0 引言

       动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）斑块破裂是心肌梗死和中风的主要原因^{[1, 2, 3, 4]}。斑块的不稳定性主要与斑块中的炎症反应、新生血管生成、出血、薄的纤维帽及钙化等有关，其中最主要的是炎症反应和新生血管^[5]。随着现代医学发展，AS的诊治水平明显提高，但是识别不稳定斑块仍是临床工作的一大挑战^[6]。研究发现，过度激活的RhoA/Rho激酶（Rho-kinase, ROCK）通路是促进斑块不稳定的重要因素。

       ROCK是小G蛋白家族RhoA的下游效应器，也是一种丝/苏氨酸激酶，通过磷酸化下游分子发挥调节作用^[7]。ROCK尤其存在血液循环中的炎症细胞和血管平滑肌细胞的细胞质内^[8]，静息状态下，形成自动抑制环，不发挥生物学作用^[9]。血液循环中氧化低密度脂蛋白^[10]、溶血磷脂酸^[11]、凝血酶^[12]等可激活内皮细胞中的RhoA/ROCK，高活性ROCK磷酸化下游分子，导致内皮炎性因子释放及炎细胞浸润^[13]，促进斑块不稳定。ROCK被激活后，促进中膜平滑肌细胞向内膜增殖迁移、表型转化以及维持高收缩力^[14]，导致斑块进展、血管重构及血管收缩痉挛。血管重构会增加血管壁张力，血管收缩痉挛诱导斑块爆破样破裂，导致心绞痛甚至心肌梗死^{[15, 16]}。总之，过度激活的ROCK会加剧斑块的不稳定性，诱发不良心脑血管事件。ROCK是AS负荷和急性冠脉综合征的潜在生物标志物^[17]，是合适的监测靶点。

       分子影像学可无创性监测细胞和蛋白质水平的病变。对不稳定斑块的特征（炎症、新生血管、出血钙化等）进行分子成像可实现在体无创监测量化。目前已经开发出p-选择素和黏附因子VCAM-1的双靶点探针^[18]、CD40双模态探针^[19]、profilin-1抗体纳米探针^[20]和VEGFR2的靶向转换纳米探针^[21]用于斑块中的炎症反应，血管平滑肌细胞和新生血管的MRI，并取得预期结果。MRI无电离辐射、多参数多序列成像及较高的软组织分辨率等，已成为一种理想的影像检查技术。超小超顺磁性氧化铁纳米粒子是有效的磁共振T2成像阴性对比剂，常用于AS斑块和肿瘤成像。

       关于靶向ROCK的分子影像学研究尚未见报道。本实验旨在探索斑块中ROCK1的表达，制备ROCK1靶向纳米探针，探索MRI可视化AS斑块的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

       实验组为载脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein-Edeficient, ApoE^-/-）雄性鼠（n=60）（北京维通利华动物技术有限公司），高脂饮食（含3%胆固醇和20%脂肪）（南京协同生物技术有限公司）。对照组为C57BL/6

       雄性鼠（n=20）（南京医科大学动物实验中心），普通饮食。两组小鼠置于相同的饲养环境。本研究获得南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（实验伦理编号：IACUC1909029-1）。

1.2 合成纳米探针

       称取150 mg DSPE-MPEG2000、50 mg DSPE-PEG2000-COOH，充分溶解于4 mL三氯甲烷中。加铁含量为10 mg的20 nm油酸修饰的Fe3O4纳米颗粒，超声充分混合；加4 mL去离子水，超声充分混合。在70 ℃水浴锅中旋转蒸发10 min，充分除去三氯甲烷，得到透亮的Fe3O4@PEG纳米颗粒水溶液。过220 nm滤膜除去团聚体。取360 μL的Fe3O4@PEG纳米颗粒水溶液，加96 μL ROCK1抗体及2 mL MES溶液，混合均匀。摇床150 rpm 4 ℃ 30 min，加200 μL乙基碳二亚胺盐，摇床150 rpm 4℃ 4.5 h。将反应好的溶液加入超滤管，放入离心机（4000 rpm，8 min）除去未结合抗体，获得Fe3O4@PEG-ROCK1靶向探针溶液。

1.3 表征及体外成像纳米探针

       透射电子显微镜（Jem-2100F，Jeol）观察纳米粒子的形态分布。纳米粒度电位仪（Nano ZS90，Malvern）测量两周内Zeta电位和水合粒径尺寸。振动样品磁强计（Lakeshore7407，美国Lakeshore公司）获得饱和磁化强度。紫外分光光度计（UV，3600 Shimadzu，日本岛津制作所）测量探针的紫外吸收波谱。

       用7.0 T磁共振扫描仪（Bruker，德国）测量Fe3O4@PEG-ROCK1的弛豫性能。将Fe3O4@PEG-ROCK1配制成等体积不同铁浓度的溶液，等量纯水作为对照，获得T1 mapping、T2 mapping值。铁浓度为横坐标，R1（R1=1/T1）、R2（R2=1/T2）为纵坐标，计算出曲线斜率r1、r2。采用T2-PDWI序列获得相应的加权图像。扫描序列与相应参数：T1 mapping，TR 800 ms，TE 11 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩阵256×256，翻转角1=90°，翻转角2=180°，层厚0.5 mm；T2 mapping，TR 2500 ms，TE 22 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩阵256×256，翻转角1=90°，翻转角2=180°，层厚0.5 mm；T2-PDWI，TR 2500 ms，TE 65、13 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩阵256×256，翻转角1=90°，翻转角2=180°，层厚0.5 mm。

1.4 免疫活性和细胞实验

       使用小鼠ROCK-1抗体酶联免疫分析试剂盒（YJ581147，上海，中国）检测Fe3O4@PEG-ROCK1免疫活性。设置四组，即纯抗体（n=3）、靶向探针（n=3）、非偶联探针（n=3）、煮沸后的靶向探针（n=3）。制作标准曲线计算样品中抗体浓度。

       采用MTT比色法检测Fe3O4@PEG-ROCK1探针的细胞毒性。使用细胞为鼠源性巨噬细胞RAW264.7细胞。探针浓度梯度为3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 µg/mL。每组设置6个复孔。

       采用普鲁士蓝染色观察RAW264.7细胞对探针的摄取。取两皿生长状态及密度相同的RAW264.7细胞，分别加入等量 Fe3O4@PEG-ROCK1与Fe3O4@PEG的培养基，孵育24 h后行普鲁士蓝染色，光学显微镜（eclipse Ci-e，日本尼康）观察细胞结合情况。

1.5 动脉粥样硬化中ROCK1表达和活性

       在第10、16、22、28、34周，随机挑选ApoE^-/-鼠（n=5），测量小鼠体质量及制备腹主动脉ROCK1免疫染色切片。使用Image J软件测量斑块中ROCK1表达的平均光密度。蛋白印迹检测主动脉ROCK1活性。Rho激酶主要磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（Myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1）为p-MYPT1^[19]，因此两者比值代表Rho激酶的相对活性，计算公式：Rho激酶的相对活性=p-MYPT1蛋白表达量/MYPT1蛋白表达量。方法如下：选取喂养34周的ApoE^-/-鼠（n=5）和C57BL/6鼠（n=5），过量麻醉处死，取出腹主动脉（长约1.5 cm），通过蛋白印迹检测MYPT1（22117-1-AP，Proteintech Group，武汉，中国）和p-MYPT1（AF5445，Affinity Biosciences，美国）蛋白的表达。

1.6 体内MRI

       34周的ApoE^-/-鼠分两组，组1尾静脉注射Fe3O4@PEG（n=10），组2注射尾静脉注射Fe3O4@PEG-ROCK1（n=10）。剂量为10 mg/kg。注射纳米探针前及注射后8、16 h分别进行扫描。使用7.0 T磁共振扫描仪直径为38 mm单通道容积线圈。双回波T2-PDWI序列参数：TR 2500 ms，TE 65、13 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩阵256×256，翻转角1=90°，翻转角2=180°，层厚0.5 mm，层间距为0 mm，扫描时间30 min。最后一次扫描结束后安乐死处死小鼠，取出腹主动脉标本。

       使用Image J软件测量斑块信号强度。平扫时动脉壁中最高的信号被指定为斑块。在平扫、8 h、16 h图像的相同层面的相同位置勾画相同大小的感兴趣区域，测出信号强度。使用对比噪声比表示相对信号强度。对比噪声比=（斑块组织中动脉壁信号-血液信号）/噪声。噪声由背景空气中像素强度的标准偏差表示^[22]。

1.7 组织化学

       将腹主动脉标本进行石蜡包埋切片（4 μm）。免疫染色用于定位ROCK1蛋白，普鲁士蓝染色用于氧化铁颗粒（纳米磁性颗粒）可视化。

1.8 统计学分析

       所有数据均使用平均值±标准差表示。使用SPSS 27.0进行统计学分析，使用GraphPad Prism 9软件绘制统计图。样本量根据既往课题组经验及文献搜索确定。符合正态分布的数据进行参数检验，两组间的比较使用独立样本或配对样本t检验，多组间的比较使用ANOVA检验，不符合正态分布的数据使用非参数检验，两组间的比较使用Mann-Whitney U检验，多组分析使用Kruskal-Wallis检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米探针的表征

       电镜图像显示Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1为黑色球形颗粒，均匀稳定地分散在溶液中，无团聚（图1A~1B）。两周内Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1的粒径和峰值Zeta电位保持稳定，且两者差异均具有统计学意义[粒径（27.06±1.52）nm vs.（30.52±2.95）nm，U=3.000，P=0.015；电位（-35.18±0.31）mV vs.（-16.60±3.26）mV，U=0.000，P=0.002]（图1C~1D）。Fe3O4@PEG紫外吸收峰为225 nm，连接ROCK1抗体后Fe3O4@PEG-ROCK1紫外吸收峰为253 nm（图1E），以上这些数据表明ROCK1抗体与Fe3O4@PEG 成功偶联，保持良好稳定性。

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图1  Fe3O4@PEG纳米颗粒（1A）和Fe3O4@PEG-ROCK1纳米颗粒（1B）的电镜图像，比例：20 nm。两周内测定Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1的水合粒径（1C）、Zeta电位（1D），及紫外吸光度（1E）。ROCK：Rho相关激酶。
Fig. 1  The scanning electron micrographs of Fe3O4@PEG nanoparticles (1A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 nanoparticles (1B), scale: 20 nm. The hydrated particle size (1C), Zeta potential (1D), and ultraviolet absorbance (1E) of Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1 are measured within two weeks. ROCK: Rho-kinase.

2.2 免疫活性和细胞实验

       巨噬细胞吞噬实验结果显示，Fe3O4@PEG-ROCK1组细胞内可见少量蓝色氧化铁颗粒，而Fe3O4@PEG组细胞内见大量蓝色氧化铁颗粒。说明靶向探针Fe3O4@PEG-ROCK1较Fe3O4@PEG可以降低巨噬细胞内吞作用（图2A~2B）。

       细胞毒性实验显示，一定铁浓度范围内，细胞存活率在80%以上，表明靶向探针在一定的浓度内无毒性（图2C）。

       酶联免疫吸附实验显示，各组免疫活性如下：纯抗体组（n=3）0.54±0.01，Fe3O4@PEG-ROCK1组（n=3）0.52±0.02，煮沸Fe3O4@PEG-ROCK1组（n=3）0.27±0.00，Fe3O4@PEG组（n=3）0.24±0.01。纯抗体组与靶向探针的免疫活性差异无统计学意义（H=1.667，P=0.571）,靶向探针与非靶向探针的免疫活性差异有统计学意义（H=6.667，P=0.024），以上结果证明ROCK1抗体与Fe3O4@PEG偶联后，仍保持抗体活性（图2D）。

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图2  巨噬细胞吞噬实验。2A、2B分别为Fe3O4@PEG、Fe3O4@PEG-ROCK1与巨噬细胞共孵育后行普鲁士蓝染色，蓝染颗粒为铁纳米，比例：100 μm；2C为不同铁浓度下Fe3O4@PEG-ROCK1的细胞存活率；2D为Fe3O4@PEG-ROCK1纳米颗粒的免疫活性。^*表示P<0.05。
Fig. 2  Macrophage phagocytosis test. Fe3O4@PEG (2A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 (2B) are incubated with macrophages and performed prussian blue staining, the blue particles are iron nanoparticles, scale: 100 μm. 2C is cell viability of different iron concentrations of Fe3O4@PEG-ROCK1. 2D is the immunological activity of Fe3O4@PEG-ROCK1. ^*denotes P<0.05.

2.3 体外MRI

       Fe3O4@PEG-ROCK1的r1=0.364 mM^-1s^-1，r2=162.271 mM^-1s^-1，r2/r1=446，表明靶向探针可以显著缩短T2弛豫时间，具有良好的T2弛豫性能。T2-PDWI图像显示，随着铁浓度的增加，溶液信号强度逐渐减低，对比明显（图3A~3B）。靶向探针的饱和磁化强度为0.086 8 T，磁化曲线过原点，说明探针具有超顺磁性（图3C）。这些结果表明Fe3O4@PEG-ROCK1是良好的磁共振阴性对比剂。

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图3  MRI等体积不同铁浓度的Fe3O4@PEG-ROCK1的图像（3A）、Fe3O4@PEG-ROCK1弛豫曲线（3B）、Fe3O4@PEG-ROCK1磁化曲线（3C）。
Fig. 3  MRI are performed on equal volumes of Fe3O4@PEG-ROCK1 with different iron concentrations (3A), the relaxation curve of Fe3O4@PEG-ROCK1 (3B) and the magnetization curve of Fe3O4@PEG-ROCK1 (3C).

2.4 动脉粥样硬化中的ROCK1的表达和活性

       APOE^-/-鼠体质量明显增加，明显高于C57BL/6健康鼠，差异有统计学意义[（31.54±0.46）g vs.（28.89±0.44）g，U=0.000，P<0.001](图4)。ROCK1免疫染色显示，随着斑块增大，ROCK1的阳性表达区也增大，主要分布在斑块的肩部、内膜下及坏死炎症区（图5B~5E）。皮尔逊相关性分析（图5A）显示ROCK1的表达与斑块面积呈正相关（n=30）（r=0.959，P<0.001）。蛋白印迹（图6A~6B）显示，晚期AS小鼠血管组织（n=10）中ROCK1活性明显高于健康鼠（n=10）（0.30±0.02 vs. 0.24±0.02，U=1.000，P<0.001）。以上这些数据表示随着AS进展，ROCK1蛋白的表达量及活性增加。

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图4  不同周龄ApoE^-/-小鼠和C57BL/6鼠的体质量（g）。
图5  斑块中ROCK1阳性表达面积对应的平均光密度值（5A）及不同周龄ApoE^-/-小鼠腹主动脉斑块切片的ROCK1免疫染色（图5B~5E）。5B~5E对应16、22、28、32周，比例：100 μm。
Fig. 4  Weight of ApoE^-/- mice and C57BL/6 mice at different weeks (g).
Fig. 5  Mean optical density values of ROCK1 expression in plaques (5A) and ROCK1 immunohistochemical images of abdominal aorta of ApoE^-/- mice at different weeks (5B-5E). 5B-5E correspond to 16、22、28 and 32 weeks, respectively. Scale: 100 μm.

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图6  蛋白印迹及其统计图。6A：ApoE^-/-鼠和健康C57BL/6鼠的主动脉ROCK1活性的蛋白印迹图。C4~C5：C57BL/6鼠，M11~M13：ApoE^-/-鼠；6B：蛋白印迹测得的P-MYPT1/MYPT1的统计图，p-MYPT1/MYPT1表示ROCK1活性。***表示P<0.001。MYPT1：肌球蛋白磷酸酶靶亚基1。
Fig. 6  Western blots and their statistical plots. 6A: Western blot of ROCK1 activity in ApoE^-/- mice and C57BL/5 mice. C4-C5: C57BL/6 mice, M11-M13: ApoE^-/- mice; 6B: Statistical plot of P-MYPT1/MYPT1 measured by western blot. P-MYPT1/MYPT1 indicates ROCK1 activity. *** indicates P<0.001. MYPT1: myosin phosphatase target subunit 1.

2.5 体内MRI和组织学结果

       如图7, 8, 图9所示，注射纳米探针前，Fe3O4@PEG组（n=10）和Fe3O4@PEG-ROCK1组（n=10）小鼠斑块信号强度差异无统计学意义（8.25±1.39 vs.7.81±3.22，t=-1.680，P=0.099）。注射纳米探针后，两组斑块信号强度均下降，与Fe3O4@PEG组（n=10）相比，Fe3O4@PEG-ROCK1组（n=10）斑块信号降低更明显（8 h，5.37±1.79 vs. 3.91±2.26，U=392.000，P=0.001）（16 h，6.68±2.39 vs. 4.61±2.80，U=463.000，P=0.001），8 h最明显，斑块内可见片状信号丢失区域。普鲁士蓝染色显示斑块内有蓝色铁颗粒沉积，Fe3O4@PEG-ROCK1组（n=10）多于Fe3O4@PEG组（n=10）（0.54±0.02 vs. 0.34±0.01，U=36.000，P=0.002），且主要分布斑块的内膜下和坏死区域。免疫组化主要用于蛋白的定位，ROCK1表达阳性区域与普鲁士蓝中的探针沉积区域对应。

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图7  两组小鼠注射Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1的磁共振图像。
Fig. 7  Magnetic resonance images of mice injected with Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1.

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图8  两组的普鲁士蓝染色图和免疫组化图。
图9  两组小鼠的斑块信号强度的统计图（9A）及斑块中普鲁士蓝沉积量（9B）。^**P＜0.01。
Fig. 8  Prussian blue staining and immunohistochemical staining of the two groups of specimens.
Fig. 9  Plaque signal intensity (9A) and prussian blue deposition in the plaques (9B) of the two groups of mice. ^**P<0.01.

3 讨论

       本实验首先建立AS模型小鼠，采用免疫组化及蛋白印迹分析ROCK1在斑块中的表达及活性。其次制备及表征Fe3O4@PEG-ROCK1。最后将Fe3O4@PEG-ROCK1用于AS斑块的可视化MRI。关于ROCK作用的研究主要在细胞水平，本研究发现ROCK1在斑块中高表达和高活性，证明靶向探针联合MRI实现在体检测斑块中ROCK1活性可行。

3.1 选择ROCK1作为成像靶点

       大量研究表明，ROCK活性增高会引起血管收缩痉挛、促炎因子释放、炎症细胞募集，加重炎症反应，加剧斑块的不稳定性^[23]。本实验发现，ROCK1在AS中呈高表达及高活性，在斑块中主要分布在内膜下、肩部和坏死区域，与ROCK1在斑块中的促炎症坏死作用有关。GAO等^[24]证明ROCK活性增高会导致内皮功能障碍、加剧炎症反应。CHEN等^[25]的一项颈动脉斑块基因研究表明，与炎症和免疫反应相关的中心基因是Rho GTP酶激活蛋白。既往研究表明，ROCK基因缺陷小鼠心血管疾病发病率减少^[26]，靶向抑制ROCK表现出一定的治疗效果^[27]，提示ROCK是AS的潜在治疗靶点，也是合适的成像靶点。

3.2 评价Fe3O4@PEG-ROCK1作为靶向探针和阴性对比剂

       MRI阴性对比剂一般以超顺磁性氧化铁物质为主，能缩短组织的T2弛豫时间，减低信号^[28]。本研究在USPIO表面修饰油酸和PEG，能增加稳定性和延长体内循环时间^[29]。Fe3O4@PEG与ROCK1抗体偶联，制成功能化探针Fe3O4@PEG-ROCK1，使其定向结合ROCK1分子，增加目标区域结合量。这与既往研究中靶向探针制备方法类似^[30]。巨噬细胞的内吞作用是营养物质清除、免疫监视和治疗药物递送的关键调节途径，可影响纳米探针的稳定性及靶向成像效果。本实验中，巨噬细胞对Fe3O4@PEG-ROCK1的摄取远低于Fe3O4@PEG，说明Fe3O4@PEG-ROCK1可下调巨噬细胞的吞噬清除，进而更好地结合靶点，发挥成像作用。但是WEN等^[31]制备的氧化低密度脂蛋白的靶向探针被泡沫细胞大量吞噬，QIU等^[28]制备的黏附因子的靶向探针被巨噬细胞大量吞噬，可能是靶向分子在细胞中分布不同。黏附因子和氧化低密度脂蛋白分别在巨噬细胞和泡沫细胞中大量表达，而ROCK与体内多种细胞作用发挥调控功能。

       生物相容性是纳米探针应用临床的重要参数^[32]。Fe3O4@PEG-ROCK1稳定性良好，两周之内粒径尺寸和电位无明显波动，电镜图显示分布均匀，无团聚。ROCK1抗体连接到Fe3O4@PEG表面仍保持免疫活性。细胞毒性实验显示一定铁浓度范围内Fe3O4@PEG-ROCK1的细胞存活率在80%以上。Fe3O4@PEG-ROCK1的弛豫值为162.3 mM^-1s^-1，优于目前大部分的磁性材料^[29]，是良好的分子探针和MRI对比剂。

3.3 评价Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1体内成像

       Fe3O4@PEG无特异性，在斑块中的沉积量取决于巨噬细胞的非特异性吞噬^[29]，磁共振信号改变反映斑块中的炎症反应。而Fe3O4@PEG-ROCK1定向结合斑块及血管壁中的ROCK1分子，信号改变反映ROCK1含量，鉴于ROCK1在AS发生发展以及预后中的重要作用，靶向ROCK1成像有利于ROCK1活性的精准体外监测。相关研究表明靶向探针在目标区域的沉积量可以达到四倍^{[33, 34]}。本实验中，对比8、16 h斑块信号，Fe3O4@PEG-ROCK1组较Fe3O4@PEG组信号下降更明显，说明Fe3O4@PEG-ROCK1在斑块及血管壁中沉积量更多。Fe3O4@PEG组斑块信号在16 h时增加，可能是Fe3O4@PEG在体内被巨噬细胞快速地非特异性地吞噬代谢，继而导致斑块信号的快速变化。WU等^[35]研究表明小鼠巨噬细胞Fe3O4-NPs的摄取在8 h达到最大值，在12~24 h内细胞内含量下降，可能与细胞的胞吐作用有关。

3.4 斑块ROCK1分子靶向MRI的临床价值

       本研究是第一项针对ROCK1的分子影像学研究，证明了在体监测斑块的 ROCK1活性的可行性。这有助于识别不稳定斑块、评估斑块生物学特性，有利于实现高危斑块的早期识别及危险事件的早期预防诊治。不稳定斑块与薄纤维帽、大的脂质核心、炎症反应、新生血管、钙化等相关^[5]。既往类似研究靶向特异性分子反映不稳定斑块某一方面，如血管内皮生长因子在维持和调控血管的形成及血管新生等生理过程发挥重要作用，相关的靶向磁共振信号改变反映新血管生成的情况^[21]。P-选择素和黏附因子是参与内皮细胞介导的炎症反应过程的重要因子，信号改变反映斑块炎症活性^[18]。ROCK与不稳定斑块的因素密切相关，靶向ROCK成像更能反映斑块的综合信息。

3.5 研究的局限性

       本实验研究还需进一步完善：第一，实验所用的样本量较少，可能导致结果可靠性下降，应扩大实验样本量进行下一步验证；第二，没有研究ROCK抑制剂的治疗作用以及相关MRI，补充这一部分能进一步验证本文的研究结果且对靶向探针的临床应用有更直观的展示；第三，靶向探针在体内循环时间更长可能会产生毒性及进一步改善探针的生物相容性和降低毒性。

4 结论

       本研究构建靶向探针Fe3O4@PEG-ROCK1，该探针稳定性好，特异性强，保持良好生物活性和磁敏感性。Fe3O4@PEG-ROCK1可在体监测斑块中ROCK1的表达，有利于高危斑块的风险预测和无创监测。