0 引言

       直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势。然而，直肠癌早期诊断技术和精准治疗指导方法仍然有限^{[1, 2, 3]}。近年来，基因测序技术的快速发展，使得基于基因治疗的靶向药物逐渐引起临床关注^{[4, 5]}。其中，鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B基因（B-Raf proto-oncogene serine/threonine kinase, BRAF）作为直肠癌的潜在治疗靶点，受到广泛研究。文献表明，BRAF基因突变可持续激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，导致细胞增殖和分化失控，从而推动肿瘤的发生和发展^{[6, 7, 8]}。尤其是BRAF V600E突变通常与更强的侵袭性及较差的预后相关，特别在微卫星不稳定状态下更为显著^{[9, 10]}。因此，检测BRAF突变不仅有助于区分散发性直肠癌与遗传性癌症（如Lynch综合征），还能指导个体化治疗策略，优化临床疗效评估。

       然而，由于部分晚期直肠癌患者无法获得手术病理样本，基于组织的BRAF基因检测面临挑战。因此，开发一种非侵入性、便捷且可重复的方法来评估BRAF基因突变状态具有重要临床价值^{[5, 6, 11]}。影像学检查，特别是MRI因具有无创性及高分辨率，已广泛应用于直肠癌的诊断、术前分期和预后评估^{[12, 13, 14]}。MRI的多种参数，如T2WI、扩散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）和动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI），能够全面展示肿瘤形态、细胞密度和血供情况，为肿瘤表征提供多维信息^{[15, 16]}。例如，DWI通过检测水分子扩散运动，反映肿瘤细胞密度，并通过表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）值评估肿瘤侵袭性；DCE-MRI则通过对比剂增强，揭示肿瘤血管生成能力，预测治疗反应和预后^{[17, 18, 19]}。

       近年来，影像组学技术蓬勃发展，通过从医学影像中提取大量高通量特征，可以在非侵入性条件下快速获取肿瘤的异质性信息。基于机器学习构建的影像组学模型展现出预测直肠癌分子特征的巨大潜力^[17]。然而，传统影像组学方法通常依赖于手动特征提取，费时费力且容易受人为因素影响，导致结果的稳定性和重复性不足。因此，引入深度学习技术，特别是CNN，能够自动从大量影像数据中提取高维特征，识别与BRAF突变相关的复杂模式，从而提升预测精度和效率。相比传统方法，深度学习模型具备无监督特征学习能力，使得BRAF突变状态的预测更为准确^{[20, 21]}。

       尽管已有研究探索了MRI特征与直肠癌分子特征之间的关联，但针对BRAF突变的影像学预测研究仍较少，且多集中于传统影像组学手段。为填补这一空白，本研究旨在结合影像组学与深度学习技术，构建基于多参数MRI的放射组学模型，用于预测直肠癌患者的BRAF突变状态。通过卷积神经网络（convolutional neural network, CNN）对影像数据进行深度特征学习，我们期望在术前非侵入性条件下，实现对肿瘤分子特征的精准预测，为直肠癌的个体化治疗提供新的诊断依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究为回顾性研究，遵守《赫尔辛基宣言》，并经哈尔滨医科大学伦理委员会审核通过，免除受试者知情同意，伦理批文号：sydwgzx2021-096。对在我院2020年6月至2023年6月确诊为直肠癌的患者病例资料进行回顾性分析。纳入标准：（1）通过病理学确诊为直肠癌，包括初诊和复发的病例；（2）所有患者必须接受高质量的术前MRI检查，且影像数据完整、清晰，适合进行影像组学分析；（3）仅限于直肠癌患者，排除有其他类型恶性肿瘤病史的个体，以减少混杂因素的影响。排除标准：（1）已经接受过新辅助化疗或放疗的患者，因治疗可能会改变肿瘤的形态和生物学特征，影响影像组学分析的准确性；（2）排除有远处转移（M1期）的患者，以集中研究局部直肠癌的影像特征；（3）存在影响肿瘤评估的严重合并症（如严重肝肾功能不全或严重心血管疾病）的患者，以减少其他疾病对影像和预后评估的影响；（4）先前有直肠手术史的患者，可能会影响肿瘤与周围组织的关系，影响影像分析的准确性。

       在本研究中，所有入组的直肠癌病例在术后均接受了标准化的治疗方案，以确保数据的一致性和研究结果的可靠性。具体的术后治疗方案包括：辅助化疗[常用的化疗方案OLFOX（氟尿嘧啶、奥沙利铂和亚叶酸钙）]、放疗（部分患者在术后接受了放疗，特别是对于那些肿瘤局部浸润较深或淋巴结转移的病例）、定期随访与监测[所有患者均接受定期随访，通过影像学检查（如MRI、CT）及肿瘤标志物（如癌胚抗原）检测监测病情变化]。所有患者均接受直肠MRI扫描，为患者佩戴隔音耳塞，避免对听力造成不必要的损坏。为了避免金属伪影的干扰，叮嘱患者将所有金属物品移除，包括内衣上的金属物，尽量保证图像不受外界因素干扰。患者在检查前的12 h内禁食，减少肠道内的气体和内容物，从而减轻肠道蠕动的影响。使用抗胆碱药物来抑制肠道运动，降低检查过程中的肠道运动伪影。使用3.0 T GE Discovery MR 750w MRI仪扫描，通过相控阵体部线圈（原厂）收集图像信息，其中体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion, IVIM）成像可以提供肿瘤微血流灌注的信息，其中包括使用DWI序列进行MRI扫描，所用的b值为1000 s/mm²。这在分析肿瘤的生物学行为时是有价值的。扫描序列及参数详见表1。

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表1  MRI序列及参数
Tab. 1  MRI sequence and parameters

1.2 BRAF基因状态检测

       获取手术切除的病变组织后，将其进行石蜡包埋处理。接着，按照3~5 um的厚度制作10张切片。经过病理评估，确保每张切片中的肿瘤细胞含量超过20%。随后，使用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）提取试剂盒提取组织标本中的DNA，并将其保存于-20 ℃的冰箱中待检。然后进行基因组DNA文库构建，采用BRAF基因panel对DNA文库进行捕获，将捕获的样本上机测序，最后对测序数据进行分析。运用BWA（Burrows Wheeler Aligner, Version 0.7.12）序列对比软件，将每个样本的原始测序碱基序列与人类参考基因组序列（hg19）进行比对，以分析是否出现基因突变情况。由两名分析员分别判读结果，意见不统一时，探讨后决定最终结论。

1.3 影像特征的提取及筛选

       在本研究中，影像特征提取采用了多参数MRI数据。

1.3.1 图像预处理及特征提取

       首先，对获取的MRI影像进行标准化处理，包括去噪、重采样和对齐，以确保各序列间的空间一致性。随后，对图像进行直方图均衡化，增强对比度，特征提取。纹理特征提取：使用灰度共生矩阵分析法提取肿瘤区域的纹理特征，包括对比度、相关性、能量和同质性。形态学特征提取：利用图像分割算法（如阈值法或区域生长法）提取肿瘤的边界，计算肿瘤的大小、形状、边缘平滑度及其他相关形态学参数。ADC值计算：通过DWI序列获取肿瘤的ADC值，反映肿瘤细胞的密度和微环境变化。ADC值的计算采用基于多b值的线性回归方法。IVIM特征提取：应用灌注加权成像序列，提取灌注相关参数，灌注分数（f）和伪灌注扩散系数（D^*）。特征提取过程遵循标准化程序，确保每个患者的影像特征在相同的条件下被提取。

1.3.2 特征筛选

       在完成特征提取后，我们采用最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归进行特征筛选。筛选过程的步骤如下：（1）建立模型，使用提取的所有特征构建LASSO回归模型；（2）交叉验证，采用5折交叉验证方法，评估模型的稳定性和预测能力；（3）特征选择，根据交叉验证的结果，选出在多个折中均表现良好的特征。最终筛选出的特征将用于后续的CNN模型构建。

1.4 模型构建及效能评估

       考虑到传统机器学习技术在直肠肿瘤分类方面的性能不足、人工特征提取的复杂度高以及传统深度学习在深度网络中的网络退化等缺点，本文提出了一种基于ResNet50网络的直肠肿瘤自动分类模型。首先，通过训练源数据获得模型的权重参数，然后使用验证集测试模型的性能。ResNet50共有49个卷积层和1个全连接层。其中，在第二至第五阶段，ID块x2表示两个不改变维度的残差块，而Conv块则代表具有特定维度的残差块。每个残差块包含三个卷积层。通过计算可得，总共有49个卷积层，即1+3×（3+4+6+3）=49（如图1所示）。其结构如下：

       ResNet50神经网络的输入数据大小为224×224×3。图像经过残差块的连续卷积运算后，图像像素矩阵的通道变得越来越深，随后经过扁平化层，图像像素矩阵的大小变为2048。最后，输入到全连接层，并通过SoftMax层输出相应的类别概率。ResNet50结构包含跨层连接，通过捷径将输入跨层传递，然后将卷积后的输出加入，以充分训练底层网络。因此，随着深度的增加，精确度也会显著提高。

       ResNet的残差块结构如图2所示，快捷连接的功能相当于直接执行等效映射，但这一操作不会增加任何额外参数，也不会导致计算复杂性。因此，该模型在一定程度上被简化为一个浅层网络。为了避免这种情况，必须学习等效映射函数H（x）=x，但直接拟合这样的函数具有挑战性。假设残差网络的输出为H（x），卷积运算后的输出为F（x），H（x）=F（x）+x，则F（x）=（ω36（28（ωlx））），其中ω表示卷积运算。因此，如果F（x）=0，则可以容易地获得上述相同的映射函数H（x）=x，并且需要解决的问题是学习可以容易地得到拟合的残差函数F（x）=H（x）-x。

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图1  ResNet50学习框架。
Fig. 1  The framework of ResNet50 learning.

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图2  ResNet的残差块结构。
Fig. 2  Residual block structure of ResNet.

1.5 模型开发

       模型开发使用了Pytorch框架（PyTorch 2.0.1）。在模型的实现过程中，我们使用了一个开源资源库（https://pytorch.org/）。在训练过程中，我们使用ADAM作为优化器，其初始化学习率为le-4。在结果分析中，我们使用了开源软件库（https://github.com/yizt/Grad-CAM.pytorch）中的CAM技术。数据按8∶2的比例分为训练集和验证集，使用ResNet50作为分类器，将原始图像直接输入网络，实现端到端的预测。在训练模型时，我们采取交叉验证方式，将数据集分为五个部分（No.1~No.5），同时训练五个模型。将第一个数据集用于第一个模型的验证集，其余数据集用于训练；将第二个数据集用于第二个模型的验证集，其余数据集也用于训练。其他数据集的训练方法相同。在评估阶段，我们记录了模型在BRAF在突变组及正常组分类任务中的表现。敏感度=TP/（TP+FN），特异度=TN/（FP+TN），阳性预测值=TP/（TP+FP），阴性预测值=TN/（TN+EN），准确度=（TN+TP）/（TN+FP+FN+TP）。TN为真阴性，TP为真阳性，FP为假阳性，FN假阴性。

1.6 病理分期标准

       在本研究中，肠癌患者的病理分期依据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control, UICC）和美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）制订的TNM分期系统进行分类。具体而言，T（肿瘤）分期评估原发肿瘤的大小和浸润程度，分为四个阶段：T1表示肿瘤局限于黏膜层，T2表示侵及肌层，T3表示穿透外层，而T4则表示侵及邻近结构。N（淋巴结）分期评估淋巴结转移情况，分为N0（无转移）、N1（转移到1~3个淋巴结）和N2（转移到4个或更多淋巴结）。M（转移）分期则评估是否存在远处转移，分为M0（无转移）和M1（有转移）。根据这些标准，患者被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，分别代表不同的肿瘤侵袭性和转移情况。此分类方法为我们研究患者的预后和影像组学特征的分析提供了重要依据。

1.7 统计学分析

       使用JMP 10.0软件（SAS Institute Inc, Cary, NC, USA）进行统计学分析。对于分类变量，使用卡方检验、费舍尔精确检验或二项分布检验进行组间比较；对于连续变量，采用独立样本t检验。生存分析采用Kaplan-Meierestimate和Cox比例危险回归模型。我们首先进行方差齐性检验（如Levene检验或Bartlett检验），以确定各组数据的方差是否相等。这将为选择适当的统计方法提供依据。若数据满足方差齐性，我们将使用参数检验方法，如独立样本t检验或方差分析（ANOVA）来比较不同组之间的影像特征和BRAF突变状态。若数据不满足方差齐性，则采用非参数检验方法，如Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验，以确保结果的可靠性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

       在分析了纳入研究的260个病例的测序数据后，共鉴定了89例BRAF突变型患者及171例BRAF正常型患者，对患者基础资料进行比较，结果如表2所示，两组患者病理分期、年龄、性别差异均无统计学意义（P>0.05）。

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表2  BRAF突变型及野生型患者基本情况统计表
Tab. 2  Statistical table of basic information of BRAF mutant and wild-type patients

2.2 BRAF突变与直肠癌预后相关性

       本研究分析了BRAF突变对预后的影响。BRAF突变型患者平均生存时间为（46.22±4.20）个月，低于BRAF未突变患者的（66.37±5.90）个月（P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，BRAF未突变型的患者的总体生存期优于BRAF突变型患者（图3；log-rank=11.233，P<0.001），提示BRAF突变型患者预后较差。

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图3  BRAF突变状态对患者整体生存期的影响。BRAF：鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B基因。
Fig. 3  The impact of BRAF mutation status on overall survival of patients. BRAF: B-Raf proto-oncogene serine/threonine kinase.

2.3 神经网络模型预测结果分析

       基于BRAF基因在直肠癌中良好预测性能，我们利用CNN构建基于直肠癌放射组学特征的模型预测BRAF突变状态，并对预测性能进行了ROC曲线评估，发现ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.929，敏感度为91.2%，特异度为96.1%，阳性预测率为93.0%，阴性预测率为88.8%。表明模型对区分BRAF突变状态具有良好的预测效能。

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图4  卷积神经网络对BRAF基因突变状态的预测潜力。4A：通过ROC评估卷积神经网络构建的放射组学模型；4B：放射组学模型的混淆矩阵，左上为真阴性，左下为假阴性，右上为假阳性，右下为真阳性。BRAF：鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B基因；ROC：受试者工作特征。
Fig. 4  The predictive potential of convolutional neural networks for BRAF gene mutation status. 4A: Radiomics model constructed using convolutional neural network evaluated by ROC; 4B: Confusion matrix of radiomics model, with true negative in the upper left, false negative in the lower left, false positive in the upper right, and true positive in the lower right. BRAF: B-Raf proto-oncogene serine/threonine kinase; ROC: receiver operating characteristic.

2.4 模型训练集与验证集的效能分析

       在本研究中，我们对模型的性能进行了全面评估，结果显示训练集和验证集的性能均表现良好（表3）。具体而言，训练集的准确率达到92.1%，敏感度为91.2%，特异度为96.1%，AUC值为0.929（95% CI：0.904~0.952），表明模型在训练数据上的表现优异。验证集的结果显示，准确率为93.2%，敏感度为90.6%，特异度为92.3%，AUC值为0.912（95% CI：0.872~0.927），进一步验证了模型的稳定性。这些结果表明，我们的CNN模型在预测直肠癌患者的BRAF突变状态方面具有良好的预测能力和一致性，为临床决策提供了重要支持。

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表3  训练集及验证集的模型效能比较
Tab. 3  Comparison of model performance between training and validation sets

2.5 模型预测结果与病理结果一致性分析

       为了评估CNN模型在预测BRAF突变状态方面的准确性，我们对模型预测结果与病理结果进行了分析。结果显示，模型在260例患者中的表现良好，具体数据详见表4，在一致性分析中，模型的真正例（TP）为80，假正例（FP）为5，假负例（FN）为9，真负例（TN）为166。计算得出观察到的一致性（PoP_oPo）为0.946，表明模型与病理结果之间具有良好的一致性。此外，Kappa统计量为0.87，进一步验证了模型的预测结果与病理结果之间存在非常好的匹配。这些结果表明，该模型在预测BRAF突变状态方面具有较高的准确性，为临床决策提供了有力支持。

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表4  模型预测结果与病理结果一致性分析
Tab. 4  Consistency analysis between model prediction results and pathological results

3 讨论

       本研究基于多参数MRI影像数据，结合CNN技术（ConvNet），构建了一个自动化影像组学模型，用于预测直肠癌患者的BRAF基因突变状态。结果显示，该模型在训练集和验证集上分别取得了92.1%和93.2%的预测准确率，AUC分别为0.929和0.912。这一方法是国内外首次将深度学习技术与多参数MRI影像组学相结合，用于BRAF基因突变的预测。通过自动化特征提取，克服了传统放射组学方法依赖手动勾画感兴趣区（region of interest, ROI）及特征选择的不足，实现了更高效、精准的分子诊断。这一创新性方法不仅填补了现有研究的空白，还为临床提供了一种无创、快速的基因突变检测手段，具有重要的临床应用价值。

3.1 影像组学预测BRAF基因突变的优势

       肿瘤的发生发展是多基因参与的复杂过程，BRAF基因突变常见于多种肿瘤^{[4, 8, 10]}，包括直肠癌^{[4, 10]}。随着人们生活习惯及饮食方式的改变，中国直肠癌的发病率呈增加趋势^{[22, 23]}。在精准医学时代下，基因突变检测对肿瘤患者的诊断及治疗价值越来越大^{[10, 11, 24]}。BRAF基因是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）下游通路中重要的信号转导基因，BRAF发生突变后，EGFR信号通路无法对其进行调控，从而导致肿瘤发生发展^{[25, 26]}。由此可见，BRAF作为直肠癌的重要驱动基因，检测其状态对于治疗方案的制订及疗效评估均具有重要的指导意义。MRI是直肠癌诊疗过程中常用的影像学检查方法，对肿瘤表征、治疗反应等具有重要的参考价值，各特征参数与 BRAF基因状态也可能存在一定关系^{[5, 19]}。已有研究表明，BRAF突变与直肠癌患者的不良预后密切相关。我们的模型不仅验证了这一观点，还为BRAF突变的早期检测提供了新的方法。这种基于影像组学的预测方法在已有的基因检测技术中增加了一层非侵入性的评估手段，具有重要的临床应用潜力。

       本研究的结果显示，BRAF突变组与正常组患者的临床基本资料，包括直肠癌分期、年龄、性别差异均无统计学意义。这提示我们从普通的临床信息入手是无法有效区分BRAF突变状态的。然而BRAF突变情况又与患者选择科学的治疗方案息息相关。LI等^[25]曾尝试比较突变组与正常组患者的术前MRI影像特征，发现直肠癌患者术前MRI检查的ADC、肿瘤最大轴向长度（axial tumor lengths, ATL）、肿瘤最大纵向长度（longitudinal tumor lengths, LTL）、ATL/LTL均与BRAF基因状态具有一定关联，ATL高水平、ATL/LTL高水平均与BRAF基因突变密切相关，ATL和ATL/LTL对BRAF基因突变均具有较高的诊断价值。这提示我们MRI在预测BRAF状态具有重要作用。但是这种放射组学特征分析需要人工勾画ROI并对特征进行提取，不仅差异大，而且工作烦琐。成像技术的兴起使得机器学习与分子诊断之间的联系成为可能。本研究在传统机器学习方法的基础上增加了ConvNet技术，从而大大提高了图像处理能力，实现了自动特征提取，滤波器特征无需人工设计，避免了主观结果，最终获得了更好的预测性能。这就是本研究提出的建立模型的核心优势。在临床应用方面，模型的优势在于其快速、非侵入性的特点，使其能够在患者初次就诊时提供有价值的信息。这一模型可以辅助临床医生在制订个体化治疗方案时，快速评估患者的BRAF突变风险，从而优化治疗选择，提升患者的预后。此外，在大型筛查和随访中，模型的应用能够提高高风险患者的识别率，确保及时干预。

3.2 深度学习技术在影像组学中的应用前景

       近年来，深度学习技术，尤其是CNN（如ConvNet）在医学影像分析中的应用迅速增长。传统的影像组学方法往往需要手动定义ROI并进行特征提取，费时费力且易受人为因素干扰^{[27, 28, 29]}。本研究通过引入深度学习技术，实现了MRI影像特征的自动化提取和分析。这一方法不仅简化了工作流程，还显著提高了模型的鲁棒性和稳定性。此外，深度学习模型能够捕捉到传统放射组学无法识别的高维度影像特征，从而更准确地反映肿瘤的生物学特性。未来，随着硬件计算能力的提升和数据量的积累，基于深度学习的影像组学技术有望进一步优化，推动其在分子诊断、治疗评估和预后预测等方面的广泛应用^{[20, 30]}。通过整合多模态影像数据[如正电子发射计算机体层成像（positron emission tomography-computed tomography, PET-CT）、功能性MRI]和多组学数据（如基因组、蛋白质组），深度学习有望构建更全面的肿瘤特征图谱，为个体化医疗提供精准支持。

3.3 基于MRI影像组学模型的临床转化潜力

       本研究的影像组学模型不仅在理论上实现了对BRAF突变状态的高效预测，更具有实际的临床转化潜力。在临床实践中，传统的基因突变检测往往依赖于手术或活检获取肿瘤组织样本，具有侵入性且存在一定风险^{[31, 32, 33]}。而本研究提出的MRI影像组学模型则为患者提供了一种无创的替代方案。通过对常规MRI检查结果的深度学习分析，医生能够在患者初次就诊时快速获得基因突变信息，为后续治疗决策提供重要参考。例如，在直肠癌新辅助化疗方案的选择中，BRAF突变状态往往与患者的治疗反应和预后密切相关。通过早期识别BRAF突变状态，模型能够辅助医生选择更具针对性的治疗方案，从而提高疗效并减少不必要的治疗负担。此外，在术后随访和复发监测中，模型的应用能够帮助临床医生快速评估肿瘤的分子特征变化，为个体化的长期管理提供支持。这些优势使得MRI影像组学模型在精准医疗时代下具有广阔的应用前景。

3.4 局限性及展望

       虽然我们构建的模型取得了比较好的预测效能，但这项研究仍存在一些局限性。首先，输入图像仅限于断层MRl，如果在冠状面、矢状面或其他多层次重建图像中进行分割，可能会进一步提高研究模型的预测性能。其次，该研究包含的病例相对较少，因此建议纳入更多数据以进一步提高ConvNet模型的准确性和普遍性。未来研究可以进一步优化模型，并在更大样本量的多中心临床试验中验证其有效性。同时，结合其他生物标志物进行联合预测，可能会提升模型的预测能力，为直肠癌的个性化治疗提供更加全面的支持。

4 结论

       综上所述，本研究建立的ConvNet模型能够有效地识别直肠癌的BRAF突变状态。考虑到更好的预测结果，ConvNet模型在开发多参数模型方面具有开创性意义，有助于提高直肠癌的个体化诊断和治疗水平。