0 引言

       层级结构是人类大脑组织的基本原则，从单一功能的感觉运动皮层到多功能的联合皮层的层级结构，从形态结构上支持了大脑从感觉到认知的信息整合和分化的功能表现^[1]。近年来，磁共振成像技术为无创地评估大脑的形态结构和功能组织提供了有力的工具^{[2, 3]}。既往的研究中，功能网络被定义为具有相似特征且彼此紧密相连的大脑区域组成的离散实体。这种方法假设不同功能域之间具有明确边界，且在给定网络内的功能是同质的，这在一定程度上有助于对脑功能组织的理解。最近，新发展的梯度分析方法通过对静息态功能磁共振成像（resting state functional magnetic resonance imaging，rsfMRI）中基于血氧水平依赖自发性低频波动的时间相关性构建的功能连接进行非线性分解，捕获全脑功能连接模式的变化，以连续层级的方式来描述脑功能网络。相较于将功能网络划分成具有明确边界的空间区域，基于梯度的方法捕捉了功能域渐进的变化和总体空间关系，更进一步地揭示了这些功能域如何进行分层组织所凭借的关键特征：功能层级结构^[4]。

       基于梯度方法生成的功能连接梯度提供了对功能连接体的描述，即每个体素根据其功能连接模式沿此连接梯度进行定位，具有相似功能连接模式的体素沿给定连接梯度相互靠近。由此，不同的功能模块沿连接梯度分布排列，反映了宏观水平上沿单一功能（如视觉、感觉运动等）的初级皮层到多功能处理的联合皮层的脑功能的分层组织，即功能层级结构。目前，连接梯度作为大脑组织功能层级结构的简约表示，已用于分析多种精神疾病大脑皮层的功能层级结构^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]}，在孤独症、抑郁症、精神分裂症等脑疾病中均发现了功能层级结构的异常变化，并且连接梯度指标能够在一定程度上预测疾病的行为表型分数和严重程度。

       阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种涉及感觉整合、记忆处理和高级认知异常的多种脑功能障碍的神经退行性疾病，其中认知功能障碍是AD的核心症状。既往的研究已经证明涉及大脑额叶、颞叶、顶叶以及枕叶的多个区域存在功能和结构的紊乱^{[12, 13, 14]}。人们对小脑参与脑部疾病作用的逐步深入理解已经从单纯运动处理发展到小脑涉及了高级认知和情感处理^[15]，并鉴于大脑皮层与小脑在解剖学和功能上存在密切连接^{[16, 17]}，部分研究开始聚焦AD的脑-小脑通路，强调了脑-小脑的连接障碍可能部分决定AD患者的认知功能损伤。目前，基于种子点的功能连接研究结果发现AD患者背外侧前额叶皮层、前扣带皮层和右侧颞下回与小脑双侧Crus I区、楔前叶与小脑左侧Ⅶ B区的功能连接减弱、大脑皮层外侧颞叶区与小脑齿状核之间存在超连接，改变的连接强度和特定的认知症状相关，包括记忆和整体认知呈正相关^{[18, 19, 20]}；在更大尺度的功能网络中，研究结果显示出AD患者小脑各亚区分别与大脑皮层中默认网络（default mode network, DMN）、额顶控制网络、边缘网络、感觉运动网络以及视觉网络的特定亚区间呈现出不同程度的功能连接异常，例如ZHENG等^[21]发现双边CrusⅡ区域与DMN中右侧海马旁回、视觉网络中左侧枕中回区域以及小脑Ⅸ区域与感觉运动网络中的中央前回和中央后回的功能连接显著降低，并与简易精神状况检查表（Mini-Mental State Examination, MMSE）、日常生活量表评分呈显著的正相关；QI等^[22]则发现健康对照（health controls, HC）小脑边缘网络在位于大脑皮层边缘网络中的右侧扣带回皮层、右舌回与的功能连接性减少，而与左颞极功能连接性增加，和MMSE评分呈显著的相关性；PAGEN等^[23]的研究显示小脑和大脑DMN网络的功能连接性的降低与记忆相关的认知功能有关。以上研究发现表明，在AD患者中与小脑相互作用的大脑皮层可能存在从感觉到认知处理区较广泛的功能系统异常。采用梯度分析方法构建脑-小脑连接梯度可以用于解释AD患者与小脑相互作用的大脑功能系统异常以及其与症状的关系。目前，AD患者的这种脑功能层级结构是否存在异常尚不明确，未见相关研究报道。

       综上，本研究使用基于梯度的方法生成脑-小脑连接梯度，用于探索AD患者大脑皮层的功能层级结构，并进一步结合功能连接的方法探索了功能层级结构异常变化区域与小脑相互作用的区域连接机制，尝试从新的角度解释AD的认知功能受损机理。研究分为三部分内容：首先，基于rsfMRI数据构建大脑皮层和小脑的功能连接矩阵，使用梯度方法框架计算脑-小脑的连接梯度，探索分析AD患者的功能层级结构；其次，以梯度异常脑区作为种子点，分析该异常区域与小脑的功能连接；最后，通过临床量表的相关性分析，探讨大脑皮层组织的功能层级结构及其与小脑相互作用的异常和认知的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究所有数据资料均是从阿尔茨海默病神经影像学计划（Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative，ADNI）（http://adni.loni.usc.ed）公开数据库获取。通过ADNI数据库网站的标准申请程序下载了84名被试的影像和临床资料，剔除了5名被试（3名被试头动过大和2名小脑信息缺失），最终使用了79名被试进行后续脑功能分析实验，其中AD组为33例，HC组46人。ADNI数据库设立遵守《赫尔辛基宣言》，纳入的被试均已签署知情同意书。ADNI 协议用于确定受试者是否被纳入的标准如下。HC组纳入标准：（1）MMSE评分在24~30分之间，临床痴呆评分（Clinical Dementia Rating, CDR）为0。AD组纳入标准：MMSE评分<24分，CDR评分为0.5~2.0分（痴呆严重程度）。两组共同的排除标准：有脑梗、脑病或其他神经精神疾病。

1.2 数据获取

       使用磁场强度为3.0 T的Philips磁共振扫描仪获得所有被试的静息态扫描数据，扫描参数为：TR 3000 ms；TE 30 ms；FA 80°；数据矩阵为64×64，层数为48层，每层图片扫描层厚为3.31 mm，体素大小为3.31 mm×3.31 mm×3.31 mm，时间点数为140，扫描时间为420 s。扫描过程中要求所有被试放松、闭眼且不进行系统性思考。

       除此之外，本研究还整理了所有被试对应的量表信息：性别、年龄、MMSE评分、CDR评分和社会活动功能评定量表（Functional Activity Questionnaire, FAQ）评分，具体信息见表1。

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表1  AD组和HC组间基本临床信息
Tab. 1  Characteristics of Alzheimer's disease patients and healthy controls

1.3 数据预处理

       在Matlab2013b中运行RESTplus_V1.2工具^[24]对静息态fMRI数据进行预处理。具体预处理流程如下：（1）去除每个被试采集数据的前10个时间点；（2）时间层校正，设置中间层设为参考层，将每层的扫描时间校正到同一扫描时间点上；（3）头部运动校正，将序列的每一张帧图像对齐到第一帧图像，剔除了头部运动过度且位移超过2 mm或沿任何方向旋转角度大于2°的被试；（4）空间归一化，使用平面回波成像模板对所有被试校正后的图像配准到蒙特利尔神经学研究所（Montreal Neurological Institute, MNI）标准空间，并将体素大小重采样到3 mm×3 mm×3 mm；（5）去线性漂移和回归协变量，去除扫描期间产生的趋势信号，并去除头动参数、白质信号、脑脊液等干扰信号；（6）滤波，使用带通滤波器（0.01~0.10 Hz）过滤。除此之外，为了降低计算量，本研究将所有数据的大脑皮层顶点降采样到4 mm，并与传统的基于顶点的功能连接一样，在预处理中不进行空间平滑^[25]，而是计算出连接梯度后进行平滑处理（6 mm）。

1.4 功能连接梯度计算与分析方法

       首先根据灰质模板分别提取了大脑皮层和小脑每个体素的时间序列信息，并采用皮尔逊相关构建所有被试大脑皮层和小脑之间的功能连接矩阵（18 814×6323），为了提高功能网络的正态性，对得到的功能连接进行Fisher-z变换，并保留连接强度为前10%的功能连接；使用余弦距离生成一个相似度矩阵，这个矩阵代表了每一对体素之间的连接模式的相似性，最后通过扩散图嵌入技术来捕获梯度分量，这些连接梯度分量解释了功能连接模式的方差。为了保证AD组和HC组的可比性，需要将每个被试得到的连接梯度对齐，即使用所有被试计算平均功能连接矩阵，并生成组级的连接梯度模板，然后使用迭代Procrustes旋转将每个被试得到的连接梯度与该模板对齐。为了提高可靠性、可重复性和可解释性，我们仅使用了第一梯度分量（主梯度）进行分析。主梯度解释了尽可能多的方差（25%）^{[4, 26]}，将其映射脑皮层空间显示出了沿初级皮层到联合皮层的功能层级结构。具体梯度计算方法见图1。

       采用一般线性模型对AD组和HC组连接梯度的梯度分数进行比较，并回归年龄、性别协变量。最后，采用高斯随机场（Gaussian Random-Field, GRF）多重比较校正，且统计学阈值设定为体素水平P<0.001，团块水平P<0.05^[27]。

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图1  脑-小脑连接梯度计算方法示意图。
Fig. 1  The computational method diagram of cerebral-cerebellar connectivity gradient.

1.5 以梯度异常脑区为种子点的功能连接分析

       基于梯度异常脑区的峰值坐标使用DPABI_V6.1^[28]对其周围半径为6 mm的球体，生成球形模板，并以此皮质区域作为种子点，通过皮尔逊相关构建了种子点到小脑各体素的连接矩阵。

       采用SPM对统计图进行双样本t检验，并回归年龄、性别协变量。最后，采用GRF多重比较校正，且统计学阈值设定为体素水平P<0.001，团块水平P<0.05^[27]。

1.6 连接梯度、功能连接与临床量表的相关性分析

       分别检查了AD患者连接梯度异常脑区的梯度分数以及基于种子点分析的异常的功能连接值与临床变量之间的关系。首先根据异常脑区的MNI峰值点为坐标周围为6 mm半径的球体，生成球形模板，使用DPABI_V6.1^[28]提取连接梯度异常区域的梯度分数和功能连接值，并采用Spearman相关分析检查AD组异常区域的梯度分数、功能连接值与临床量表MMSE、FAQ、CDR评分之间的相关性，控制年龄和性别，统计显著性水平设置为P<0.05。

1.7 受试者基本临床信息

       本研究纳入了AD组33名，HC组46人。AD组与HC组临床量表信息的对比见表1。AD组与HC组在年龄和性别上差异均无统计学意义，临床量表MMSE、FAQ、CDR评分存在显著组间差异。

2 结果

2.1 AD患者脑-小脑连接梯度的改变

       在AD和HC中，脑-小脑的功能连接梯度均显示出沿初级皮层逐渐过渡到联合皮层的分层组织（图2）。这与大脑的主梯度类似，与之前的一些报道是一致的^{[7, 26]}。相对于HC组，AD组在右侧颞下回（right inferior temporal gyrus, RITG）的梯度分数显著增加（表2，图3）。

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图2  脑-小脑的功能连接梯度。2A：HC组的功能连接梯度；2B：AD组的功能连接梯度。AD：阿尔茨海默病；HC：健康对照。
Fig. 2  Cerebral-cerebellar functional connectivity gradient. 2A: Functional connectivity gradient of healthy control (HC) group; 2B: Functional connectivity gradient of Alzheimer's disease (AD).

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图3  AD组和HC组的连接梯度差异。AD：阿尔茨海默病；HC：健康对照。
Fig. 3  Differencs of connectivity gradient between Alzheimer's disease (AD) and healthy control (HC) group.

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表2  AD组和HC组间连接梯度分数差异
Tab. 2  Function connectivity gradient scores abnormalities between AD and HC

2.2 基于梯度异常脑区的功能连接分析

       以RITG作为种子点与小脑的功能连接的分析发现，相较于HC组，AD组的RITG与双侧小脑CrusⅡ以及小脑后叶双侧（Ⅶ B）的功能连接减弱（表3，图4）。没有发现AD组较HC组显著增加的连接。

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图4  功能连接梯度异常脑区与小脑的功能连接差异。
Fig. 4  Differences between the abnormal regions of functional connectivity gradient and cerebellum.

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表3  AD相对于HC组基于种子点的功能连接的异常脑区
Tab. 3  Seed-based functional connectivity abnormalities between AD and HC group

2.3 梯度异常脑区的梯度分数、基于种子点的功能连接值与临床量表之间的相关性

       对AD组梯度异常脑区的梯度分数与临床变量之间相关性检查发现RITG梯度分数与FAQ评分（r=0.40，P=0.025）呈显著的正相关（图5），而与MMSE和CDR评分之间无显著相关性。对AD组RITG与小脑的功能连接差异值与临床MMSE、FAQ和CDR评分之间相关性检查没有发现显著相关性。

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图5  AD组RITG的梯度分数与FAQ评分的相关性。AD：阿尔茨海默病；RITG：右侧颞下回；FAQ：社会活动功能评定量表。
Fig. 5  Correlation of gradient scores of right inferior temporal gyrus (RITG) with Functional Activity Questionnaire (FAQ) scores in Alzheimer's disease (AD).

3 讨论

       本研究通过使用一种新提出的基于梯度的分析方法，检查了AD患者大脑皮层各顶点沿脑-小脑连接梯度的分布及其变化，即功能层级结构变化。结果表明，AD患者显示出与HC相似的功能层级组织，遵循沿初级皮层（图2蓝色区域）到联合皮层（图2黄色和红色区域）的排列。对AD组和HC组进行基于顶点的梯度分数比较，发现涉及高级认知处理局部区域的连接梯度发生改变。以AD患者连接梯度异常区域RITG为种子点，进行其与小脑的功能连接分析，发现AD组RITG与小脑的功能连接降低。临床量表相关性分析显示，AD患者梯度异常区域的梯度分数与FAQ评分显著正相关。

3.1 AD患者的功能连接梯度异常

       相对于HC组，AD组RITG的梯度分数增加（图3和表2所示）。颞下回（inferior temporal gyrus, ITG）是DMN网络的重要脑区，主要参与高级认知功能，包括视觉辨认、语言理解、决策及情绪调节^[29]。该区域与枕内侧回和颞中回一起被认为是AD中第一个受影响的颞叶新皮质部位^[30]。既往AD的研究中，RITG多次被报道，在微观层面，研究发现与认知密切相关的多种神经递质如多巴胺、胆碱能在AD患者的RITG中表现失衡^[31]以及RITG突触的丧失可能是认知功能障碍潜在基础^[32]；在宏观层面，LI^[33]、WAN等^[34]和DAI等^[35]均发现了在RITG中存在与AD患者认知功能受损相关的结构改变，同时一些研究也发现在编码新任务或识别先前学习的项目的任务中，AD患者RITG的功能活性以及一致性明显低于正常人，并与MMSE呈正相关^{[36, 37]}。以上的研究发现表明RITG的异常改变与AD患者的认知功能受损有关。ITG是整合和协调来自其他皮层区域信息的重要汇聚区^[38]，本研究发现AD患者RITG的梯度异常增加，表明RITG与大脑其他区域的功能连接模式的相似性发生了变化，并且沿脑-小脑功能连接梯度排列的位置升高，与感觉运动、视觉、听觉等初级皮层的距离更远，而与更高级的认知区域之间的距离更近，这可能导致汇聚和整合来自初级皮层区域的信息的能力减弱，与高级认知区域的分离性降低，继而引起AD患者在ITG涉及的面部识别、记忆，语义理解等多种认知功能受损。

       临床相关分析显示出RITG的梯度分数与AD患者FAQ评分呈正相关（图5），表明在更严重的功能障碍患者中RITG的梯度分数更高。FAQ评分间接反映了AD患者的认知功能^[39]。因此，本研究发现的AD患者RITG梯度分数的增加可能是AD患者在涉及面部识别、记忆功能及语义理解等多方面出现认知功能受损的潜在因素之一。

3.2 梯度异常脑区与小脑的功能连接分析

       针对梯度异常脑区的进一步功能连接分析显示，AD患者种子点到小脑的功能连接降低主要发生在RITG与小脑双侧CrusⅡ脑区，并延伸到小脑后叶双侧的Ⅶ B区域之间。CrusⅡ和Ⅶ B区域均位于小脑的后叶，是小脑重要的认知区域，对于认知表征至关重要^{[40, 41, 42]}。其中，CrusⅡ区域已被发现连接到大脑DMN网络的关键节点，包括颞叶、顶叶、海马皮层，并且与其在功能上耦合^{[42, 43, 44]}，参与各种语言、工作记忆和执行等认知功能，被认为是小脑的DMN网络^[42]。DMN网络被认为是AD患者最脆弱的一个网络，目前的研究指出小脑DMN网络亚区Ⅸ、CrusⅡ以及CrusⅠ与大脑DMN亚区间功能连接的丧失与认知功能下降显著相关^{[21, 43, 45]}，例如Ⅸ与左侧颞下回、后扣带，CrusⅡ与颞中回、内侧额回以及额上回，CrusⅠ脑区与背外侧前额叶皮层、前扣带回皮层都呈现出功能连接性降低。另外，在一项研究中发现大脑DMN网络和小脑DMN网络呈负连接性，这种连接性在轻度认知障碍患者中降低，破坏DMN网络的平衡，导致更差的记忆相关的认知功能^[22]。与CrusⅡ脑区类似，ITG也同时作为大脑DMN网络的重要组成部分^[46]，本研究发现的ITG和CrusⅡ脑区功能连接的降低可能是导致认知功能障碍的潜在原因之一。小脑Ⅶ B区主要负责视觉工作记忆任务的空间编码^[47]，同时也被发现在复杂的执行功能任务以及情绪处理期间被激活^{[48, 49]}，以往的研究也发现Ⅶ B区域与DMN网络中对侧楔前和楔之间发现了减弱的功能连接^[18]。ITG是视觉辨认、情绪调节重要的脑区，因此Ⅶ B与颞下回的功能连接减少可能涉及AD患者视觉记忆以及情绪等相关认知功能的损伤。此外，既往研究也提出小脑可能参与了一种稳态机制，通过小脑到大脑皮质通路自下而上地调解高级认知功能，限制了认知功能的下降^{[50, 51]}。这种自下而上的调解通过保持脑-小脑DMN网络的功能平衡，微调我们的行为和认知功能^[23]。有研究表明小脑后叶病变影响小叶Ⅵ和Ⅶ（包括CrusⅠ、CrusⅡ和Ⅶ B）时，破坏小脑对大脑关联皮质的认知回路的调节^[52]，就会发生认知障碍;另有研究表明AD患者的小脑后叶的功能活性降低，导致小脑参与脑-小脑DMN网络中认知和情绪调节的能力降低，并影响了认知网络间的功能平衡^[53]。由此，本研究推测AD患者ITG与小脑CrusⅡ脑区以及Ⅶ B区的功能连接的减弱，可能降低了小脑参与脑-小脑DMN网络在认知调解中的能力，从而导致脑-小脑DMN网络功能平衡被破坏，引起认知功能受损。

3.3 本研究的不足之处

       首先，我们的研究是一个横断面的研究，需要进行纵向研究以揭示AD疾病进展中脑-小脑的连接梯度变化，才能进一步确定在AD患者的不同患病时期大脑各区域沿脑-小脑连接梯度的变化机制。其次，需要纳入不同的AD类型，进一步研究AD前驱期和更严重时期的连接梯度变化，研判连接梯度是否可以作为诊断或预测疾病严重程度候选的生物标志物。最后，本研究临床相关性分析并没有发现异常区域与认知MMSE评分之间的相关性，一方面可能是由于我们局限于群体差异的区域分析，而样本量较少可能限制了分析的结果，另一方面也可能由于MMSE评分是一种综合性认知评估，不能反映特定认知领域的损害，因此之后还需要基于更多的样本研究脑-小脑连接梯度的变化与AD患者特定认知功能之间的关系。

4 结论

       本研究通过使用一种新提出的梯度分析方法对AD患者的脑-小脑连接梯度进行了研究。研究结果提供了AD患者大脑区域沿脑-小脑连接梯度分布的变化的证据，即大脑功能层级结构的局部性变化，并且这种层级结构的局部性变化以及脑-小脑DMN网络功能连接的减弱可能是AD患者认知功能受损的潜在因素。最后，本研究通过脑-小脑连接梯度分析发现的大脑功能层级结构局部性异常为通过大脑和小脑的相互作用来理解AD的神经机制提供了一种新的观点。