实肠道SCFAs可作为区分MCI患者和健康对照组的早期诊断生物标志物；SHI等^[27]发现SCFAs在MCI中可以发挥神经保护作用，通过调节SCFAs或有助于预防和改善MCI；还有研究^[28]发现长期缺乏己酸会导致1型糖尿病小鼠学习和记忆受损，而补充己酸时则提高了海马突触素水平，改善了学习和记忆障碍。

3.3 本研究的局限性

       本研究存在一定局限性：一是本研究样本量较少，且HC组性别欠均衡；二是未对丘脑核团进行细化分区，手动勾画ROI可能存在一定主观性及数据偏移；三是本研究仅为横断面研究，对肠道SCFAs水平与MCI之间因果关系的纵向动态规律尚不明晰。

4 总结

       综上所述，利用DKI技术可敏感检测和定量评估T2DM患者认知功能相关的丘脑核团微观结构变化规律，我们发现T2DM丘脑微观结构的改变与肠道代谢产生的SCFAs水平异常改变具有相关性，在未来的临床研究与实践中，己酸浓度或可以作为T2DM个体化治疗的重要参考因素。