0 引言

       肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球常见的致死性癌症^{[1, 2]}，肝癌切除和肝移植术后5年复发转移率高达40%~70%^{[3, 4, 5]}。微血管侵犯（microvascular invasion, MVI）是指肿瘤细胞侵入血管内皮细胞间隙，包括门静脉、肝动脉和淋巴管的微血管^{[6, 7, 8]}。MVI是肝癌治疗后早期复发的主要危险因素和预后不良的独立危险因素^{[9, 10, 11]}，目前术后病理为唯一金标准^[12]，术前穿刺病例由于采样部位的误差而具有一定的假阴性率^[13]，术前准确预测MVI仍存在较大困难^{[8, 14]}。钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA）是一种双相MRI对比剂，在早期肝癌和转移瘤无创性诊断中具有较高的敏感性和特异性^{[15, 16]}，目前国内外多项研究建立了基于肿瘤内部特征的HCC MVI预测模型，近年来许多学者认为瘤周区域也可为肿瘤的异质性提供潜在信息^{[17, 18, 19]}，但联合瘤内及不同瘤周区域特征的影像组学研究很少。本研究不仅建立不同瘤周区域模型，并将瘤内和瘤周区域结合，扩大最优特征集选择范围以探索最佳预测模型，另一方面，不同于多数研究所采用的内部验证方式^{[20, 21, 22]}，本研究采用多中心、外部数据集验证模型效能，使得预测模型更具可靠性及普适性，从而更有利于辅助临床实现个体化治疗，干预并改善预后。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经太仓市第一人民医院医学伦理委员会、南通市第三人民医院医学伦理委员会及苏州大学附属第一医院医学伦理委员会批准，免除受试者知情同意，批准文号分别为：2022-ky-203、EK2023025、2024269。回顾性分析苏州大学附属第一医院、太仓市第一人民医院及南通大学附属第三医院2016年至2023年间经手术病理证实为HCC的患者病例及影像资料。病例入组标准：（1）术后病理确诊HCC；（2）术后病理可明确诊断是否存在MVI；（3）术前2周内接受Gd-EOB-DTPA增强MRI检查；（4）图像资料完整且清晰；（5）术前2周内实验室检查数据完整。排除标准：（1）术前接受肿瘤局部治疗，包括射频消融、放射治疗或TACE等；（2）MRI发现门静脉、肝静脉、下腔静脉等大血管及其主要分支、属支受侵或存在癌栓；（3）肝外转移；（4）图像存在伪影影响分析。如果患者有多发HCC，则只选择直径最大的一枚。

       将南通大学附属第三医院病例作为训练集，苏州大学附属第一医院及太仓市第一人民医院病例作为外部验证集。记录患者临床资料，包括性别、年龄、肿瘤最大径、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）和有无乙肝共7项临床特征。

1.2 MRI检查方法

       三个中心MRI扫描均采用3.0 T MRI扫描仪（Magnetom Skyra, Siemens Healthineers; Philips Healthcare, Best, Netherlands; GE Discovery 750, GE Medical Systems），选用16通道腹部相控阵线圈。患者检查前禁食禁水4~6 h，体位为仰卧位。图像包括横断位、冠状位和矢状位。扫描序列及参数如下：（1）轴位双回波T1WI，重复时间（time of repetition, TR）3.70~4.50 ms，回波时间（echo time, TE）为1.20~1.90 ms，层厚为3.50~5.00 mm，视野（field of view, FOV）为260 mm×320 mm~480 mm×480 mm；（2）T1WI多相增强扫描，各MR扫描仪分别应用3D VIBE T1WI、BH Ax LAVA+C和mDIXON-W-dyn sequence序列，TR 2.90~4.20 ms，TE 1.50~1.96 ms，层厚3.50~5.00 mm，FOV 260 mm×320 mm~512 mm×512 mm。使用对比剂Gd-EOB-DTPA（拜耳医药保健有限公司，德国），剂量0.1 mL/kg，静脉推注，注射后使用20 mL生理盐水进行导管冲洗。分别在对比剂注射完成后25~30 s、55~60 s及20 min获得动脉期、门静脉期及肝胆期图像。

1.3 影像组学分析

1.3.1 图像分割

       利用3D Slicer 4.10.2（https://www.slicer.org）软件对三期MRI图像进行图像分割和感兴趣区（region of interest, ROI）重建。由医师1（具有4年以上腹部影像学诊断经验的医师）利用3D Slicer软件在动脉期、门静脉期及肝胆期图像上手动勾画肿瘤ROI，勾画时尽可能靠近但不超过肿瘤边缘，当病灶多发时，仅勾画最大的一枚病灶（两名医师共同确认）。为了评估所提取的影像组学特征的稳定性，我们进行了观察者间和观察者内可重复分析。随机选择20例患者，由医师2（具有8年以上腹部影像学诊断经验的医师）勾画ROI，两名医师将相同病例所获得的影像组学特征用于观察观察者间的可重复性。两个月后，由医师1对随机抽取的20例患者的图像再次进行ROI勾画，前后两次勾画所获得的影像组学特征用于评估观察者内的可重复性。最终勾画所得的ROI命名为瘤内ROI。

       使用3D Slicer软件的“Hollow”功能将瘤内ROI向外扩展5 mm、10 mm，形成瘤周ROI，分别命名为瘤周5 mm ROI和瘤周10 mm ROI。对于扩展后超出肝脏实质区域、包含大血管区域、囊变或伪影的部分，利用“Erase”功能人工手动将其擦除，以确保所有ROI包含肝脏实质部分体积，避免肝非实质部分对结果的干扰。（图1、2）

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图1  1A~1C：女，49岁，肝右叶肝细胞癌伴微血管侵犯阴性；1D~1F：男，54岁，肝右叶肝细胞伴微血管侵犯阳性。1A、1D：动脉期肿瘤强化；1B、1E：门静脉期肿瘤强化程度减低；1C、1F：肝胆期示病灶未见强化，而正常肝实质强化。
Fig. 1  1A-1C: A 49-year-old female with right lobe hepatocellular carcinoma with negative microvascular invasion; 1D-1F: A 54-year-old male with right lobe hepatocellular carcinoma with positive microvascular invasion. 1A, 1D: Arterial phase shows tumor enhancement; 1B, 1E: Portal vein phase shows decreased tumor enhancement; 1C, 1F: Hepatobiliary phase shows no enhancement of tumor and enhancement of normal liver parenchyma.

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图2  瘤内及瘤周分割示意图。2A：沿着肿瘤边缘逐层手动勾画ROI；2B~2C：分别为通过3D Slicer软件“Hollow”功能自动生成的瘤周5 mm、10 mm的分割结果，手动擦除不需要的部分。
Fig. 2  Schematic diagram of intratumoral and peritumoral segmentation. 2A: Manually outline the ROI layer by layer along the tumor edge; 2B-2C: The segmentation results of 5 mm and 10 mm around the tumor that are automatically generated by the "Hollow" function of the 3D Slicer software are respectively manually erased unwanted sections.

1.3.2 组学特征提取

       应用FAE软件（https://github.com/salan668/FAE）从10种图像类型和3类不同特征体系来逐一提取每例患者的影像组学特征。其中10种图像类型分别为：（1）原始图像类型；（2）小波变换滤波器类型；（3）高斯-拉普拉斯滤波器类型；（4）平方滤波器类型；（5）平方根滤波器类型；（6）对数滤波器类型；（7）指数滤波器类型；（8）梯度滤波器类型；（9）二维局部二值模式类型；（10）三维局部二值模式类型。3类特征体系分别为一阶特征体系、形状特征体系和纹理特征。其中纹理特征包括灰度共生矩阵、灰度区域大小矩阵、灰度游程矩阵、灰度依赖矩阵、邻域灰度差分矩阵。从动脉期、门静脉期和肝胆期图像中各提取1635个特征。

1.3.3 特征筛选及模型构建

       将训练集的临床资料进行单因素logistic回归分析，筛选差异具有统计学意义（P<0.05）的变量，进一步进行多因素logistic回归分析，确定预测MVI的临床独立因素（P<0.05）作为临床特征，应用支持向量机（support vector machine, SVM）构建临床模型。

       使用Z-Score数据标准化将影像学数据特征归一化，计算所有特征间的Pearson相关系数（Pearson correlation coefficient, PCC）值，如果两个特征之间的PCC值>0.90，则删除其中一个。采用方差分析法（analysis of variance, ANOVA）筛选最佳特征集，从而建立SVM分类模型，构建影像组学模型集；整合临床特征和最佳影像组学模型的最优特征，应用SVM构建临床影像组学模型。

1.4 统计学处理

       采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料采取正态性检验和方差齐性检验，其中符合正态分布者用均数±标准差表示，采取独立样本t检验比较定量参数的差异；不符合者以中位数（四分位间距）表示，采用非参数Mann-Whitney U检验进行比较。分类资料采用卡方检验比较差异。采用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）评价提取特征的一致性，ICC≥0.75为一致性较好。运用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线的曲线下面积（area under the curve, AUC）量化模型性能。计算准确度、AUC、阴性预测值、阳性预测值、敏感度和特异度来评估各自模型的性能。采用DeLong检验比较不同模型之间的差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

       共纳入HCC患者病例223例。训练集共160例，其中男104例，女56例，年龄（59.0±14.5）岁，MVI阳性58例、阴性102例；验证集共63例，其中男53例，女10例，年龄（59.0±15.0）岁，MVI阳性23例、阴性40例。训练集和验证集间性别、肿瘤最大直径及AFP的差异具有统计学意义（P<0.05）（表1）。训练集MVI阳性和阴性组间肿瘤最大直径及AFP的差异具有统计学意义（P<0.05）（表2）。

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表1  训练集和外部验证集的临床资料
Tab. 1  Clinical data from the training cohort and the external validation cohort

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表2  训练集肝细胞癌患者MVI阳性组和阴性组间临床特征比较
Tab. 2  Comparison of clinical characteristics between MVI-positive and negative groups in patients with hepatocellular carcinoma was trained

2.2 一致性评估

       经观察者间一致性检验，2名医师提取影像组学特征的ICC范围为0.784~0.923；经观察者内一致性检验，ICC范围为0.801~0.098；两者一致性均较好。

2.3 临床模型构建

       多因素logistic回归显示肿瘤最大直径（OR：1.449，95% CI：1.212~1.733）及AFP（OR：1.645，95% CI：0.665~4.071）是基于训练队列的MVI独立预测因子，可用于构建临床模型。基于SVM算法，临床模型训练集和验证集AUC分别为0.735（95% CI：0.654~0.816）、0.728（95% CI：0.597~0.859）。

2.4 影像组学和临床影像组学模型预测肝细胞癌性能

       影像组学模型集为瘤内模型、瘤周模型及瘤内联合瘤周模型。

       瘤内模型分为单期（动脉期、门静脉期、肝胆期）瘤内模型及三期联合瘤内模型。在SVM算法下，三期联合瘤内模型的效能略高，在训练集中，其AUC、敏感度和特异度分别为0.814（95% CI：0.742~0.886）、84.5%、70.6%，在验证集中，其AUC分别为敏感度和特异度分为0.820（95% CI：0.717~0.922）、78.3%、75.0%。

       在此基础上，我们采用三期联合图像对瘤周区域进行影像组学分析，建立瘤周模型（瘤周5 mm模型、瘤周10 mm模型）及瘤内联合瘤周模型（瘤内+瘤周5 mm模型、瘤内+瘤周10 mm模型）。

       在SVM算法下，瘤内+瘤周5 mm模型的预测性能较瘤内、瘤周及瘤内+瘤周10 mm模型预测效能略佳，在训练集中，其AUC、敏感度和特异度分别为0.822（95% CI：0.751~0.893）、77.6%、77.5%，在验证集中，其AUC分别为敏感度和特异度分为0.828（95% CI：0.728~0.929）、78.3%、80.0%。

       进一步将构建瘤内+瘤周5 mm模型的19个影像组学特征与临床特征肿瘤最大直径及AFP整合建模，命名为临床影像组学模型；在训练集中，其AUC、敏感度和特异度分别为0.775（95% CI：0.695~0.856）、62.1%、85.3%，在验证集中，其AUC、敏感度和特异度分为0.747（95% CI：0.621~0.873）、65.2%、82.5%。

       上述10个HCC模型的训练集及外部验证集AUC、准确度、敏感度、特异度见表3，ROC曲线见图3。各模型中，瘤内+瘤周5 mm与临床模型、临床影像组学模型的AUC差异具有统计学意义（P=0.039、0.028），其余模型的AUC差异无统计学意义（P>0.05）。

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图3  验证集中各组学模型预测MVI的ROC曲线。3A：瘤内模型AUC，三期联合模型AUC较高，为0.820；3B：瘤周模型AUC，瘤周5 mm模型AUC较高，为0.795；3C：瘤内三期联合模型与瘤周、瘤内联合瘤周模型AUC，瘤内+瘤周5 mm模型的AUC最大，为0.828；3D：临床模型、瘤内+瘤周5 mm模型与临床影像组学模型AUC对比，瘤内+瘤周5 mm模型的AUC最大。MVI：微血管侵犯；ROC：受试者工作曲线；AUC：ROC曲线下面积。
Fig. 3  The ROC of the prediction of MVI by each model in the external validation cohort. 3A: The AUCs of intratumoral models, the three phase combined model shows a higher performance (AUC=0.820); 3B: The AUCs of peritumoral models, the 5 mm peritumoral model shows a higher performance (AUC=0.795); 3C: The AUCs of the intratumoral three phase combined model, peritumoral models, and intratumoral combined peritumoral models, the intratumoral plus 5 mm peritumoral model shows the highest performance (AUC=0.828); 3D: The AUCs of clinical model, intratumoral plus 5 mm peritumoral model and clinical-radiomics combined model, the AUC of intratumoral plus 5 mm peritumoral model is the highest. MVI: microvascular invasion; ROC: receiver operating characteristic; AUC: area under the curve.

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表3  基于Gd-EOB-DTPA MRI组学模型预测肝细胞癌MVI的效能
Tab. 3  Efficacy of Gd-EOB-DTPA MRI model in predicting MVI for hepatocellular carcinoma

3 讨论

       本研究以多中心数据、外部验证方法，基于Gd-EOB-DTPA增强MRI影像，应用临床特征及影像组学特征，建立并验证了瘤内模型、瘤周模型、瘤内联合瘤周模型、临床模型和临床影像组学模型的术前HCC MVI预测效能，其中瘤内+瘤周5 mm模型效能最佳，可作为临床术前预测HCC MVI的辅助工具，从而提高治疗计划的个体化，具有广阔的临床应用前景。

3.1 影像组学模型的对比分析

       LEE等^[23]及GAO等^[24]的研究均发现，瘤内模型中，联合模型较单期模型具有更高的预测性能，与之相符，本研究中三期联合瘤内模型预测效能高于单期模型。多期MRI图像可以更全面地反映肿瘤的异质性及血管化模式，因而更全面地反映肿瘤侵袭性信息^{[22, 24, 25]}。

       除肿瘤内部特征外，瘤周区域也可提供相当的肿瘤异质性信息^{[17, 18, 19]}。FENG等^[20]等研究表明，基于术后证实MVI的术前Gd-EOB-DTPA增强MRI所呈现的瘤周特点（动脉期瘤周强化、肝胆期瘤周低信号），对HCC MVI具有一定的预测能力。本研究中，瘤周影像组学模型表现出相当的预测效能，支持上述研究结论，并且将瘤内和瘤周影像组学特征相联合，模型的预测效能有所提升。

       病理学表明MVI多出现在距离瘤周1 cm以内的区域，本研究分别选取瘤周5 mm及10 mm区域提取影像组学特征，结果显示其模型的预测效能相当。在瘤内联合瘤周模型建立中，我们发现，基于三期联合瘤内模型基础上，瘤内+瘤周5 mm模型的预测效能提升增幅高于瘤内+瘤周10 mm模型，这与以往多项瘤周研究的结论相悖。JENG等^[26]研究发现在HCC中央切除术中<5 mm的最窄边缘宽度对复发和总生存期并无明确负面影响，SASAKI等^[27]分析表示当肿瘤直径>3 cm时，手术切缘>5 mm才表现出显著改善复发和无复发生存率效果，CHAO等^[28]探索发现当肿瘤直径<3 cm时，肝脏切除手术的窄切缘（<5 mm）及宽切缘（≥5 mm）对预后并无显著影响。上述研究均认为研究结论与HCC侵袭性或MVI分布相关，本研究中肿瘤最大直径<3 cm者约占所有病例的50%，>5 cm者约占27%，我们考虑对于肿瘤最大直径<3 cm者而言，瘤周10 mm区域纳入了过多的正常肝组织特征，使得具有预测价值的特征受到干扰，变成冗余价值，并具有不稳定性；另一方面，对于肿瘤最大直径>5 cm者而言，剩余正常肝组织有限，瘤周5 mm基本将其覆盖，瘤周10 mm所增加的额外影像学信息有限。

3.2 临床模型、临床影像组学模型的对比分析

       本研究中选择了AFP等7项临床信息进行研究。多项研究^{[29, 30, 31]}发现AFP升高和肿瘤最大直径是HCC伴发MVI的独立危险因素；AST、ALT都是指示肝细胞坏死和炎症的生化替代标志物；慢性乙型肝炎病毒感染患者发生HCC的概率远高于其他诱因，约78%的肝癌可归因于乙肝病毒（53%）^[32]。

       比对训练集和验证集临床数据时我们发现，两者性别、肿瘤最大直径和AFP的差异具有统计学意义。对此笔者有以下猜想：第一，肝癌为南通市高发病率肿瘤^{[33, 34]}，本研究中心之一南通市第三人民医院设有省重点专科肝病科，对于早期肝癌的检出率较高，肿瘤最大直径总体偏小；其次，两个数据集属于随机收样，各临床数据的数值具有不可控性，所以出现差异的可能性难以避免。

       本研究中，AFP和肿瘤最大直径是临床模型中的独立预测因子，将其与影像组学特征相结合建模，我们发现，临床模型的预测效能较低，而且临床影像组学联合模型的预测效能较之影像组学模型有所下降，这均说明，本研究中临床特征的预测价值低于影像组学特征，这与以往多项研究的结论相悖^[35]。笔者认为本研究中肿瘤最大直径>5 cm者占比较小（27%）或为本研究中临床特征预测价值较低的原因。SONG等^[36]研究发现，AFP在检测HCC及评估MVI方面缺乏敏感性和特异性，HONG等^[37]认为肿瘤最大直径>5 cm，MVI的发生率增高。

3.3 局限性

       本研究尚且存在一些不足：（1）病例数量有限，且只进行单中心外部验证，未来将进一步扩大病例数据和外部验证广度；（2）受限于扫描图像层厚及伪影等因素，本研究未能纳入T1WI、T2WI、扩散加权成像等序列的影像组学特征；（3）既往许多研究对HCC MRI形态学特征进行探索，本研究涉及模型众多，为避免内容繁杂冗长而未纳入相关研究；（4）本研究未纳入患者预后信息。

4 结论

       综上所述，基于钆塞酸二钠MRI影像组学可用于HCC MVI的术前预测，其中瘤内+瘤周5 mm模型具有较高预测效能，有助于临床医生制订个体化治疗方案。