0 引言

       肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是在肝脏肿瘤中所占比例高及恶性程度高的一种，其发病率逐渐上升。HCC已经在癌症死亡人数中排名第三。全世界肝癌发病率和死亡人数总数的一半以上发生在中国^[1]，尽管有不同的HCC治疗方法选择，包括手术切除^[2]、放射治疗、化疗药物治疗等，但由于复发和转移，预后仍然很差。所以，新的肝癌生物标志物和分子靶点对HCC的早期诊断和靶向治疗有重要临床价值。近年来研究者们以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3, GPC3）为靶点进行了大量药物的研发以及功能学研究，持续开发GPC3在肝癌治疗中的新应用。GPC3在正常肝脏或肝良性病灶中几乎不表达，但GPC3在70%~80%的HCC中特异性高表达。GPC3是HCC患者术后预测肿瘤复发的一种生物标志物，GPC3低表达的患者一般预后较好^[3]，高表达的GPC3会促进HCC肿瘤的发生和转移^[4]，GPC3高表达或者由低表达变为高表达是癌症复发的危险信号。GPC3可以释放到外周循环中，但是血清GPC3的检测诊断效果存在争议。活检被认为是GPC3术前诊断的确诊方法，但由于肿瘤的不同部分具有独特的分子特征；这些特征随着时间的推移而变化，又无法在多个时间点对每个肿瘤的每个部分进行活检，因此无法通过活检样本实现肿瘤的最佳表征，而且这种方法耗时长，其侵入性方法伴随着可能的并发症，包括肿瘤内出血、肿瘤扩散。因此，迫切需要用于准确识别GPC3状态的非侵入性诊断方法。

       影像组学是计算机和医学的交叉研究，高维高通量的挖掘提取特征，这为无创诊断、治疗效果预测等开辟了前所未有的途径^[5]。因此，我们假设基于影像组学的方法可能有助于术前GPC3预测。目前基于MRI影像组学对GPC3预测较少，GU等^[6]研究了影像组学对HCC的GPC3表达的预测效能，但是他们的研究是基于常规的细胞外对比剂。

       肝细胞特异性磁共振对比剂钆塞酸二钠（gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-EOB-DTPA）由于EOB基的加入，其不仅在静脉注射后的早期阶段为细胞外对比剂，可以了解肝脏和肝肿瘤的血流动力学，而且在晚期阶段，Gd-EOB-DTPA通过在肝细胞膜上表达的转运蛋白被肝细胞摄取。有机阴离子转运多肽是Gd-EOB-DTPA摄取的主要载体^[7]。所以Gd-EOB-DTPA可以评估血流信息和肝细胞功能，在肝胆相位中，缺乏肝细胞功能的肝脏肿瘤不会增强，可以获得足够的肿瘤与肝脏对比度。Gd-EOB-DTPA在HCC的诊断中起到了积极的作用。

       因此，本文旨在研究构建Gd-EOB-DTPA MRI影像组学模型，在术前对GPC3的表达进行预测。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       查阅HIS系统里电子病历，回顾性收集2016年1月至2023年7月苏州大学附属第一医院186名HCC患者的MR平扫及增强检查的影像资料和临床指标，临床指标包括年龄、性别、乙肝感染情况，乙肝核心抗体、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、糖类抗原199（Carbohydrate antigen 199, CA199）、糖类抗原125（Carbohydrate antigen 125, CA125）及GPC3表达情况。排除60名患者后，共126名纳入本研究中，GPC3阳性77例及阴性49例。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，并通过苏州大学附属第一医院临床科研伦理委员会批准，免除受试者的知情同意，批准文号：（2024）伦研批第431号。进行数据处理及从PACS系统下载图像时，去除患者信息。

       入组标准：（1）患者做手术或穿刺病理为HCC且有GPC3免疫组化结果；（2）术前进行了Gd-EOB-DTPA增强MRI检查。排除标准：（1）临床或实验室资料不完备（病史或数据不全）；（2）MRI图像质量差（呼吸运动信号伪影等导致病灶显示不清）；（3）病灶边界与肝组织对比不鲜明，不好确定边界；（4）病灶内有坏死或出血区域超过病灶20%；（5）术前接受过射频消融、化疗栓塞术、放射治疗、药物或免疫治疗等抗肿瘤治疗（图1）。

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图1  研究病例及影像组学分析流程图。GPC3：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
Fig. 1  Research case and radiomics analysis flowchart. GPC3: Glypican-3.

1.2 图像采集

       所有MRI检查均使用带有专用相控阵体线圈的3.0 T MRI机器（Siemens Magnetom Verio 3.0 T；Siemens Magnetom Skyra 3.0 T；GE Signa HDxt 3.0 T）完成，行标准腹部MRI扫描。（1）轴位T2WI：TR 3260 ms，TE 105 ms，层厚7 mm，层间距1.4 mm，FOV 210 mm×380 mm；（2）同相位和反相位轴位T1WI：TR 4.16 ms，TE 2.58 ms（同相），TE 1.35 ms（反相），层厚5 mm，层间距1 mm，FOV 210 mm×380 mm；（3）扩散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI），b=50, 800 s/mm²，采用自由呼吸单次回波平面技术，TR 5300 ms，TE 57 ms，层厚7 mm，层间距1.4 mm，FOV 210 mm×380 mm，相应的ADC图由内置软件自动计算；（4）对比增强MRI，三维梯度回波序列与体积插值屏气检查：TR 4.18 ms，TE 1.93 ms，层厚3 mm，无层间距，FOV 210 mm×380 mm，对比剂使用Gd-EOB-DTPA（Primovist，普美显，德国拜耳医药公司），剂量0.2 mL/kg，注射速率2 mL/s，获得动脉期（arterial phase, AP）、门脉期（portal venous phase, PVP）、过渡期（transitional phase, TP）、肝胆特异期（hepatobiliary phase, HBP）和T2WI各期序列图像。

1.3 肿瘤分割和组学特征提取

       肿瘤分割，本文中病灶的勾画在ITK-SNAP软件上进行，将所有病例的MRI图像从PACS系统中下载后导入ITK-SNAP（version 3.8.0版本，http://www. itksnap.org），由一名具有8年诊断经验放射科主治医生使用ITK-SNAP软件在五个序列图像（AP、PVP、TP、HBP及T2WI）上首先在病灶清晰的序列开始手动逐层描绘横轴位病灶边缘，参照病灶清晰序列勾画其他序列，并完成三维HCC病变的勾画（图2）。当图像中有主病灶和转移灶的时候，勾画主病灶，并且与手术病理记录比对；当图像伪影较多，本病例予以舍弃；部分HCC病灶信号强度与肝背景强度对比相差欠明显，病灶边界欠清，与另外一名具有9年诊断经验的放射科主治医生共同商讨一致后进行勾画，然后由一名具有16年消化系统诊断经验的副主任医师再次审核。考虑到从不同的扫描仪获取图像，需实现图像标准化，图像被重新采样到体素1 mm×1 mm×1 mm大小^{[8, 9]}。

       特征提取使用FAE（V.0.4.2版本，https://github.com/salan668/FAE）软件包完成，提取一阶统计特征、纹理属性特征[灰度共生矩阵（gray level co-occurrence matrix, GLCM）、灰度运行长度矩阵（gray level run-length matrix, GLRLM）、灰度大小区域矩阵（gray level size zone matrix, GLSZM）、相邻灰度差异矩阵（neighborhood gray-tone difference matrix, NGTDM）和灰度依赖矩阵（gray level dependence matrix, GLDM）]、形状大小特征及小波转换等^{[10, 11]}。每个受试者可以分别从单个序列和五个序列中通过FAE获得1316个特征和6580个特征。

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图2  肝细胞癌病灶勾画示例图。2A~2E：分别为MRI 各期AP、PVP、TP、HBP 及T2WI 图；2F：病灶勾画完生成的三维展示图。AP：动脉期；PVP：门脉期；TP：过渡期；HBP：肝胆特异期。
Fig. 2  Diagram of hepatocellular carcinoma lesions delineated. 2A-2E: AP, PVP, TP, HBP, and T2WI sequences of MRI, respectively; 2F: The three-dimensional display image generated after lesion delineation. AP: arterial phase; PVP: portal venous phase; TP: transitional phase; HBP: hepatobiliary phase.

1.4 分类器模型建立

       构建临床指标模型，将临床指标（年龄、性别、乙肝感染情况，乙肝核心抗体、AFP、CA199、CA125）在GPC3阳性和阴性两组间比较，确定GPC3的独立风险因素，建立临床指标逻辑回归模型。

       构建影像组学模型，机器学习在R语言软件进行，将每例病例的AP、PVP、TP、HBP及T2WI五个序列数据按照7∶3分为训练集和测试集。采用Pearson相关性分析特征预选，最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归特征筛选（图3）。利用所提取筛选的最佳影像组学特征构建单序列、多序列影像组学逻辑回归模型（双向逐步回归）。通过对比分析，我们得出其中最优模型，将最佳的影像组学特征子集，用于后续综合预测模型的构建。

       构建临床指标联合多序列影像组学综合模型，将独立的临床指标风险因素（P<0.05）与最优的影像组学模型相结合，构建一个综合模型，将所得预测模型应用于测试集，检验模型对HCC患者GPC3阳性表达的预测效能。采用受试者工作特征（receiver operation characteristic, ROC）曲线评估所有模型的可行性，计算ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）、特异度、敏感度，并将此综合模型可视化为GPC3预测评分的列线图。

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图3  LASSO回归特征筛选。3A~3E：分别为AP、PVP、TP、HBP 及T2WI 各序列LASSO回归算法中调节参数（λ）的选择过程。LASSO：最小绝对收缩和选择算子；AP：动脉期；PVP：门脉期；TP：过渡期；HBP：肝胆特异期。
Fig. 3  LASSO regression for feature screening. 3A-3E: The selection process of adjustment parameter (λ) in LASSO regression algorithm of AP, PVP, TP, HBP and T2WI sequences. LASSO: least absolute shrinkage and selection operator; AP: arterial phase; PVP: portal venous phase; TP: transitional phase; HBP: hepatobiliary phase.

1.5 统计学分析

       统计学分析采用R语言4.1.2版本软件（使用了“stats”“pROC”等统计包，https://www.r-project.org）。计数资料符合正态分布的采用独立样本t检验，不符合正态分布的采用Mann-Whitney U检验，分类资料比较用卡方检验或Fisher确切概率法，双侧P<0.05为差异有统计学意义。将临床指标进行单因素逻辑回归分析，其中P值<0.1的变量纳入多因素逻辑回归分析。组学特征预选采用Pearson相关性分析（针对所有特征进行特征之间的相关性分析，如果某特征和其他任一特征的相关系数的绝对值大于等于所设定阈值，则剔除该特征）。剔除Pearson相关系数绝值对≥0.9的特征。经过LASSO回归，通过优化回归参数（λ），使大部分特征系数降为零，选取其余非零系数特征，获得与GPC3表达高度相关的影像组学特征。分别在训练组及测试组行Hosmer-Lemeshow检验评估临床指标联合多序列影像组学综合模型的拟合度并使用校准曲线对该综合模型进行验证，采用ROC曲线下面积AUC值来评估模型的预测能力，决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）评估临床指标联合多序列影像组学综合模型的临床实用性。

2 结果

2.1 一般临床资料

       共126例患者病例纳入本研究中，其中训练集89例（GPC3阳性表达55例，GPC3阴性表达34例），测试集37例（GPC3阳性表达22例，GPC3阴性表达15例），一般临床资料见表1。训练组内GPC3阳性及阴性组间年龄、乙型肝炎感染史、AFP差异具有统计学意义（P<0.05）；测试组内GPC3阳性及阴性组间性别、AFP差异具有统计学意义（P<0.05）。

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表1  GPC3阳性组与阴性组临床指标比较
Tab. 1  Comparison of clinical indicators between GPC3 positive and negative groups

2.2 临床指标模型结果

       将临床指标（年龄、性别、乙肝感染情况，乙肝核心抗体、AFP、CA199、CA125）进行单变量分析，其中P值<0.1的变量纳入多变量逻辑回归分析，发现AFP（P=0.006）和乙型肝炎（P=0.045）为GPC3的独立风险因素（表2），建立临床指标模型，该模型对GPC3状态预测具有中等性能，在训练集的AUC值为0.827（95% CI：0.742~0.913），在测试集的AUC值为0.779（95% CI：0.632~0.925）（图5）。

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表2  临床指标和多序列模型的单因素和多因素logistic回归分析
Tab. 2  Single factor and multiple factor logistic regression analysis of clinical indicators and multiple sequence models

2.3 单序列及多序列影像组学模型结果

       Pearson相关性分析特征预选后，AP、PVP、TP、HBP及T2WI剩余特征数分别为731、751、736、750及821个。经LASSO回归特征筛选后，AP、PVP、TP、HBP及T2WI分别特征剩余7、7、5、5及3个。各序列在训练集的AUC值分别为0.804（95% CI：0.713~0.894）、0.801（95% CI：0.711~0.892）、0.796（95% CI：0.706~0.887）、0.761（95% CI：0.660~0.863）及0.733（95% CI：0.620~0.845）；各单序列在测试集的AUC值分别为0.724（95% CI：0.555~0.894）、0.755（95% CI：0.597~0.912）、0.770（95% CI：0.619~0.920）、0.782（95% CI：0.610~0.947）及0.730（95% CI：0.561~0.900）。多序列影像组学进行特征筛选后剩余特征14个，多序列影像组学模型在训练集的AUC值为0.930（95% CI：0.879~0.981），在测试集的AUC值为0.870（95% CI：0.751~0.989）（图4）。

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图4  单序列各期模型及多序列影像组学模型在训练集（4A）及测试集（4B）的受试者工作特征（ROC）曲线。
图5  临床指标模型、多序列影像组学模型、临床指标联合多序列影像组学综合模型在训练集（5A）及测试集（5B）的ROC曲线。AUC：曲线下面积；rad.AP：动脉期模型；rad.PVP：门脉期模型；rad.TP：过渡期模型；rad.HBP：肝胆特异期模型；rad.T2WI：T2加权成像模型；combined_rad：多序列影像组学模型；combined_model：临床指标联合多序列影像组学综合模型。
Fig. 4  Receiver operating characteristic (ROC) curves of single sequence models and multi sequence radiomics models in the training set (4A) and testing set (4B).
Fig. 5  ROC curves of clinical indicator model, multi sequence radiomics model, and clinical indicator combined multi sequence radiomics comprehensive model on the training set (5A) and test set (5B). AUC: area under the curve; Rad.AP: the arterial phase model; Rad.PVP: the portal phase model; Rad.TP: the transitional period model; Rad.HBP: the liver gallbladder specific model; Rad.T2WI: T2 weighted imaging model; Combined_rad: the multi sequence model; combined_model: clinical indicator combined multi sequence omics comprehensive model.

2.4 临床指标联合多序列影像组学综合模型结果

       在单因素分析和多因素分析中，GPC3两组间AFP、乙型肝炎和多序列影像组学评分（radiomics score, rad_score）差异均存在统计学意义（P<0.05）（表2），将临床指标中GPC3的独立风险因素AFP和乙型肝炎与最优的rad_score相结合，构建了一个综合模型，并以此可视化为GPC3的预测列线图（图8），该综合模型具有良好的预测性能（表3），在训练集的AUC值为0.958（95% CI：0.919~0.997），在测试集的AUC值为0.903（95% CI：0.808~0.998），敏感度为86.4%，特异度为86.7%（图5）。

       校准曲线表明临床指标联合多序列影像组学综合模型预测HCC的GPC3状态与实际GPC3状态具有良好的一致性（图6），Hosmer–Lemeshow检验的结果显示差异无统计学意义（训练集、测试集P值分别为0.681和0.242）。DCA显示基于综合模型预测GPC3阳性及阴性具有较好的临床效用（图7）。

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图6  临床指标联合多序列影像组学综合模型校准曲线。6A：训练集；6B：测试集。
Fig. 6  Calibration curve of clinical indicator combined multi sequence omics comprehensive model. 6A: training set; 6B: testing set.

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图7  临床指标模型（clin）、多序列影像组学模型（combined_rad）及临床指标联合多序列影像组学综合模型（combined_model）的决策曲线。x轴表示阈值概率，y轴衡量净收益，绿色代表临床指标联合多序列影像组学综合模型。
图8  用于识别Glypican-3表达的综合列线图。AFP：甲胎蛋白；rad_score：影像组学评分。
Fig. 7  Decision curve analysis of clinical indicator model (clin), multi sequence omics model (combined_rad), and clinical indicator combined multi sequence radiomics comprehensive model (combined_model). The x-axis represents the threshold probability, the y-axis measures the net benefit, and green represents the clinical indicators combined with the multi sequence omics comprehensive model.
Fig. 8  Comprehensive nomogram for identifying Glypican-3 expression. AFP: alpha-fetoprotein; rad_score: radiomics score.

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表3  各模型对GPC3阳性及阴性预测效能
Tab. 3  The predictive power of each model for GPC3 positivity and negativity

3 讨论

       在本研究中，我们建立了基于MRI的影像组学模型，用于术前预测HCC患者GPC3的表达情况。首先，我们的研究表明多序列MRI影像组学模型在预测HCC患者GPC3阳性方面优于单序列模型，临床指标联合多序列影像组学综合模型可以有效地预测GPC3的表达，有潜力替代穿刺活检的获取方式，辅助临床对HCC患者进行评估及免疫治疗。

3.1 临床指标预测GPC3表达的评价

       本研究结果显示，在临床指标中AFP、乙肝感染情况为HCC患者GPC3阳性的独立风险因素，AFP水平较高倾向于GPC3阳性表达。AFP被认为是HCC的诊断和预后生物标志物^[12]，AFP通过共同参与p53（抑癌基因）转录因子网络与GPC3功能相关^[13]，p53是AFP的负调节因子^[14]，全基因组p53关联研究表明GPC3基因序列中存在p53结合基序。MORFORD等^[15]研究表明GPC3和AFP可能共享AFP调节因子2、转录因子锌指和同源盒2。

3.2 MRI组学特征的价值

       在本研究中，多序列影像组学进行特征筛选后剩余特征14个，其中包括13个纹理特征（3个GLSZM特征、2个GLDM特征、6个GLCM特征、1个GLRLM特征、1个NGTDM特征）和1个一阶特征。纹理特征可以比一阶特征更好地量化和评估肿瘤的异质性，肿瘤异质性可能源于血管生成、侵袭和凋亡等。其中11个为经过小波滤波后得到的小波特征，表明对原始图像进行小波分解的有效性。小波低频及高频域特征集，可以区分肿瘤微环境的差异^[16]。具体而言，低频特征可以滤除噪声及更好反映肿瘤轮廓信息，高频肿瘤特征反映了肿瘤边缘和细节信息。QU等^[17]构建了一个主要基于小波滤波成像特征的放射组学模型，以预测微血管侵犯，这表明小波滤波器是获取成像分解信息的强有力工具。其中，一阶偏度（Firstorder_Skewness）特征，用于描述直方图分布中成像的非对称程度，反映出GPC3阳性与GPC3阴性HCC灰度级的非对称性、不均匀性和异质性的差异。WANG等^[18]研究了影像组学特征与HCC的预后及枢纽基因之间的关系，研究表明wavelet-LLL_firstorder_Skewness与HCC的枢纽基因分泌型磷蛋白1基因呈正相关。相邻灰度差异矩阵-繁忙度特征（Ngtdm_Busyness），用于描述从像素到其临域的变化的度量，繁忙度的高值表示像素与其临域之间的强度快速变化，可能反映了肿瘤的微环境。本研究在14个特征中，GLCM占比较大，GLCM反映在给定的方向和距离上体素值出现的概率，可能更好地反映肿瘤细胞及细胞间微环境的多样性和形态异质性。在许多研究中GLCM表现出较高鉴别能力。例如，OHIRA等^[19]的研究中GLCM特征对胸腺瘤和胸腺癌有良好辨别能力。MUNDT等^[20]的研究中GLCM特征用于区分冠状动脉有钙化和无钙化表现良好。

3.3 HBP预测效能的评价

       在本次研究的单序列模型中，HBP预测效能略优于其他单序列，可能得益于Gd-EOB-DTPA的代谢特性，其不仅作为细胞外对比剂了解肝脏和肝肿瘤的血流动力学，而且通过在肝细胞膜上表达的转运蛋白被肝细胞摄取，所以可以评估血流信息和肝细胞功能。

3.4 多序列影像组学模型的优势

       我们的研究中多序列影像组学模型诊断效能优于GENG等^[21]的研究，可能原因：（1）本研究的样本量比Geng等研究中的大；（2）GENG等只采用了单序列模型，而我们的研究优势在于采用了多序列模型，在本研究中，多序列MRI的影像组学模型预测效能优于本研究及GENG等研究的单序列预测效能。有研究表明^[22]，多序列组合模型的性能要高于单序列模型，说明多序列能提供更多的信息。

       GPC3在HCC中参与Wnt通路^{[23, 24, 25]}、Hedgehog信号通路、Hippo信号^{[26, 27]}通路、巨噬细胞募集^{[28, 29]}、上皮间质转化^[30]等多种细胞通路。目前，基于GPC3靶点的多种治疗方法研究包括单克隆抗体、双特异性抗体^{[31, 32]}、GPC3衍生的肽/DNA疫苗^[33]、免疫毒素^[34]、GPC3 CAR-T细胞疗法^{[35, 36]}等。在HCC患者中，GPC3的过表达与不良预后显著相关^[37]，迫切需要GPC3靶向免疫治疗改善预后。我们的综合模型（列线图）比临床指标模型和多序列影像组学模型更有效地预测GPC3在HCC中的阳性表达。DCA显示综合模型（列线图）具有更好的临床价值。这说明影像组学特征与临床因素在诊断GPC3的表达状态具有一定的互补作用，与临床因素的组合具有较好的临床实用性。我们的综合模型（列线图）有望在术前无创地对HCC患者分层，辅助个性化免疫治疗。

3.5 本研究的局限性

       （1）样本量比较小；（2）回顾性研究选择偏倚不能避免；（3）训练数据及测试数据同属一个机构。今后多中心及更多前瞻性数据应纳入到下一步研究工作中。

4 结论

       在本次研究中，我们建立了临床指标模型、单序列Gd-EOB-DTPA增强磁共振AP、PVP、TP、HBP及平扫T2WI序列模型、多序列的影像组学模型、临床指标联合多序列影像组学综合模型。基于临床指标联合多序列影像组学综合模型可以无创有效地预测HCC GPC3阳性表达，协助临床医生对HCC患者进行精准治疗方案的选择。