0 引言

       糖尿病是一组以胰岛素绝对或相对分泌不足和（或）胰岛素利用障碍引起的代谢性紊乱疾病，主要包括1型糖尿病和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）两种类型，其中T2DM占比达到90%以上^[1]。近10多年来，我国糖尿病人群迅速增加，患者人数已达到1.4亿人^[2]。流行病学研究表明，T2DM是认知障碍发生乃至痴呆的重要危险因素^{[3, 4]}。然而，T2DM相关认知障碍发生的神经生理学机制仍尚未完全阐明。

       静息态脑功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging, rs-fMRI）方法是既往研究揭示T2DM相关脑功能异常的主要手段，可在脑结构损伤发生前早期检测特定脑区功能连接或自发神经活动指标改变^[5]，目前已广泛应用于认知损伤相关研究^{[6, 7, 8]}。传统rs-fMRI分析属于“静态”分析，认为大脑的功能连接保持不变。但是，越来越多的研究表明大脑的功能连接存在时变特性^{[9, 10]}。HUTCHISON等^[11]报道了当采用短时间窗对脑网络节点间的功能连接进行分析时可发现在较长时间窗口情况下难以捕捉的波动，证明传统的rs-fMRI分析无法捕捉大脑功能连接的细微时变。因此，动态网络功能连接（dynamic functional network connectivity, dFNC）分析得到了越来越多的关注。dFNC考虑了功能连接在更为精细的时间尺度内的波动特征，能够更为精确地描述大脑不同区域间的功能协作^{[12, 13, 14, 15, 16]}，可为探索T2DM相关认知障碍发生的神经机制提供新的信息。同时，既往研究未着重关注不伴认知功能损伤的T2DM患者脑功能改变。鉴于此，本研究拟基于群组独立成分分析（group independent component analysis, GICA）方法开展dFNC研究，分析认知功能正常的T2DM患者动态脑功能网络连接特征，并探索相关指标与临床表现之间的相关性，从新的角度理解T2DM相关脑功能损伤的神经病理机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究采用前瞻性研究方法，纳入2020年3月至2022年12月于我院内分泌科就诊的认知功能正常T2DM患者共39名。具体纳入标准为：（1）符合中国2型糖尿病防治指南（2020版）诊断标准^[2]，与首次确诊间隔至少1年；（2）年龄40~65岁之间，受教育年限大于等于6年；（3）规律服用降糖药物，无低血糖发作史；（4）右利手；（5）蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）评分≥26分。具体排除标准为：（1）脑外伤、脑损伤病史；（2）精神疾病史；（3）酒精或药物成瘾史；（4）糖尿病严重并发症；（5）身体质量指数（body mass index, BMI）>25；（6）磁共振检查禁忌；（7）听力、视觉或运动障碍；（8）颅内明显的器质性病变。同期招募年龄、性别、受教育年限相匹配的健康对照39名，需满足空腹血糖<6.1 mmol/L和糖化血红蛋白<6.5%，无认知损伤（MoCA评分≥26分），均为右利手，具体排除标准除糖尿病严重并发症外与T2DM患者相同。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经河南省人民医院伦理委员会批准，所有受试者及其家属均签署知情同意书，批准文号：2020043。

1.2 MRI数据采集

       采用西门子3.0 T Trio MR扫描仪及配套8通道头部线圈采集MRI数据。受试者安静平卧于扫描床，用海绵固定头部，佩戴降噪耳机，扫描期间保持闭眼、清醒，避免头动及体动。

       T1结构像采用三维磁化准备快速梯度回波序列行矢状位扫描，TR 1900 ms，TE 2.52 ms，TI 900 ms，翻转角9°，层数160，层厚为1 mm，无层间距，扫描野250 mm×250 mm，矩阵256×256。

       血氧水平依赖（blood oxygenation level dependent, BOLD）成像采用平面梯度回波序列，TR 2000 ms，TE 30 ms，翻转角90°，层数33，层厚4 mm，扫描野240 mm×240 mm，矩阵64×64，共采集210个时间点。

1.3 临床资料采集及量表评估

       记录两组受试者的性别、年龄、受教育年限、血压，均禁食>8小时后于清晨采集血样测量空腹血糖、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c）、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。T2DM组记录病程。两组受试者均进行蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）评估。评估在安静的室内进行，由1名受过培训的神经内科医师实施。

1.4 数据预处理

       采用基于Matlab 2018b平台的SPM 12工具包（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/）对图像数据进行预处理，具体操作流程为：（1）将DICOM图像格式转换为NIFTI格式；（2）去除前10个时间点的图像；（3）进行时间层校正；（4）进行头动校正，在该步骤检查是否存在任意方向头动大于2.5 mm或超过2.5°，如有则将数据剔除^[17]；（5）图像配准，将每个受试者的T1结构像配准到其BOLD图像上；（6）空间标准化，通过受试者T1结构像建立受试者个体脑空间和蒙特利尔神经病学研究所（Montreal Neurological Institute, MNI）标准空间的映射关系，将受试者的BOLD图像转换到MNI标准空间，同时将体素重采样为3 mm×3 mm×3 mm大小；（7）图像平滑，采用半高宽为6 mm的高斯核对图像进行空间平滑处理。

1.5 基于GICA的脑功能网络提取

       使用基于SPM 12的GIFT工具包（http://mialab.mrn.org/software/gift/）进行动态脑功能网络连接分析。使用信息最大化算法（information maximization algorithm, informax）对全体受试者预处理后的BOLD数据使用GICA进行成分提取，并使用ICASSO方法确保结果的稳定性。根据最小描述长度方法估计结果设定提取20个独立成分（independent component, IC），获取各独立成分的脑空间三维图像及时间序列信号，并重构每个受试者的各成分的脑空间三维图像及时间序列信号。然后，基于ALLEN等^[18]提出的静息态脑网络分区模板，采用多重线性回归方法提取与脑功能网络模板相匹配的独立成分，作为dFNC分析的网络节点。对匹配到脑功能网络的独立成分对应的时间序列信号进行处理以抑制噪声干扰：（1）去除线性、二次、三次漂移；（2）回归头动参数以及其一阶导数；（3）去除尖峰信号；（4）低通滤波，截止频率为0.15 Hz。

1.6 dFNC分析

       同样使用基于SPM 12的GIFT工具包（http://mialab.mrn.org/software/gift/），对每个被试进行dFNC分析。采用滑窗法将时间序列分割成多个连续的时间窗，窗形为锥形窗，参考前期研究选择窗宽为30个TR，对应高斯卷积窗为3个TR，滑窗步长为1个TR^[19]。在每个时间窗内，采用基于L1正则化的LASSO回归计算节点之间均值序列的回归系数，构建每个时间窗的功能连接矩阵。然后使用K-means聚类方法，计算欧氏距离，将所有的功能连接矩阵聚类为5种连接模式^[20]（state 1~5）。然后，计算平均滞留时间（mean dwell time, MDT）和时间分数（fraction time, FT）指标。MDT表示受试者功能连接在某个state的连续滞留的时间窗个数的平均值，FT则表示受试者功能连接出现某个state的累计时间窗个数。

1.7 统计学分析

       对一般统计资料采用SPSS 19软件进行统计分析。对年龄、空腹血糖、MoCA评分等计量资料使用Shapiro-Wilk进行正态分布检验，符合正态分布的采用独立样本t检验，否则采用Mann-Whitney U检验。性别构成采用卡方检验，dFNC指标MDT、FT采用Mann-Whitney U检验，均以P<0.05为差异具有统计学意义。脑网络功能连接采用GIFT工具包进行统计分析，采用独立样本t检验，同时以性别、年龄作为协变量，采用两样本t检验，Bonferroni校正后P<0.05。提取有差异的功能连接值和dFNC指标，与临床资料及MoCA评分进行偏相关分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料统计结果

       两组间性别、年龄、受教育年限、MoCA评分及血脂、血压差异均无统计学意义。T2DM组空腹血糖及HbA1c显著高于健康对照组，具体见表1。

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表1  T2DM组与健康对照组临床资料比较
Tab. 1  Comparison of clinical data between T2DM and control group

2.2 GICA分析结果

       共有11个独立成分对应具体静息态脑功能网络，分别为腹侧默认网络（IC1，vDMN），视觉空间网络（IC2，Visuospatial），运动网络（IC5，Motor），听觉网络（IC6，Auditory），突显网络（IC7，SA），楔前叶网络（IC8，Precuneus），语言网络（IC9，Language），左侧执行控制网络（IC12，LECN），基底节网络（IC13，Basal Ganglia），右侧执行控制网络（IC15，RECN），初级视觉网络（IC18，primary Visual），具体如图1所示。

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图1  分解得到的11个独立成分的空间分布。vDMN：腹侧默认网络；VIS_spatial：视觉空间网络；MOTOR：运动网络；AUD：听觉网络；SA：突显网络；PCUN：楔前叶网络；LAN：语言网络；LECN：左侧执行控制网络；BGC：基底节网络；RECN：右侧注意网络；VIS_prim：初级视觉网络；IC：独立成分。
Fig. 1  Spatial maps of 11 identified independent components. vDMN: ventral default mode network; VIS_spatial: visuospatial network; MOTOR: motor network; AUD: auditory network; SA: salience network; PCUN: precuneus network; LAN: language network; LECN: left executive control network; BGC: basal ganglia network; RECN: right executive control network; VIS_prim: primary visual network; IC: independent component.

2.3 动态脑功能网络分析结果

       dFNC聚类结果如图2所示，state1-5的出现频率依次为25%、19%、13%、9%、34%。T2DM患者在state5的MDT和FT显著高于健康对照组（P=0.014、0.039）（图3）。并且在state5中，T2DM组IC2和IC13的功能连接显著升高（P=0.027），而IC7和IC18的功能连接显著减低（P=0.044）（图4）。对于T2DM组，以上具有显著统计学差异的dFNC指标与表1中的临床资料均无显著相关性（P均<0.05）。

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图2  通过聚类方法提取的5种动态功能连接模式。方块的色阶代表对应网络间的功能连接强度。AUD：听觉网络；BGC：基底节网络；LECN：左侧执行控制网络；LAN：语言网络；MOTOR：运动网络；PCUN：楔前叶网络；RECN：右侧注意网络；SA：突显网络；VIS_spatial：视觉空间网络；VIS_prim：初级视觉网络；vDMN：腹侧默认网络。
Fig. 2  Five states were identified using K-means clustering method. The color corresponds to the level of correlation. AUD: auditory network; BGC: basal ganglia network; LECN: left executive control network; LAN: language network; MOTOR: motor network; PCUN: precuneus network; RECN: right executive control network; SA: salience network; VIS_spatial: visuospatial network; VIS_prim: primary visual network; vDMN: ventral default mode network.

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图3  两组平均滞留时间和时间分数对比。HC：健康对照；T2DM：2型糖尿病。
Fig. 3  Comparisons of mean dwell time and fraction time between groups. HC: healthy control; T2DM: type 2 diabetes mellitus.

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图 4  健康对照组和T2DM组在state5中网络间功能连接对比。AUD：听觉网络；BGC：基底节网络；LECN：左侧执行控制网络；LAN：语言网络；MOTOR：运动网络；PCUN：楔前叶网络；RECN：右侧注意网络；SA：突显网络；VIS_spatial：视觉空间网络；VIS_prim：初级视觉网络；vDMN：腹侧默认网络。
Fig. 4  Comparisons of inter-network connectivity differences in state5 between groups. AUD: auditory network; BGC: basal ganglia network; LECN: left executive control network; LAN: language network; MOTOR: motor network; PCUN: precuneus network; RECN: right executive control network; SA: salience network; VIS_spatial: visuospatial network; VIS_prim: primary visual network; vDMN: ventral default mode network.

3 讨论

       本研究基于GICA方法对认知功能正常的T2DM患者进行dFNC分析。与健康对照组相比，T2DM患者在state5的平均滞留时间和时间分数显著增高。同时，T2DM患者在state5中视觉空间网络与基底节网络的功能连接显著增强，而初级视觉网络与突显网络的功能连接显著减低。但是，异常的dFNC指标均未发现与T2DM患者临床指标或MoCA评分存在相关性。本研究从动态脑网络分析的角度探索了认知损伤发生前T2DM相关的动态脑功能改变，为揭示T2DM患者认知损伤发生的神经病理机制提供了更多信息。

3.1 基于dFNC的T2DM患者脑功能改变

       基于GICA的dFNC计算主要包括滑窗和聚类两个步骤。本研究中通过滑窗法共计得到12 240个时间窗对应的功能连接矩阵，通过聚类得到5种state^[21]。其中，state5的出现频率最高，各网络成分之间的功能连接较弱。相对地state4出现频率最低，但是却出现有相对广泛的正向功能连接。对比state1到5，可以发现相对稳定的功能连接，而也有功能连接在不同state下表现不同。既往研究表明，大脑功能连接存在时变特性^{[22, 23]}。结合本研究结果，可见进行dFNC分析可有效识别传统功能连接分析观察不到的时变特征。

       每个受试者可根据K-means聚类结果得到状态转移向量，进而计算MDT和FT指标。本研究中T2DM患者在state5的平均滞留时间及时间分数显著高于健康对照组，表明T2DM患者脑网络间连接有减弱倾向。既往报道发现阿尔茨海默病患者及其他神经退行性疾病患者dFNC分析出现功能连接减低^{[24, 25, 26, 27]}，与本研究结果一致。因此可以推断早在认知障碍发生前T2DM患者全脑范围内即有出现广泛的功能连接下降的趋势，提示可以通过对高风险人群的脑功能网络进行分析来进行认知障碍发生的早期预警。

3.2 T2DM患者视觉相关网络连接改变

       本研究发现在T2DM组在state5中，视觉空间网络（IC2）与基底节网络（IC13）的功能连接显著增强，而初级视觉网络（IC18）与突显网络（IC7）的功能连接则明显降低。视觉空间网络主要参与视觉空间线索的定位^[28]，初级视觉网络接收丘脑传来的视觉信息^[29]，基底节网络则涉及运动控制、情绪、认知等诸多功能^[30]，突显网络则主要调节其他脑网络对于新信息与刺激的反应^[31]。既往研究发现，突显网络和执行控制网络、默认网络共同组成而认知功能相关的核心网络^{[32, 33]}。随着年龄的增长，认知核心网络与初级视觉网络、视觉空间网络、基底节网络间的连接均会出现不同程度的功能连接降低^[34]。QI等^[35]还发现随着认知损伤的发生，T2DM患者距状回与默认网络的功能连接进一步降低，而楔前叶与默认网络的功能连接则出现增强。同时，WANG等^[36]发现T2DM患者丘脑与额叶、顶叶、枕叶存在代偿性的功能连接增强，且与认知评分呈正相关。因此，视觉网络与基底节网络增强的功能连接可能是代偿性神经重塑的结果。我们推测视觉相关网络的功能连接改变是T2DM相关认知损伤发生的前驱性改变，同时伴随具有代偿作用的功能网络连接重塑。

3.3 T2DM患者dFNC指标与临床指标的相关关系

       在相关性分析中，我们并未发现平均滞留时间、时间分数以及异常功能连接与T2DM患者临床指标及MoCA评分有相关性。LIU等^[37]发现不同糖代谢状态下和病程中，T2DM患者的脑功能连接可能会出现不同的模式。因此，淦帆等^[38]推测脑功能指标与T2DM相关检验指标的相关关系是动态变化的，增大了捕捉相关性的难度。本研究中纳入的T2DM患者均未发生认知功能障碍，这也可能是本研究未发现相关性的原因之一。

3.4 局限性

       本研究尚存不足之处。首先，滑窗法的窗宽设置可能会影响分析结果，窗宽的最优化选择仍有待于进一步研究。其次，dFNC理论背后的神经生物学机制仍有待阐明，限制了对分析结果的深入解读。最后，对治疗药物以及肥胖因素对分析结果的影响仍有待于进一步分析，在后续研究中将把患者治疗方案和肥胖症等纳入考量，检验研究结果。

4 结论

       综上所述，本研究基于GICA技术，探究认知功能正常的T2DM动态脑网络连接改变。结果发现T2DM患者在特定连接模式的平均滞留时间和时间分数显著高于健康对照，并且视觉、基底节、突显网络间的功能连接存在异常改变，这为理解T2DM相关认知损伤发生的神经病理机制提供了一定的借鉴意义。