0 引言

       肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一种罕见病，其特征是肺血管阻力的增加^[1]。PAH典型的动脉病变包括新生内膜形成、内膜纤维化以及平滑肌细胞增生^[2]。持续的动脉病变会引起右心室后负荷增加，进而导致右心室重构以适应过高的肺动脉压^[3]。由于右心室是右心功能的主要承担者，其结构和功能是预测PAH预后的重要因素^[4]。因此，目前对于PAH继发的心脏功能改变大量研究仅关注右心室^[5]。实际上，左右心室共同位于空间有限的心包内、共用一个室间隔、被共同的心肌纤维所包绕，两者在结构和功能上相互依存^[6]。PAH发生后右心室收缩时间延长会导致室间隔向左移位进而阻碍左心室充盈^[7]。MA等^[8]的研究测量了结缔组织病相关PAH患者的左心室舒张功能，结果表明左心室舒张功能参数可用于指导治疗。目前有多种PAH动物模型用于基础研究领域，主要分为药物诱导和非药物诱导。其中药物诱导PAH动物模型是通过皮下注射野百合碱（monocrotaline, MCT）^[9]，非药物诱导则以手术的方式建立模型。MCT诱导的PAH大鼠模型最为经典，其优势在于时间成本低、操作简便、重复性好。

       硒是一种微量元素，其具有抗氧化和抗炎等属性^[10]。与此同时，硒作为硒蛋白的重要组成部分，参与了机体众多的生理功能^[11]。一项研究揭示了硒蛋白在PAH发病机制中的作用，证实其可以作为一种新的生物标志物和治疗靶点^[12]。正常生理条件下适度提高血清中硒含量有利于心血管健康^{[13, 14]}，而硒缺乏常导致克山病的发生^[15]。临床实践过程中，最常采用亚硒酸钠（sodium selenite, SE）作为补硒制剂^[16]。近年来，已有研究报道SE通过诱导铁死亡、下调丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1）的表达发挥抗肿瘤特性^{[17, 18]}。ABEDELAHI等^[19]的研究表明SE能够通过减少活性氧的产生、增强谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）的活性进而提高机体抗氧化能力。一项先前的研究发现，通过灌胃补充不同剂量的SE，可以缓解MCT诱导的PAH^[20]。然而，针对PAH的大多数研究^{[21, 22, 23]}都是在平原环境中进行的，而不是在高原。高原最突出的地理气候特征是低氧，低氧会引起肺血管收缩进一步加剧PAH的诱发^[24]。因此，虽然SE能够缓解PAH，但其在实际的高原低氧环境中的适用性和效果，以及SE对高原低氧环境下PAH后左心室功能的作用有待进一步研究阐明。与常见的1.5 T或3.0 T磁共振成像相比，7.0 T磁共振成像可以提供更多的技术优势，主要包括：更高的时间和空间分辨率、良好的信噪比，及高质量的血管成像^[25]。得益于影像技术的进步，心脏磁共振（cardiac magnetic resonance, CMR）成像已经成为评估心脏结构和功能的金标准^[26]，利用其组织追踪（tissue tracking, TT）技术可以为心脏结构、功能和心肌力学检测提供早期无创的方法^[27]。本研究利用CMR-TT技术评估SE在高原低氧环境下对PAH后左心室功能的影响，同时辅以病理染色和血清生化检测进行初步的机制探索。本研究将为临床评估和管理高原低氧环境下PAH继发的左心室功能损伤提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 实验主要药品

       MCT（纯度95%，CAS，315-22-0）、SE（纯度99.0%，CAS，10102-18-8）购置于Sigma Aldrich 公司（中国，上海）；4%多聚甲醛溶液购置于四川爱德科技有限公司；TUNEL染色试剂盒（E-CK-A325，中国，武汉）购置于伊莱瑞特生物科技公司；生化检测试剂盒（E-BC-K020-M，中国，武汉）购置于艾尔生生物科技有限公司。

1.2 实验动物及处理

       本研究经过四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准，批准文号：20231219007。所有大鼠均饲养在室温（23±2）℃、湿度55%±5%、可自由获取饮用水和食物、12 h光照/黑暗循环和通风良好的环境中。于-20 ℃的冰箱中取出MCT，并用电子天平（Sartorius，BSA323S-CW，德国）称取0.4 g的MCT晶体，充分溶解于40 mL的溶剂中（无水乙醇∶生理盐水=1∶4）。实验中所使用的MCT溶液均现用现配。46只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6~8周龄,平均体质量180~220 g）购置于成都达硕实验动物有限公司，于第二日从成都（海拔500 m）陆运至青海省玉树州高原动物实验室（海拔4250 m），并将所有的大鼠随机分为对照组（n=10）、模型组（MCT组，n=20）和治疗组（SE组，n=16）。高原低氧环境下饲养28周，对照组注射与模型组相等量的生理盐水，而MCT组和SE组大鼠则一次性腹腔注射60 mg/kg的MCT建立PAH模型。一周后，SE组给予0.7 mg/kg SE灌胃一个月，而对照组和MCT组正常饲养一个月。干预完成后将所有大鼠运回成都。随机从三组中各选取8只大鼠进行CMR成像以评估左心室功能、应变及T2弛豫时间。最后，取材大鼠左心室和血液样本进行病理和生化检测。

1.3 实验仪器

       7.0 T磁共振成像仪（Bruker，BioSpec 70/30 USR，德国）。扫描前的准备工作简化如下：（1）使用呼吸麻醉机（Midmark公司，MATRX VIP3000，美国）麻醉大鼠后，将其俯卧于检查台上，使心脏置于表面线圈中心；（2）在大鼠前肢和左后肢皮下植入三个心门控电极并用医用胶带固定；（3）呼吸门控放置于大鼠腹部呼吸最明显的部位；（4）将加热垫放置于大鼠体表以维持扫描过程中体温的恒定。CMR成像序列包括心脏快速小角度激发（fast low angle shot, FLASH）电影序列和T2 mapping 序列，以评估左心室功能、应变和T2弛豫时间，FLASH电影序列的具体参数如下：翻转角20°、视野50 mm×50 mm、重复时间8 ms、回波时间2.5 ms、层间距1.5 mm、层厚1.5 mm、矩阵（192×192）、分辨率0.26×0.26 mm/pixel、层数8~10。使用T2 mapping序列对心脏基底部、心中部、心尖部三个层面进行了成像，成像参数如下：重复时间1200 ms，回波时间8 ms、层数3，层厚1.5 mm，矩阵192×192，视野50 mm×50 mm，激发角90°。扫描过程中待大鼠心电稳定后，记录每只大鼠的心率和呼吸频率。

1.4 CMR图像分析

       CMR图像分析由一名具有7年工作经验和中级职称的实验工程师完成。将DICOM图像导入CVI42分析软件（CVI42，v5.1.1，加拿大）中。在心脏长轴和短轴图像上定义左、右心室舒张末期和收缩末期后，从心底到心尖逐层勾画心内膜和心外膜。勾画完成后，软件自动计算心室心功能和左心室应变参数，包括左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）、左心室收缩末容积（left ventricular end-systolic volume, LVESV）、左心室舒张末容积（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）、左心室每搏输出量（left ventricular stroke volume, LVSV）、右心室舒张末期容积（right ventricular end-diastolic volume, RVEDV）、右心室收缩末期容积（right ventricular end-systolic volume, RVESV）、右心室每搏输出量（right ventricular stroke volume, RVSV）、右心室射血分数（right ventricular ejection fraction, RVEF）、左室整体纵向应变（left ventricular global longitudinal strain, LVGLS）、左心室整体周向应变（left ventricular global circumferential strain, LVGCS），及左心室整体径向应变（left ventricular global radial strain, LVGRS）。对于T2 mapping序列，选取4个无伪影的感兴趣区分别测量心脏基底部、心中部、心尖部三个层面，并计算所有测量值的均数以量化反映心肌水肿的T2弛豫时间（图1）。

       outlined, respectively, while the small circles in 1C represent region of interest.

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图1  应用心脏磁共振组织追踪技术获取各组大鼠左心室功能和应变参数。1A：心脏短轴位；1B：心脏长轴位；1C：量化T2弛豫时间。1A、1B中的绿线和红线分别是勾画的心外膜和心内膜；1C中的小圈代表感兴趣区。
Fig. 1  The left ventricular function and strain parameters of rats in each group are obtained by cardiac magnetic resonance tissue tracking technology. 1A: Short axis of heart; 1B: Long axis of heart; 1C: Quantify the T2 relaxation time. The green and red lines in 1A and 1B represent the epicardium and endocardium outlined, respectively, while the small circles in 1C represent region of interest.

1.5 血生化检测

       完成CMR成像后，采集大鼠血液样本进行生化检测。血液样本在3000 rpm的转速下离心15 min获得血清，并用生化试剂盒（Elabscience，E-BC-K020-M，中国，武汉）测定氧化应激相关指标，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、GSH-Px和丙二醛（malondialdehyde, MDA）。

1.6 病理HE染色

       取材大鼠新鲜心脏和肺组织置于10%的多聚甲醛溶液（四川爱德科技有限公司，E672002-0050，中国，成都）中固定24 h以上，然后用不同浓度梯度的乙醇（科隆化学品有限公司，中国，成都）脱水，脱水后嵌入石蜡，将蜡块放在石蜡切片机上切成3 μm厚度的切片并染色。最后使用软件（CaseViewer，4.2，德国）分析图像，以评估PAH模型是否诱导成功及SE的疗效。

1.7 TUNEL染色

       使用原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotice transferase mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）评估左心室心肌细胞凋亡情况。将TUNEL染色获得的融合图像导入Image J（1.8.0，美国）分析软件中。然后对图像进行处理并计算各组大鼠左心室心肌细胞凋亡的相对荧光强度。同时将得到的相对荧光强度相对于对照组进行归一化处理后进行统计分析。

1.8 统计学分析

       统计分析软件采用GraphPad（9.5.1，美国）。正态分布数据表达为均数±标准差，否则以中位数（P25，P75）表示。正态性检验用Shapiro-Wilk检验，方差齐性检验用Bartlett检验。对于满足正态分布并且方差齐的数据，组间差异比较采用单因素方差分析，否则视情况采用Kruskal-Wallis H非参数检验或Welch方差分析，多重比较采用Dunnett-t检验。检验水准（α）定为0.05。

2 结果

2.1 体质量、心率和呼吸频率评估

       与MCT组[体质量（542.25±64.00）g]相比，经过SE干预一个月的SE组大鼠体质量[（565.50±54.00）g]有所增加。但是，对照组、MCT组和SE组大鼠在体质量、心率和呼吸频率方面的差异均不具有统计学意义（P>0.05），详见表1。

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表1  三组大鼠体质量、心率、呼吸频率及血清SOD、GSH-Px、MDA水平
Tab. 1  The body weight, heart rate, respiratory rate and serum SOD, GSH-Px and MDA levels in three groups of rats

2.2 血生化评估

       各组大鼠血清中SOD、GSH-px和MDA水平如表1所示。对照组和MCT组大鼠的GSH-Px值差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，MCT组大鼠血清中的MDA增加（P<0.05）。上述结果提示MCT组大鼠抗氧化能力下降，出现了氧化应激损伤。相较于MCT组，SE组大鼠血清中SOD和GSH-Px的水平有所升高（P均<0.05），而MDA的水平有所降低（P<0.05），提示经SE治疗可以提高抗氧化能力、缓解氧化应激损伤。

2.3 左心室功能评估

       相较于对照组，MCT组的LVEF和LVGCS降低（P均<0.05），提示PAH发生后左心室功能存在一定程度的损伤。而SE干预扭转了这一趋势，具体表现为SE组的LVEF、LVGRS和LVGCS相较于MTC组明显提高（P均<0.05）。总之，SE干预能在一定程度上提升PAH后左心室功能，详见表2。

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表2  三组大鼠的心室心功能、左心室应变和左心室T2弛豫时间
Tab. 2  The ventricular cardiac function, left ventricular strain and left ventricular T2 relaxation time in three groups of rats

2.4 左心室病理评估

       肺组织苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, HE）染色表明，相较于对照组大鼠，MCT组肺动脉管壁明显增厚、中层平滑肌明显增生。这表明本研究在高原低氧条件下成功建立了MCT诱导的PAH大鼠模型。左心室HE染色表明，MCT组左心室心肌细胞胞浆出现了少量空泡化。然而，SE组未见上述病理改变，提示SE干预能减轻PAH后的左心室损伤，具体详见图2。

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图2  三组大鼠肺组织（2A~2C）和左心室（2D~2F）的病理苏木精-伊红（HE）染色（HE ×40）。2A：对照组大鼠肺组织HE染色；2B：模型组大鼠肺组织HE染色；2C：治疗组大鼠肺组织HE染色；2D：对照组大鼠左心室HE染色；2E：模型组大鼠左心室HE染色；2F：治疗组大鼠左心室HE染色（黑箭代表肺动脉和心肌细胞胞浆内空泡形成）。
Fig. 2  The pathological Hematoxylin-Eosin (HE) staining of lung tissue (2A-2C) and left ventricle (2D-2F) in three groups of rats (HE ×40). 2A: HE staining of lung tissue in control group rats; 2B: HE staining of lung tissue in model group rats; 2C: HE staining of lung tissue in treatment group rats; 2D: HE staining of the left ventricle in control group rats; 2E: HE staining of the left ventricle in model group rats; 2F: HE staining of the left ventricle in treatment group rats (the black arrow indicates the pulmonary artery and cardiomyocyte intracytoplasmic vacuolation).

2.5 左心室心肌细胞凋亡评估

       TUNEL免疫荧光染色显示，与对照组大鼠相比，MCT组大鼠左心室的相对荧光强度显著增高（P<0.001），而SE处理后使治疗组的TUNEL染色相对荧光强度较MCT组明显降低（P<0.001）（图3）。这提示SE对MCT诱导PAH后大鼠左心室心肌细胞的凋亡具有保护作用。

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图3  各组大鼠左心室凋亡免疫荧光染色（×40）。蓝色为正常心肌细胞核，红色为凋亡的心肌细胞核。3A：对照组凋亡染色；3B：模型组凋亡染色；3C：治疗组凋亡染色；3D：各组大鼠左心室凋亡染色相对荧光强度的统计结果，C：对照组；MCT：模型组；SE：治疗组。MCT：野百合碱；SE：亚硒酸钠。^****表示P<0.001差异具有统计学意义。
Fig. 3  The apoptotic staining of left ventricle in each group of rats (×40). The blue signifies the nuclei of normal myocardial cells, while red denotes the nuclei of apoptotic myocardial cells. 3A: Apoptotic staining of the control group; 3B: Apoptotic staining of the model group; 3C: Apoptotic staining of the treatment group; 3D: Statistical results of the relative fluorescence intensity of apoptotic staining in the left ventricle of rats in each group, C: control group; MCT: model group; SE: treatment group. MCT: monocrotaline; SE: sodium selenite. ^**** indicates a statistically significant difference at P<0.001.

3 讨论

       本研究应用7.0 T磁共振成像技术研究了MCT诱导PAH大鼠的心室功能改变，并在此基础上采用SE进行相关干预。结果发现，相较于对照组，MCT组大鼠左心室功能受损，表现为LVEF和LVGCS降低，而SE治疗后明显提升了左心室功能和应变。借助血清生化检测和病理染色，实验也探索了SE疗效的相关机制。本研究首次提出在高原低氧环境下SE可缓解PAH继发的左心室功能损伤，这可能为临床治疗提供潜在新方法。

3.1 构建PAH大鼠模型

       出于操作的考虑，本研究不同于以往大多数研究所采用的经大鼠颈背部皮下注射MCT建立PAH模型^[28]，而是通过腹腔注射的方式。这种方式很大程度上提高了操作的简便性。实验过程中，定期观察了各组大鼠的一般情况包括体质量、摄食、饮水等，结果发现模型大鼠在注射MCT 2周后逐渐出现食欲缺乏、体质量降低，这可能与PAH的形成有关。不同于先前研究中所使用的MCT溶液配制方式^[29]，本研究将MCT充分溶解于含有无水乙醇和生理盐水的溶剂（无水乙醇∶生理盐水=1∶4）中。右心导管技术直接测量平均肺动脉压是判断PAH模型是否成功的金标准^[30]，但是由于实验开展期间正值新型冠状病毒疫情，加之高原条件的限制，本研究只能通过病理来判断模型建立情况。肺组织HE染色表明：相较于对照组，模型组的肺动脉管壁明显增厚、中层平滑肌明显增生，这与以往研究^[31]结果一致。总之，本研究在高原低氧环境下成功建立了PAH大鼠模型。

3.2 SE与PAH后左心室功能

       目前，PAH尚缺乏有效的治疗手段。对于PAH的研究大多数在平原进行^{[32, 33, 34, 35]}，而本研究则在高原低氧环境构建MCT诱导的PAH模型。同时利用CMR-TT在心脏方面的优势探讨SE在青藏高原低氧环境下对PAH后左心室功能的影响。本研究对各组大鼠均进行了常规的心脏FLASH电影序列扫描，同时也进行了T2 mapping序列的采集。电影序列可提供心室结构、功能和应变等相关信息，而T2 mapping序列可定量心肌T2弛豫时间以此反映心肌水肿情况^{[36, 37, 38]}。上述两种序列可为临床评估PAH后心室功能异常提供参考信息。本研究发现，相较于对照组大鼠，MCT组大鼠的LVEF和LVGCS有所降低（P<0.05），提示PAH发生后左心室功能在一定程度上受到影响，这可能与低氧暴露、疾病自身所引起的右心室后负荷增加相关。其他团队的研究证实肺PAH患者相较于正常对照人群存在LVGLS降低^{[39, 40]}，而本研究发现MCT诱导PAH形成后LVGCS同样存在降低。此外，本研究还探索性地利用SE干预进而发现其可以在高原低氧环境下提升PAH后左心室功能，具体表现为：SE组的LVEF、LVGRS和LVGCS得到提高。这可以为高原环境下PAH引起的左心室功能降低的治疗提供参考依据。本研究还定量了各组大鼠左心室T2弛豫时间，但差异无统计学意义，可能的原因在于检测时间点的选取未在最佳范围内。

3.3 SE与氧化应激和左心室凋亡

       本研究取样了大鼠心脏组织，对左心室进行了病理HE和TUNEL染色。结果表明，与对照组相比，模型组大鼠左心室局部心肌细胞胞浆内出现少量空泡化、左心室心肌细胞凋亡增加，提示高原低氧环境下MCT诱导PAH形成后左心室功能的改变可能涉及多个病理过程和机制。SOD和GSH-Px作为内源性抗氧化酶反映机体抗氧化能力^[41]，而MDA则是活性氧介导脂质过氧化生成的一种不饱和醛类物质，它可以反映氧化应激损伤^[42]。本研究中给予SE干预缓解了左室上述病理改变，结合血生化检测结果SE组呈现出SOD和GSH-Px升高、MDA降低，本研究推测这可能与SE提升大鼠抗氧化能力、缓解氧化应激损伤相关。

3.4 局限性

       当然，本研究存在如下局限：（1）未能在药物诱导PAH形成后，纵向评估左心室功能变化；（2）未能深入探讨SE提升左心室功能的具体信号通路；（3）未及时检测各组大鼠血清硒含量；（4）由于高原地区实验条件的限制，虽然所有大鼠运回成都后本研究在尽可能短的时间内进行了检测，但脱离低氧环境对实验结果的影响依然存在。

4 结论

       综上所述，本研究在高原低氧环境下成功构建了MCT诱导的PAH大鼠模型，初步探索了SE对PAH继发左心室功能不全的改善作用及其潜在机制。结果显示，SE干预显著提升了PAH大鼠的左心室功能，这一作用可能与其提高抗氧化水平、抑制心肌细胞凋亡有关。尽管存在未纵向评估左心室功能变化、未测定血清硒含量及高原实验条件的限制等局限性，但为治疗高原环境下PAH引起的左心室功能损伤提供了新策略和见解。