0 引言

       据国际糖尿病联盟估计，2045年全球糖尿病患者将达到7亿，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）占90%以上^[1]。T2DM是一种以高血糖和糖耐量减退为特征的慢性代谢性疾病，与周围神经病变和视网膜病变等多种并发症密切相关，甚至会不同程度损害脑结构和功能，导致认知功能下降^[2]。T2DM导致的相关认知功能障碍已严重影响我国老年人群的生活质量，给国家和社会带来了沉重的医疗负担，但对于T2DM 患者认知功能损害的机制尚不明确，同时缺乏客观的检测手段和有效治疗^[3]。基于静息态功能MRI（resting state functional MRI, rs-fMRI）的静态功能连接分析（static functional connectivity, sFC）可从全脑水平反映空间上非邻近的各功能脑区的相互作用，已被广泛应用于^{[4, 5]}识别T2DM患者异常脑功能连接。但sFC分析默认整个扫描过程中脑区间时间序列的相关性是恒定不变的，而大脑是个动态的复杂系统，会通过不断变化以适应微环境的改变^[6]。动态功能网络连接（dynamic functional network connectivity, dFNC）^[6]采用滑动时间窗口和聚类分析技术，可识别扫描期间多个离散连接状态，刻画脑活动状态的时域特性，从而提供更多反映脑网络间信息交互的特征。已有研究表明dFNC的改变与多种神经精神疾病有关^{[7, 8, 9, 10]}，然而目前仅LYU等^[11]利用dFNC分析技术初步探讨了T2DM患者认知功能损伤的dFNC特征，研究结果不具有普适性，仍需进行大量类似研究来进行佐证、补充。在此背景下，本研究拟应用dFNC分析技术探讨T2DM患者功能连接时变性及其动态功能指标与临床指标的相关性，促进对T2DM脑活动状态异常改变的深入理解，以期为揭示T2DM认知功能损伤的神经生理机制及早期诊断提供影像学依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

       前瞻性纳入2021年8月至2022年5月本院内分泌科确诊的31例T2DM患者的临床及影像资料（T2DM组）。纳入标准：（1）符合2014年美国糖尿病协会（American Diabetes Association, ADA）对T2DM的诊断标准^[12]；（2）40~60岁。排除标准：（1）精神障碍或精神疾病家族史；（2）脑肿瘤、中风及脑外伤史；（3）糖尿病酮症酸中毒、严重低血糖发作史，且须借助外力恢复意识；（4）烟酒成瘾及药物滥用；（5）MRI检查禁忌；（6）简易精神状态检查量表评分（Mini-Mental State Examination, MMSE）<24分。同期在社区及本院体检中心招募32名年龄、性别及受教育年限与T2DM组患者相匹配的健康对照（healthy control, HC）作为HC组。纳入标准：（1）无烟酒成瘾及药物滥用史；（2）无精神障碍或精神疾病家族史；（3）无任何神经系统疾病。排除标准：（1）MRI检查禁忌；（2）脑内器质性病变：（3）蒙特利尔认知功能量表评分（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）<26分。所有被试均为右利手，能完成MMSE和MoCA测试。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，得到马鞍山市人民医院伦理委员会批准[伦理批准号：马人医学伦审（2022）007第006号]，受试者均签署知情同意书，遵循自愿法则。

1.2 数据采集

       采用Siemens MAGNETOM Prisma 3.0 T扫描仪及64通道头颈联合相控阵线圈。嘱受试者仰卧于检查床，平静呼吸，闭眼并保持清醒，头部用海绵垫固定以减少头动。rs‐fMRI采用多频段平面回波序列，多频段加速因子8，TR 800 ms，TE 30 ms，翻转角56°，矩阵104×104，FOV 208 mm×208 mm，体素大小2 mm×2 mm×2 mm，层数72层，共采集450个时间点，扫描时间6 min 10 s。T1WI全脑结构像采用矢状面磁化快速梯度回波序列，TR 1 900 ms，TE 2.26 ms，FOV 250 mm×250 mm，矩阵256×256，体素大小1 mm×1 mm×1 mm，层数176层，扫描时间4 min 20 s。

1.3 数据处理

       图像数据预处理。采用基于Matlab（R2018a）平台的DPARSF工具（http:// www.rfmri.org/DPARSF）对fMRI数据进行预处理：（1）去除前10个时间点数据；（2）以中间层为参考层进行时间层校正；头动校正，剔除三维平移>2.0 mm、旋转角度>2.0^°的数据；（3）空间标准化，采用DARTEL分割算法将个体4D图像归一化至蒙特利尔神经研究所（Montreal Neurological Institute, MNI）标准空间，并将体素大小重采样至3 mm×3 mm× 3 mm；（4）空间平滑，以4 mm半高全宽高斯核进行平滑，提高图像信噪比。

       独立成分分析。基于GIFT工具包进行组水平的空间独立成分分析，首先利用主成分分析对预处理后的fMRI数据降维，得到150个主要成分，随后采用Informax算法对所有被试的数据进行独立成分（independent component, IC）估计，分离出100个ICs。为了保证结果的稳定性和可靠性，在ICASSO工具箱中重复运行Informax算法100次。最后利用逆向重构算法获得所有被试的时间序列和空间分布图。

       挑选网络成分。入选标准：（1）与Stanford functional ROIs模板高度相似；（2）激活峰值坐标位于灰质且与白质、脑室及脑边缘空间重叠度极低；（3）低频信号与高频信号比值较高。最终挑选出17个独立成分作为内在连接网络供后续分析，并根据解剖等先验知识将其分为6个静息态网络（resting-state networks），包括额顶网络（frontoparietal network, FPN）、听觉网络（auditory, AUD）、视觉网络（visual, VIS）、躯体运动网络（somatomotor network, SMN）、背侧注意网络（dorsal attention network, DAN）、默认模式网络（default‐mode network, DMN）。随后对入选的时间序列进行去漂移趋势（线性、二次、三次）、尖峰平滑、以0.15 Hz为高频截止阈值进行低通滤波，并回归6个头动参数。各网络空间分布见图1。

       dFNC分析。（1）设置滑动时间窗：采用滑动时间窗方法来构建动态功能网络，设置窗宽为60 s（75 TR）、高斯值δ=3 TR且步长为1 TR。随后使用图最小绝对值收敛和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）框架来计算正则化精度矩阵（逆协方差矩阵）；（2）聚类分析：使用K-means聚类方法和曼哈顿距离（Manhattan distance）函数（迭代100次）计算不同矩阵间的相似性，并通过Elbow法算出最优聚类数k=4，即4种FNC状态；（3）计算dFNC时间属性：平均停留时间（某种状态持续的平均时间，即时间窗口数）、时间分数（某种状态的时间窗数目与总时间窗数目的百分比）、转换次数（整个时间序列中不同状态的转换次数）。

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图1  将17个独立成分划分为6个内在网络空间图。图中显示的是听觉网络（AUD）、背侧注意网络（DAN）、默认模式网络（DMN）、额顶网络（FPN）、躯体运动网络（SMN）、视觉网络（VIS）。每个特定的颜色代表一个独立成分。
Fig. 1  Spatial maps of the 17 independent components sorted into six intrinsic networks. Shown here are the auditory network (AUD), dorsal attention network (DAN), default mode network (DMN), frontoparietal network (FPN), somatomotor network (SMN), and visual network (VIS). Each specific color represents an independent component.

1.4 统计学分析

       采用SPSS 21.0统计分析软件对受试者的一般资料、临床指标、认知评分及dFNC指标进行两独立样本t检验或Mann‐Whitney U检验，性别采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。基于GIFT工具包Stats模块，采用两独立样本t检验分析T2DM组和HC组不同状态内FNC矩阵的差异，以P<0.05（FDR校正）为差异有统计学意义。通过控制年龄和受教育年限，将dFNC的3个指标与患者的临床指标及认知评分进行Spearman偏相关分析。

2 结果

2.1 临床资料

       两组受试者在性别、年龄、受教育年限、BMI及MMSE评分方面差异均无统计学意义（P>0.05）。T2DM组MoCA量表评分低于HC组（P<0.05）。见表1。

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表1  T2DM组与HC组人口学、临床指标、神经心理量表评分比较
Tab. 1  Comparison of demographic, clinical indicators and neuropsychological scale scores between T2DM group and HCs group

2.2 聚类分析结果

       在rs‐fMRI信号采集时间内，共聚类出4个状态，每个状态表示不同功能网络具有不同的功能连接模式。图2中的4个功能连接矩阵分别显示了每个质心在信号采集时间内的占比及功能连接强度。

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图2  在群体水平通过K-means聚类（k=4，W=75 TR）识别的聚类状态。状态1（约68%）表示大规模脑功能网络连接普遍减弱；状态2（约8%）表示局部网络内或网络间功能连接减弱；状态3（约7%）和状态4（约16%）表示局部网络内或网络间功能连接增强。VIS：视觉网络；FPN：额顶网络；SMN：躯体运动网络；AUD：听觉网络；DAN：背侧注意网络；DMN：默认模式网络。
Fig. 2  The cluster states resulting from K-means clustering (k=4, W=75 TR) on the whole-group level. State 1 (about 68%) indicates that the connectivity of large-scale brain functional networks is generally decreased; state 2 (about 8%) indicates decreased functional connectivity within or between local networks; state 3 (about 7%) and state 4 (about 16%) indicate enhanced functional connectivity within or between local networks. VIS: visual network; FPN: frontoparietal network; SMN: somatomotor network; AUD: the auditory network; DAN: dorsal attention network; DMN: default mode network.

2.3 动态功能连接组间差异结果

       在状态1中，T2DM组与HC组相比，平均停留时间增多（t=2.086，P<0.05）；在状态3中，T2DM组与HC组相比，平均停留时间减少（t=-2.250，P<0.05），时间分数减低（t=-2.582，P<0.05），差异均有统计学意义（P<0.05），见图3。

       T2DM组与HC相比，仅在状态3中发现IC38（DMN）和IC43（VIS）功能连接减弱（t=-4.875，P<0.05，FDR校正），见图4。

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图3  2型糖尿病（T2DM）组与健康对照（HC）组每个状态下时变属性的差异。*表示差异有统计学意义（P＜0.05）。
Fig. 3  Differences in the temporal properties of per states for the type 2 diabetes mellitus (T2DM) and healthy control (HC) groups. Asterisks indicate a significant group difference (P＜0.05).

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图4  T2DM组与HC组动态功能连接的组间差异（t=-4.875，P＜0.05，FDR校正）。T2DM：2型糖尿病；HC：健康对照；VIS：视觉网络；FPN：额顶网络；SMN：躯体运动网络；AUD：听觉网络；DAN：背侧注意网络；DMN：默认模式网络。
Fig. 4  Differences in dynamic functional connectivity between T2DM and HC groups (t=-4.875, P＜0.05, FDR correction). T2DM: type 2 diabetes mellitus; HC: healthy control; VIS: visual network; FPN: frontoparietal network; SMN: somatomotor network; AUD: the auditory network; DAN: dorsal attention network; DMN: default mode network.

2.4 相关分析结果

       在控制年龄和受教育年限的前提下，Spearman偏相关分析显示仅T2DM组在状态1中的平均停留时间与病程呈正相关（r=0.42，P=0.0173），见图5。其他dFNC指标与临床指标及认知评分未发现相关性。

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图5  2型糖尿病患者在状态1中的平均停留时间与病程Spearman偏相关分析。
Fig. 5  Spearman correlation analysis of mean dwell time of state 1 and course of disease in type 2 diabetes mellitus patient.

3 讨论

       本研究利用独立成分分析确定了17个成分、6个静息态功能网络；随后基于滑动时间窗口技术以及K-means聚类估计了四种状态。通过分析各状态的特征，发现T2DM和HC组在状态1和状态3中的平均停留时间和时间分数存在显著差异。此外，在状态1中，T2DM患者病程与平均停留时间呈正相关；在状态3中，T2DM组DMN和VIS之间的连接减弱。本研究结果揭示了T2DM患者认知功能下降的潜在神经生物学基础。

3.1 dFNC脑活动状态分析

       本研究中状态1出现频率最高，其特征为大规模网络内和网络间连接减弱，WANG等^[7]将它称为“稀疏连接状态”，也有研究^{[13, 14]}认为这是人脑的基线连接模式。据推测，这种弱连接状态可能代表了大量可变性较小状态的平均值，被认为是一种更稳定的状态^[15]，与自我参照加工、嗜睡等认知行为有关^[16]，同时存在内感知意识增强和警觉性降低的特点^{[7, 17]}。此外，静息状态下功能连接是大脑不同区域之间进行信息传递的基础，对于这种反复出现的基线连接模式，它可能意味着人脑更倾向保持在一个信息传输效率较低的状态，以减少能量消耗^[14]。多项研究表明，精神分裂症^[8]、抑郁症^[9]、阿尔茨海默病^[10]及脑卒中^[7]患者均在“稀疏连接状态”中花费更多时间，说明这种状态与多种神经精神疾病的发生密切相关。与HC组相比，T2DM组在“稀疏连接状态”（状态1）中停留时间明显增加，反映了T2DM患者长期处于一个信息传输效率较低的状态，基于图论分析的研究^[18]也发现T2DM患者脑网络的全局和局部效率减低，对信息的整合和分化能力减弱。因此，状态1频率的增加可能是T2DM患者发生认知功能障碍的潜在机制。与本研究不同，LYU等^[11]发现T2DM和HC在状态1中花费的时间无明显差异，但在大规模强连接状态中的停留时间明显增加。通过分析，我们发现后者所纳入受试者的认知状态相对较好，这可能是强连接状态弥补了认知功能的衰退，进而使状态1保持稳定。虽然大脑这种适应性的功能代偿现象^{[19, 20, 21]}已被广泛报道，但今后仍需大规模的纵向研究或基础实验来进行论证。

       状态3不及状态1出现比例高，是一种“高度隔离的状态”，功能连接更加模块化^[22]。模块化是大脑正常发育过程中的趋势^[23]，较高的模块化基线值能有效预测经过认知训练或有氧运动等干预措施后的认知功能，因此模块化可能是与干预相关大脑神经可塑性的生物标志物^[24]。此外，模块化不仅涉及对认知训练的适应性^{[24, 25]}，还可能与认知功能和学习能力^[26]等有关，例如WANG等^[7]发现脑卒中患者状态3明显减少，使得功能隔离和模块化组织破坏，进一步导致患者的记忆恢复不良。先前多项研究也在神经精神疾病^{[27, 28, 29]}患者中发现异常的模块化组织，本文中T2DM患者在状态3停留时间减少，时间分数降低，与先前研究结果^[11]一致，这对今后探究T2DM早期认知功能减退的神经生理机制具有重要意义。

3.2 dFNC组间功能连接差异分析

       本研究发现T2DM组状态3中DMN和VIS之间的dFNC减弱。由于DMN在大脑进行任务活动时表现为抑制状态，它最初也被定义为任务消极网络^[30]，学界通常将其与休息时放松的精神状态相联系，比如做白日梦、精神漫游或大脑中与刺激无关的一些想法^[31]。与其他大脑区域相比，DMN的特征是在静息状态下具有更高的活动，构成了基本的意识体验^[32]，实例化了情绪处理^[33]、自我参照和对先前经历回忆的心理过程。最新研究表明^[34]，DMN对于整合外部和内部信息以及协调思想和行动同样至关重要。不同于DMN，任务积极网络在执行任务时激活，静息状态下抑制。不论是在激活还是静息状态，这两类静息态网络内及之间的正常连接模式仍然是维持正常认知功能的必要条件^[35]。HINDRIKS等^[36]最近发现，视觉皮层中的行波是协调任务积极和任务消极网络之间信息传播的核心因素，因此本研究中DMN和VIS之间的FC减弱则可能是导致T2DM患者认知功能障碍的重要神经机制。

3.3 相关性分析

       我们没有发现糖尿病相关的生物学指标（如HbA1c和FPG）以及认知功能评分与dFNC指标之间存在任何关系。需要注意的是，在糖尿病发展过程中，患者脑结构^[37]和功能^[38]损伤是缓慢进展的，这表明T2DM不同阶段的脑损伤模式是不一致的。我们推测，单一的相关模型无法描述不同糖尿病病程患者dFNC变化与糖尿病相关变量之间的关系，这可能是本研究未能发现相关性的原因，而在状态1中我们发现其停留时间与病程呈正相关，这在一定程度上也支持了我们的推测。T2DM认知功能障碍主要集中在记忆力、注意力、信息处理速度与执行功能等认知领域^[39]，而MMSE和MoCA评分只能从整体评估患者的认知状态，对精细认知功能改变的敏感性不高，进而我们难以发现T2DM患者dFNC指标与认知功能评分之间的相关性。

3.4 局限性

       本研究尚存在一些局限性：首先，小样本横断面研究难以体现结果的普适性。其次，我们没有考虑病程和降糖药物的影响，今后可以进行更细致的亚组分析，以评估它们对T2DM患者功能连接的影响。最后，我们没有发现dFNC指标与神经心理学评分的相关性，这可能是因为我们的认知测试不够详细；未来可以对T2DM患者进行更精细、全面的认知功能评估。

4 结论

       综上所述，本研究使用dFNC分析发现了T2DM患者的异常连接状态模式，主要以信息传递效率偏低的稀疏连接状态增加，功能连接更加模块化的强连接状态减少为主，揭示了大脑网络复杂多变的时变特征及活动形式，提示dFNC分析能捕获更多有关T2DM患者脑网络连接改变的潜在信息，有望为探究T2DM相关认知障碍的神经生物学机制提供新的见解。