0 引言

       胶质瘤是成人最常见的原发性颅内恶性肿瘤^[1]。2021年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类在分子层面将胶质瘤分为异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）野生型和突变型^[2]。Ki-67是一种主要由MKI67基因编码的核蛋白抗原，在细胞增殖中起着至关重要的作用。该蛋白在细胞周期的G1、S、G2和M期显著表达，在静息状态（G0）不表达^[3]。正常大脑中Ki-67表达水平非常低，较高的Ki-67水平与肿瘤的不良预后密切相关。研究表明，Ki-67指数（labeling index, LI）与胶质瘤患者生存期呈负相关，截断值定为20%^[4]。IDH野生型胶质瘤Ki-67 LI多为高表达（即Ki-67 LI≥20%），肿瘤恶性程度高，预后差。然而，Ki-67 LI只能通过术后活检病理证实，这种方法有创且价格昂贵，耗时长，由于胶质瘤的高异质性，很难获得完整的肿瘤组织信息，目前仍缺乏有效的无创性术前预测因子。

       常规MRI仅能反映病灶的形态特征及强化形式，本研究综合采用先进的成像技术如动态对比磁共振成像（dynamic contrast-enhanced, DCE）、扩散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）、氢质子磁共振波谱（¹H magnetic resonance spectroscopy, ¹H-MRS）等无创地评估Ki-67 LI，同时更进一步地反映肿瘤微血管特征，如血管增殖和血管壁的破坏等，更加真实地反映肿瘤的病理生理状态^{[5, 6]}。既往研究表明，MRI特征对Ki-67 LI的无创性术前预测有潜在的临床价值。XING等^[7]通过DWI和动态磁敏感增强灌注成像（dynamic susceptibility contrast-enhanced perfusion-weighted imaging, DSC-PWI）无创性评估Ki-67 LI在胶质瘤分级中的作用，但单一的血流灌注参数易受到血脑屏障破坏及药代动力学影响，导致结果存在一定误差。DU等^[8]仅利用单一模态DWI证明ADC值与Ki-67 LI呈负相关。JIANG等^[9]通过DCE-MRI证实K^trans和Ve与胶质瘤Ki-67 LI显著相关，截断值K^trans（0.079 min^-1）和Ve（0.249）的结合为区分Ki-67 LI提供了最佳的敏感性和特异性。上述研究均仅采用一种或两种扩散及灌注成像技术，本研究基于常规MRI，联合应用DWI、DCE以及MRS多种磁共振模态，得到多个定量及定性参数，建立有效预测模型，无创性评估胶质瘤Ki-67表达水平，获得了多个有效术前预测因子，对评估肿瘤恶性程度、制订早期诊疗方案及改善患者预后都有重要的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       回顾性分析2017年1月至2022年12月于南京大学医学院附属鼓楼医院行MRI检查及手术治疗的胶质瘤患者。本研究纳入标准如下：（1）手术切除且病理证实WHO 2~4级胶质瘤；（2）已知IDH突变状态和Ki-67表达水平；（3）术前常规行T1WI、T2WI、T2液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery, FLAIR）序列、T1加权对比增强（T1 contrast enhanced, T1CE）、DWI、DCE及¹H-MRS扫描；（4）一般临床信息（性别、年龄、囊变程度、组织学分级、病灶数目、强化程度）完整。排除标准：（1）序列不完整；（2）图像质量不佳；（3）术前接受过其他治疗或伴有其他神经系统疾病，如脑梗死或出血。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并经南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会批准（批文号为：NCT05624736），免除受试者知情同意。

1.2 检查方法

1.2.1 仪器设备

       本研究中的患者数据采集机器包括Philips Ingenia CX 3.0 T磁共振成像仪（配套32通道头颅线圈）及联影uMR790 3.0 T磁共振成像仪（配套32通道头颅线圈）；对比剂包括钆双胺注射液（欧乃影，GE Healthcare公司），对比剂注射流速及用量：3.5 mL/s，0.2 mL/kg。扫描序列包括T1WI、T2WI、T2-FLAIR、T1CE、DWI（b=0，1000 s/mm²）、DCE及¹H-MRS。扫描相关参数详见表1。

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表1  MRI 参数
Tab. 1  The parameters of MRI

1.2.2 图像处理方法

       采用双盲法，结合常规MRI序列（T1WI、T2WI、T2-FLAIR、T1CE）评估病灶数量、囊变程度、增强程度等常规影像特征（表2），在肿瘤强化程度最高的区域选取10~15 mm²的圆形作为感兴趣区（region of interest, ROI），并自动同步在ADC图、¹H-MRS及DCE所有参数图中，采用Philips和United Imaging后处理工作站对ADC值、DCE参数及¹H-MRS进行分析，图像一致性良好。DCE获得的定量参数包括转运常数（volume transfer constant, K^trans）、渗出速率常数（the rate constant, Kep）、血管外细胞外容积分数（fractional volume of the extravascular-extracellular, Ve）、血浆分数（plasma fraction, Vp）、MRS的代谢产物比值包括胆碱/N-乙酰天门冬氨酸（Cho/NAA）、胆碱/肌酸（Cho/Cr）、N-乙酰天门冬氨酸/肌酸（NAA/Cr）。Ki-67低表达和高表达胶质瘤患者及其参数图见图1、2。根据前期研究^[10]将时间-强度曲线（time-intensity curve, TIC）分为三种类型（图3）。所有MRI图像由神经影像亚专科组的一位具有20年工作经验的副主任医师和另一位具有7年工作经验的主治医师进行分析。

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图1  女，27岁，经手术病理证实为低级别胶质瘤（WHO 3级），Ki-67约为15%。1A：T1CE；1B：K^trans；1C：Kep；1D：Ve；1E：Vp；1F：iAUC；1G：TIC。
图2  男，57岁，经手术病理证实为胶质母细胞瘤（WHO 4级），Ki-67约为50%。2A：T1CE；2B：K^trans；2C：Kep；2D：Ve；2E：Vp；2F：iAUC；2G：TIC。T1CE：T1对比增强；K^trans：转运常数；Kep：渗出速率常数；Ve：血管外细胞外容积分数；Vp：血浆分数；iAUC：血糖增量的曲线下面积；TIC：时间-强度曲线。
Fig. 1  A 27-year-old woman with low-grade glioma (WHO Grade 3) confirmed surgically and pathologically with Ki-67 of about 15%. 1A: T1CE; 1B: K^trans; 1C: Kep; 1D: Ve; 1E: Vp; 1F: iAUC; 1G: TIC.
Fig. 2  A 57-year-old man with glioblastoma (WHO Grade 4) confirmed surgically and pathologically with Ki-67 of about 50%. 2A: T1CE; 2B: K^trans; 2C: Kep; 2D: Ve; 2E: Vp; 2F: iAUC; 2G: TIC. T1CE: T1 contrast enhanced; K^trans: volume transfer constant; Kep: the rate constant; Ve: fractional volume of the extravascular-extracellular; Vp: plasma fraction; iAUC: area under the curve of the blood glucose increment; TIC: time-intensity curve.

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图3  时间-强度曲线分型。Ⅰ型表现为逐渐增强；Ⅱ型表现为早期快速增强，后期为平台期；Ⅲ型表现为早期快速增强，后期快速减退。
Fig. 3  Time-intensity curve types. Type Ⅰ shows gradual enhancement; Type Ⅱ shows rapid enhancement in early stage and plateau stage in late stage; Type Ⅲ shows rapid enhancement in the early stage and rapid decline in the late stage.

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表2  常规影像特征分析
Tab. 2  Analysis of conventional image features

1.3 免疫组化检测Ki-67表达水平

       本研究采用的标本先用10%的甲醛溶液进行固定，显微镜观察后严格选择HE染色。使用免疫组织化学SP法，使用免疫组化试剂盒（具体操作方法严格依据说明书）进行操作。结果判读的依据为肿瘤染色密度最高的区域中，每500~1000个细胞中免疫反应阳性细胞核的百分比，阳性细胞的细胞核为棕黄色。Ki-67细胞阳性率<20%为低表达，Ki-67细胞阳性率≥20%为高表达。

1.4 统计学分析

       本研究采用IBM SPSS 26.0进行统计学分析，采用Shapiro-Wilk test验证连续分布数据的正态性，采用卡方检验、独立样本t检验或Mann-Whitney U检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。选取组间比较有差异的临床特征、定量及定性参数进行单因素logistic回归，将单因素回归中有意义的变量纳入多因素回归进行分析。最后采用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析多参数对Ki-67表达水平的诊断效能，并得出曲线下面积（area under the curve, AUC）。采用组内相关系数（intra-class correlation, ICC）检验评价两名医师对ADC值和DCE参数计算的一致性，后计算参数的平均值。

2 结果

       本研究共入组330例胶质瘤患者作为研究对象，其中IDH野生型201例（60.90%），IDH突变型129例（39.10%）。两名医师对ADC值和DCE参数计算的ICC值在0.804~0.923之间。

2.1 胶质瘤患者临床资料、病理和参数特征的组间比较（表3）

       胶质瘤患者临床资料、病理和参数特征的组间比较见表3。Ki-67高表达胶质瘤患者比低表达患者年龄大（57 vs. 49，P<0.001）。两组在性别分布上差异无统计学意义（P=0.243）。Ki-67高表达在IDH野生型胶质瘤中要多于IDH突变型（82.1% vs. 17.9%，P<0.001）。Ki-67高表达组的胶质瘤分级（90.9% vs. 28.5%，P<0.001）、囊变程度（70.5% vs. 28.5%，P<0.001）、强化程度（91.8% vs. 43.1%，P<0.001）、病灶数目（19.3% vs. 6.5%，P=0.001）均高于低表达组。Ki-67高表达组中Ⅲ型TIC曲线多见于低表达组（34.3% vs. 33.3%，P<0.001）。在MRI定量参数中，Ki-67高表达患者的NAA/Cr（0.740 vs. 0.680，P<0.001）、Cho/Cr（2.520 vs. 1.860，P<0.001）、K^trans（0.196 vs. 0.074，P<0.001）、Ve（0.210 vs. 0.034，P<0.001）、Vp（0.008 vs. 0.004，P<0.001）均高于Ki-67低表达患者。Ki-67高表达患者的ADC值（0.945 vs. 1.160，P<0.001）和Kep（0.342 vs. 0.541，P<0.001）低于Ki-67低表达患者。两组Cho/NAA值差异无统计学意义（P=0.074）。

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表3  胶质瘤患者临床资料、病理和参数特征的组间比较
Tab. 3  Comparison of clinical data, pathological and parametric characteristics of gliomas

2.2 胶质瘤患者单因素和多因素logistic回归分析结果

       胶质瘤患者临床资料、病理和参数特征的单因素及多因素逻辑回归结果见表4。单因素分析中，年龄（OR=1.053，P<0.001）、病灶数目（OR=3.443，P=0.002）、囊变程度（OR=6.018，P<0.001）、强化程度（OR=14.761，P<0.001）、ADC值（OR=0.997，P<0.001）、TIC Ⅱ型（OR=7.225，P<0.001）、TIC Ⅲ型（OR=2.709，P<0.001）、Cho/Cr（OR=1.186，P=0.014）、NAA/Cr（OR=1.549，P=0.039）、K^trans（OR=1.011，P<0.001）、Kep（OR=0.999，P<0.001）、Ve（OR=1.005，P<0.001）、Vp（OR=1.022，P=0.005）是Ki-67表达水平的预测因素。在多因素分析中，K^trans（OR=1.012，P<0.001）、ADC值（OR=0.998，P=0.003）、强化程度（OR=3.317，P=0.027）是Ki-67表达水平的独立预测因素。该预测模型的AUC为0.893。模型的ROC曲线如图4所示。

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图4  胶质瘤患者Ki-67表达水平预测模型受试者工作特征曲线。
Fig. 4  Receiver operating characteristi curve of Ki-67 expression level prediction model in gliomas.

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表4  胶质瘤患者临床资料、病理和参数特征的逻辑回归分析
Tab. 4  Logistic regression analysis of clinical data, pathology and parameter characteristics of gliomas

3 讨论

       本研究基于常规MRI，首次综合应用多模态多参数的高级MRI方式，包括DWI、DCE和MRS，定性及定量评估了胶质瘤患者Ki-67表达水平，结果得出K^trans（OR=1.012，P<0.001）、ADC（OR=0.998，P<0.05）、强化程度（OR=3.317，P<0.05）是Ki-67表达水平的独立预测因素，AUC为0.893。目前已有研究将常规MRI与高级MRI技术结合来预测胶质瘤分级、IDH基因表达等^{[11, 12, 13, 14]}，但对于Ki-67表达水平应用甚少。提高预测胶质瘤Ki-67表达水平的能力对早期诊断、个体化治疗及预后评估有重要临床价值，为胶质瘤Ki-67水平预测提供更多更精准的生物标记物，提高术前诊断及术后评估能力。

3.1 DWI对胶质瘤Ki-67表达水平的价值

       ADC由DWI得到，可以反映水分子的扩散情况，包括细胞密度、分布、渗透性及细胞内外组织的差异等^[15]；ADC值越大，扩散受限程度越小^[16]。甘郑宁等^[17]研究发现Ki-67表达水平与ADC值呈负相关，且低级别胶质瘤的ADC值高于高级别胶质瘤。常天静等^[18]通过探讨体素内不相干运动DWI对胶质瘤分级和Ki-67指数的研究也得出了类似结果。上述研究均与本研究结果一致，Ki-67高表达组的ADC值低于低表达组，提示Ki-67高表达胶质瘤肿瘤细胞多，且排列紧密，细胞之间密度增高^[19]，扩散受限，ADC值较Ki-67低表达的胶质瘤就会越小。本研究表明，ADC值可作为Ki-67表达水平的独立预测因素（OR=0.998，P=0.003），但其OR值较低，可能是由于Ki-67 LI的评估是通过活检或外科手术切除获得组织，肿瘤细胞异质性高，且受到肿瘤非均匀性抽样误差的影响，依赖于病理医生的主观判断，限制了诊断准确性，尤其是在立体活检等小样本中，因此无法获得完全客观的计数。此外，研究基于两个b值的传统DWI，通过单指数模型计算得到ADC值，得到的结果受到微循环灌注和扩散的双重影响，ADC值并非随着b值的升高呈直线衰减，因此会对结果造成一定的差异性。

3.2 DCE-MRI对胶质瘤Ki-67表达水平的价值

       本研究将DCE-MRI灌注成像技术纳入Ki-67表达水平预测因素，结果提示K^trans是所有胶质瘤中Ki-67表达水平的独立预测因素（OR=1.012，P<0.001）。DCE-MRI技术可以反映肿瘤微血管特征，无创性定量描述肿瘤的病理生理变化^[20]。DCE-MRI定量参数K^trans反映对比剂从血管腔内渗透至血管外细胞外间隙（extravascular extracellular space, EES）的速率；Ve表示对比剂从血管腔内渗漏到血管外间隙的容积占整个EES的比值，Ve与K^trans一同反映对比剂渗漏的能力，也能够反映血管壁的通透性^[21]。Kep为K^trans和Ve的比值，反映对比剂从EES回流入血管腔内的速率；Vp表示每单位体积组织的血浆体积，与毛细血管密度成正比^[22]。K^trans既可以反映血管渗透情况，也可以反映肿瘤内新生血管密度和血流灌注^[23]，研究表明，胶质瘤恶性程度越高，血管通透性增加，新生血管增殖，Ki-67指数也会更高^[24]。而高级别胶质瘤与低级别胶质瘤相比，瘤体内血管新生速度快，血管不成熟，且血管内皮发育不良，排列杂乱，星形胶质细胞和微血管的连接也较差，对比剂更容易渗漏到高级别肿瘤内部，从而在高级别胶质瘤中K^trans可产生阳性结果，但此结果在浸润性较差的低级别胶质瘤中可能难以产生。JIANG等^[9]的研究表明，K^trans在所有胶质瘤和高级别胶质瘤的Ki-67 LI中均有相关性而在低级别胶质瘤中未发现K^trans与Ki-67 LI的相关性。这也很好地解释了浸润性较差的低级别胶质瘤血管壁较成熟、通透性较低，有待后续更进一步的深入探讨。此外，本研究中的DCE-MRI定量参数是通过传统扩展Tofts模型得到的，存在一定局限性，目前已有更多示踪动力学模型应用于胶质瘤诊断，如分布式参数模型（distributed parameter model, DP）等，为胶质瘤诊断提供更精准的参数^[25]。

       在DCE-MRI中，描述某个兴趣区信号强度与时间关系的曲线即为TIC曲线，通过检测对比剂首次通过组织时引起的信号强度随时间的变化而生成，能有效反映组织的血流动力学信息^[26]。根据先前的研究，TIC可以分为三型：Ⅰ型曲线表现为缓慢上升；Ⅱ型曲线表现为缓慢上升后趋于平坦；Ⅲ型曲线为速升速降型^[27]。TIC上升很大程度上取决于组织灌注和渗透性，清除则和对比剂浓度下降及血管通透性有关，Ⅲ型TIC信号强度迅速上升到峰值后呈快速下降趋势，通常提示恶性程度高^[28]。TIC特征在乳腺^{[29, 30]}中得到了较多研究，但在胶质瘤中尚未得到明确的检验效能。在本研究的组间比较中我们可以发现，Ⅰ型TIC多见于Ki-67低表达胶质瘤患者，而Ki-67高表达患者则以Ⅲ型曲线多见，提示Ki-67高表达肿瘤血管增殖，血管通透性增加，恶性程度更高，预后更差，但在logistic 回归中无明显差异。

3.3 MRI多模态多参数联合应用对胶质瘤Ki-67表达水平的价值

       本研究将常规MRI与DCE、MRS、ADC图相结合，无创性地定量及定性评估胶质瘤患者Ki-67表达水平，建立预测模型。结果显示，在胶质瘤患者分析中，K^trans、ADC和强化程度均为Ki-67表达水平的独立预测因素，AUC为0.893。目前也有学者通过多种磁共振成像技术对Ki-67表达水平的预测进行了研究。叶梅萍等^[31]基于MRI特征发现年龄、肿瘤囊变坏死程度、ADC值和强化程度是胶质瘤Ki-67表达水平的重要影响因素，AUC分别为0.650、0.692、0.863、0.817，其中年龄、囊变坏死程度、强化程度与Ki-67分级呈正相关，ADC值为负相关。并将上述四个参组合预测Ki-67表达水平，AUC为0.863，检验效能较好。樊建坤等^[32]采用T2-FLAIR影像组学预测WHO 2~3级胶质瘤Ki-67水平，建立影像组学模型，得到的结果与前期研究一致^[33]，即WHO分级越高，Ki-67表达水平更高，预后相对更差。陈煜豪等^[34]通过DSC-PWI灌注参数探讨胶质瘤分级及Ki-67表达，发现rCBF=2.33、rCBV=2.16是区分Ki-67表达高低的临界值。上述发现均未探讨其他高级磁共振成像技术如DCE、MRS、ASL^[35]对Ki-67表达水平的评估，为之后更进一步的研究提供了方向。

3.4 局限性

       本研究存在以下局限性：（1）本研究样本量均一性偏低，需要进一步平衡组间样本量以提高诊断准确性；（2）本研究对胶质瘤术前Ki-67表达水平进行研究，今后将进一步增加对胶质瘤术后评估如复发与治疗后反应鉴别的研究；（3）人工勾画ROI具有一定的误差，今后将通过人工智能的方法对大规模的数据进行统一勾画。

4 结论

       综上所述，DCE、DWI、MRS等高级磁共振成像技术及其产生的定量和定性参数对脑胶质瘤Ki-67表达水平的预测比常规MRI具有更高的诊断价值，为临床提供了更多潜在的生物标记物。