0 引言

       糖尿病骨病（diabetic bone disease, DBD）是糖尿病的严重并发症之一，表现为骨质疏松、骨皮质变薄以及脆性骨折风险显著增高，而且骨折不愈合或者延迟愈合^{[1, 2, 3]}。越来越多的证据表明骨髓组织是糖尿病重要的靶器官，DBD是一种慢性骨髓微血管并发症^{[4, 5, 6]}。尽管2型糖尿病与骨折风险增加40%~70%相关，但1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）的风险增加显著更高^[7]。近年来，研究者发现了一种位于干骺端生长板以及骨干骨膜和骨内膜附近的新的毛细血管亚-H型血管，特征性表现为血管内皮细胞高表达CD31和内源性黏蛋白（CD31^hiEmcn^hi），并被证实具有诱导骨形成的能力，在成血管-成骨耦联过程中的作用至关重要^[8]。最新研究表明，H型血管的数量和功能的改变与T1DM的DBD中骨微结构改变存在重要关联^{[9, 10]}。

       本团队前期采用基于单一模态的定量影像技术和影像组学纹理分析技术在糖尿病骨髓微血管病变和微结构改变中开展了探索性研究^{[11, 12, 13]}，但骨髓H型血管结构的影像学可视化表征仍是难点。近年来，超小超顺磁性纳米氧化铁（ultra-small superparamagnetic nano-iron oxide, USPIO）对比剂在心脑血管和肿瘤血管的微血管分子标记成像中得到广泛应用^[14]，但USPIO在骨髓的微血管分子标记成像领域仍是空白。而显微CT（micro-computed tomography, Micro-CT）因其超高空间分辨率和三维无损成像特点在骨髓微血管成像中的应用效果得到了普遍认可^{[15, 16, 17]}。本研究基于骨髓USPIO增强MRI联合离体Micro-CT微血管成像方法，探索定量可视化靶向评价T1DM兔骨髓H型血管结构的可行性，通过骨髓H型血管结构的影像学可视化表征为T1DM的DBD发病相关机制提供影像学证据。

1 材料与方法

1.1 T1DM兔模型建立与分组

       本研究于2023年9月至2024年4月在武汉大学动物实验中心[SCXK（鄂）2019-0013]和武汉大学人民医院放射科开展，已通过武汉大学动物实验中心伦理审查（IACUC：NO.WP20230346），实验过程符合国家及单位有关实验动物的管理及使用规定。2~3月龄日本大耳白兔40只，体质量1.2~1.6 kg，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司[动物许可证号：SCXK（鄂）2018-0022]，所有兔适应性饲养1周后，随机分为T1DM组（n=20）和非糖尿病对照组（n=20），T1DM组在禁食不禁水12 h后麻醉（3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，1 mL/kg，武汉市硚口区中鑫程生物试剂经营部，中国）将四氧嘧啶（Sigma，美国）用生理盐水配制成5%溶液，按照60 mg/kg的剂量由耳缘静脉注入T1DM组兔体内，一周后再次禁食麻醉，按照100 mg/kg的剂量由耳缘静脉注入5%四氧嘧啶溶液；对照组于相同时间经耳缘静脉注射相同剂量生理盐水。自由进食进水48 h后，血糖仪测量T1DM组兔外周血糖浓度，单次血糖值大于14 mmol/L或2次血糖值大于11 mmol/L，认定造模成功^[18]，随后4个月每月进行血糖监测。

1.2 骨髓H型血管内皮细胞分选与鉴定

       采用流式细胞术对CD31和EMCN进行双阳性分选比较H型血管内皮细胞的占比变化，取T1DM组兔和对照组兔胫骨骨髓，根据取材部位分为干骺端部位和骨干部位，去除红细胞后制备成单细胞悬液，用完全培养基稀释至1×10⁷个细胞/mL，依次加入CD31 抗体（abcam，美国）、Donkey anti Mouse IgG二抗（Thermo Fisher，美国）、EMCN 抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）、Donkey anti rat IgG（Thermo Fisher，美国）二抗并在每次加入后分别室温避光染色30 min，洗涤重悬，采用贝克曼流式细胞分析仪（CytoFLEX，Beckman Coulter，美国）分选检测骨髓细胞中CD31^hiEmcn^hi部分，统计H型血管内皮细胞占比。

1.3 骨髓H型血管免疫荧光检测

       采用免疫荧光标记CD31和EMCN，通过荧光强度比较双阳性标记，荧光强度高的H型血管分布与未被阳性标记，荧光强度低的L型血管分布，取T1DM组和对照组兔胫骨，4%多聚甲醛（武汉安因生物科技有限公司，中国）固定后行脱钙、修剪、脱水、包埋，沿斜冠状位切片，使用CD31抗体（abcam，美国）和EMCN抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）进行免疫荧光染色，于显微镜下观察拍片。使用Image-Pro Plus 6.0分析软件分别测量干骺端和骨干区域的累积荧光强度值（IntDen）以及对应的阳性像素面积（Area），并计算出平均荧光强度=IntDen/Area。

1.4 USPIO生物安全性检测

       取对照组兔耳缘静脉取血20 mL，将红细胞用生理盐水分装稀释成2%的红细胞混悬液，分别加入0.8 mL的生理盐水、蒸馏水与浓度为10、15、20、25 μg/mL的USPIO[DMSA@Fe3O4，中科雷鸣（北京）科技有限公司，中国]，37 ℃孵育3 h后使用酶标仪测定545 nm光吸收值，以蒸馏水组作为对照组，生理盐水组作为空白组，按溶血率=[（对照孔吸光度-实验孔吸光度）／（对照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100%计算USPIO的溶血率。取新鲜骨髓组织胰酶消化配置成细胞悬液，培养24 h后去掉原培养基，分别加入0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的USPIO，继续培养24 h后，去掉培养基加100 μL 10% CCK-8的培养基孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm光吸收值，以含细胞、培养基、CCK-8组作为对照组，含培养基、CCK-8组作为空白组，按抑制率=[（对照孔吸光度-实验孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100%计算USPIO对细胞的抑制率。

1.5 骨髓血管内皮细胞体外USPIO标记与MRI

       通过体外USPIO分别标记T1DM组和对照组兔的骨髓血管内皮细胞以从细胞层面证实USPIO增强MRI的可行性，取T1DM组和对照组兔胫骨新鲜骨髓组织制成单细胞悬液，置入等渗Percoll溶液（武汉安因生物科技有限公司，中国）离心分为三层，吸取中间层细胞并洗除残余Percoll液，制成细胞悬液并计数，按1×10⁶/mL的细胞数加入内皮细胞液体培养基，置入体积分数为5%的CO2孵箱中37 ℃培养，当细胞汇合率达80%左右时，用胰酶消化细胞制成细胞悬液。分别加入0、3.125、6.25、12.5、25 μg/mL的USPIO后标记培养24 h，将标记培养完成的内皮细胞进行普鲁士蓝染色观察并计数染色细胞占比，多聚甲醛固定后于透射电镜（HITACHI HT7800，日本）下观察，并于3.0 T超导MRI设备（Signa Architect, GE Healthcare，美国）下成像，扫描序列及参数：合成MRI（MAGiC）序列，TR 4500 ms，TE 100 ms，激励次数1，层厚1.5 mm，层间距0.2 mm，扫描层数20，FOV 60 mm×60 mm，矩阵320×320，扫描时间3 min 44s。

1.6 骨髓血管内皮细胞活体USPIO增强MRI

       通过USPIO增强MRI实现糖尿病H型血管的活体靶向显影，造模成功4个月后取T1DM组和对照组兔，分别于耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液（3%耳缘静脉注射，1mL/kg，武汉市硚口区中鑫程生物试剂经营部，中国）麻醉，摆放体位呈仰卧位、足先进，在3.0 T超导MR设备（Signa Architect, GE Healthcare，美国）上固定8通道膝关节专用相控阵线圈，行胫骨斜冠状位MRI平扫，随后耳缘静脉注射USPIO溶液（浓度以Fe计：1 mg/kg）行MRI增强扫描，扫描序列及参数：合成磁共振（MAGiC）序列, TR 9942 ms，TE 21.2 ms，激励次数1，层厚0.8 mm，层间距0.2 mm，扫描层数40，FOV 120 mm×120mm，矩阵240×240，扫描时间7 min 32 s。体外和体内MR图像均在GE后处理工作站（AW4.7，GE-Healthcare，Milwaukee，WI，美国）上使用后处理软件进行重建，调节合适的窗宽窗位进行数据测量。在T1DM组和对照组兔的双侧胫骨中心层面分别手动勾画干骺端和骨干的合适面积的感兴趣区（region of interest, ROI），测量ROI的T2值，重复勾画测量3次后取平均值记为最终结果。

1.7 离体骨髓Micro-CT微血管成像

       采用Micro-CT微血管成像获取直观血管密度图像与血管体积等定量参数改变，并结合H型血管主要分布于干骺端，而L型血管主要分布于骨干的特点与USPIO增强MRI和免疫荧光结果共同对照，造模成功4个月后取T1DM组和对照组兔，分别麻醉后行心脏插管灌注生理盐水1.5 L，冲洗至流出液澄清后灌注4%多聚甲醛（武汉安因生物科技有限公司，中国）固定，灌注Microfil®MV-117（Flow Tech，美国）对比剂300 mL并置于0~4 °C冰箱过夜，取胫骨脱钙后于Micro-CT扫描仪（Skyscan 1276，比利时）成像观察，Micro-CT扫描仪扫描参数设置为：管电压70 kV，电流200 μA，分辨率20.2 μm。使用CTAn 2.6分析软件分别测量T1DM组和对照组干骺端和骨干的血管体积（vessel volume, VV）、组织体积（tissue volume, TV）和血管数量（vessel number, VN），并根据VV/TV×100%计算出血管体积分数（vessel volume/tissue volume, VV/TV）。

1.8 统计学分析

       USPIO增强MRI与Micro-CT微血管成像图像分析由两名有3年（医师A）和5年（医师B）以上骨肌影像诊断经验、对分组不知情的影像科主治医师分别独立完成，采用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）评估医师A和医师B测算得到的T2值最大改变、T2值最快时段速率、VV/TV、VN各影像参数组间的一致性，1个月后医师A再次勾画ROI，计算组内ICC评估组内的一致性。ICC标准如下：ICC<0.20表示一致性较差，0.20≤ICC<0.40表示一致性一般，0.40≤ICC<0.60表示一致性中等，0.60≤ICC<0.80表示一致性较好，0.80≤ICC<1.00表示一致性好。取二人测量的结果平均值记为最终结果。采用SPSS 26.0统计软件，对所有数据行正态性检验（Shapiro-Wilk检验）及方差齐性分析，服从正态分布以平均数±标准差表示，不服从正态分布用中位数（四分位数）表示。采用配对t检验（服从正态分布）或Wilcoxon符号秩检验（不服从正态分布）比较T1DM组和对照组在USPIO增强成像前后T2值的差异。采用独立样本t检验（服从正态分布）或Kruskal-Wallis检验（不服从正态分布）比较T1DM组与对照组间的CD31^hiEmcn^hi部分占比、荧光强度、Micro-CT血管定量参数等相关指标的差异。采用Pearson相关性分析评价T2值变化与USPIO浓度之间，骨髓不同区域的活体USPIO增强MRI的T2值最大改变、T2值最快时段速率分别与VV/TV、VN等影像定量参数改变和免疫荧光平均荧光强度等病理定量参数改变等各指标两两之间的相关性。所有结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 T1DM兔模型管理

       T1DM组定期血糖测量结果除1只血糖恢复正常剔除外，其余均满足单次血糖值大于14 mmol/L或2次血糖值大于11 mmol/L，符合糖尿病诊断要求，认定造模成功。实验期间T1DM组中2只糖尿病兔死亡，最终共17只T1DM组兔、20只对照组兔纳入分析。

2.2 骨髓H型血管内皮细胞分选与鉴定

       通过对CD31和EMCN进行双阳性分选比较，T1DM组兔和对照组兔骨髓H型血管内皮细胞分选与鉴定结果显示，T1DM组的H型血管内皮细胞占比相较于对照组明显减少（t=-7.496，P=0.001），T1DM组和对照组中干骺端的H型血管内皮细胞占比明显高于骨干（t=8.819、14.297，P<0.001）（图1）。

点击查看大图

图1  流式细胞术检测H型血管内皮细胞占比。1A为1型糖尿病（T1DM）组干骺端骨髓血管内皮细胞流式分选；1B为对照组干骺端骨髓血管内皮细胞流式分选；1C为T1DM组骨干骨髓血管内皮细胞流式分选；1D为对照组骨干骨髓血管内皮细胞流式分选；1A~1D中右上象限为CD31^hiEmcn^hi部分，记为H型血管内皮细胞占比。1E为根据CD31^hiEmcn^hi部分测定的T1DM和对照组之间干骺端和骨干的H型血管内皮细胞占比比较。*表示两组结果之间差异具有统计学意义（P<0.05）。
Fig. 1  The proportion of type-H vascular endothelial cells is detected by flow cytometry. 1A shows flow cytometric sorting of metaphyseal bone marrow vascular endothelial cells in the type 1 diabetes mellitus (T1DM) group; 1B displays control group metaphyseal sorting; 1C presents diaphyseal sorting in T1DM rabbits, and 1D illustrates control group diaphyseal sorting. The upper-right quadrant in 1A-1D represents the CD31^hiEmcn^hi population, denoted as type H endothelial cell percentage. 1E provides the proportional comparison of CD31^hiEmcn^hi-determined type H endothelial cells between T1DM and control groups across metaphysis versus diaphysis. * shows a significant difference between the two groups (P < 0.05).

2.3 骨髓H型血管免疫荧光检测

       通过免疫荧光双阳性标记CD31和EMCN以荧光强度说明H型血管与L型血管的分布，合并CD31、EMCN免疫荧光染色结果显示，T1DM组兔的骨髓组织的CD31、EMCN的表达强度相较于对照组兔均明显降低（t=-8.983、-11.994，P<0.001），T1DM组和对照组中干骺端的CD31、EMCN的表达强度明显高于骨干（t=6.191、29.410，P<0.001）（图2）。

点击查看大图

图2  1型糖尿病（T1DM）组和对照组兔胫骨免疫荧光结果。2A：T1DM组和对照组兔胫骨免疫荧光图像，红色：EMCN；绿色：CD31；mp：干骺端；dp：骨干。2B：T1DM组与对照组的干骺端和骨干的EMCN免疫荧光平均强度结果。2C：T1DM组与对照组的干骺端和骨干的CD31免疫荧光平均强度结果。*表示两组结果之间差异具有统计学意义（P<0.05）。
Fig. 2  Results of tibia immunofluorescence in type 1 diabetes mellitus (T1DM) group and control group. 2A: tibia immunofluorescence images of rabbits in T1DM group and control group, red: EMCN; green: CD31; mp: metaphysis; dp: diaphysis. 2B: EMCN immunofluorescence intensity results of metaphyseal and diaphysis in T1DM group and control group. 2C: CD31 immunofluorescence intensity results of metaphyseal and diaphysis in T1DM group and control group. * shows a significant difference between the two groups (P < 0.05).

2.4 USPIO生物安全性检测

       兔红细胞混悬液与不同浓度USPIO孵育后溶血率见图3A，兔骨髓组织与不同浓度USPIO孵育24 h后细胞存活情况见图3B，结果表明对比剂剂量（1 mg/kg）下的USPIO生物安全性良好。

点击查看大图

图3  超小超顺磁性纳米氧化铁（USPIO）生物安全性检测结果。3A：对比剂剂量（1 mg/kg）下的USPIO不会引起药物安全范围外的溶血反应；3B：对比剂剂量（1 mg/kg）下的USPIO不会引起药物安全范围外的骨髓组织细胞增殖抑制。
Fig. 3  USPIO biosafety test results. 3A: ultra-small superparamagnetic nano-iron oxide (USPIO) at contrast agent dose (1 mg/kg) does not cause hemolytic reactions outside the safe range of the drug; 3B: USPIO at contrast agent dose (1 mg/kg) does not induce proliferation inhibition of bone marrow tissue cells outside the safe range of the drug.

2.5 骨髓血管内皮细胞体外USPIO标记与MRI

       从细胞层面证实USPIO增强MRI的可行性，不同浓度USPIO体外标记T1DM组和对照组兔骨髓血管内皮细胞后进行普鲁士蓝染色观察和透射电镜扫描，随后进行MAGiC MRI并定量其T2值，结果见图4，表明兔骨髓血管内皮细胞可以摄取USPIO，MRI图像的T2值与USPIO浓度呈负相关（r=-0.877，P=0.001），T2值随USPIO浓度升高逐渐降低。

点击查看大图

图4  骨髓血管内皮细胞体外超小超顺磁性纳米氧化铁（USPIO）标记结果。4A、4B：1型糖尿病（T1DM）和对照组的USPIO标记兔骨髓血管内皮细胞后普鲁士蓝染色结果，黑箭：被USPIO标记而被普鲁士蓝染色的骨髓血管内皮细胞。4C、4D：T1DM和对照组在透射电镜下摄取了USPIO的骨髓血管内皮细胞，白箭：已经位于骨髓血管内皮细胞内的USPIO；黄箭：摄取了USPIO的内皮细胞囊泡。4E：不同浓度的USPIO标记后的兔骨髓血管内皮细胞混悬液MR图像。4F：不同浓度的USPIO标记后的兔骨髓血管内皮细胞混悬液MRI图像的T2值随USPIO浓度变化曲线。
Fig. 4  Results of ultra-small superparamagnetic nano-iron oxide (USPIO) labeling of bone marrow endothelial cells in vitro. 4A, 4B: prussian blue staining results of USPIO-labeled rabbit bone marrow endothelial cells in type 1 diabetes mellitus (T1DM) and control group. Black arrow: bone marrow endothelial cells labeled by USPIO and stained with Prussian blue. 4C, 4D: The bone marrow endothelial cells of USPIO are ingested by T1DM and control group under transmission electron microscope. White arrow: USPIO already located in bone marrow endothelial cells; Yellow arrow: endothelial cell vesicles ingested by USPIO. 4E: MRI images of labeled rabbit bone marrow vascular endothelial cell suspension. 4F: T2 values of MRI images from rabbit bone marrow vascular endothelial cell suspensions labeled with varying USPIO concentrations plotted versus USPIO concentration.

2.6 USPIO增强MRI联合骨髓Micro-CT微血管成像与免疫荧光对照

       T1DM组和对照组的干骺端与骨干的影像定量参数比较见表1，影像定量参数的组间和组内的一致性分析见表2，各图像定量参数测量的观察者间及观察者自身ICC为0.80~0.95（P<0.01），表明一致性好。将USPIO增强MRI结果联合骨髓Micro-CT微血管成像与免疫荧光共同对照，注射USPIO前T1DM的骨髓区域MRI的T2值明显高于对照组（P<0.05）。在USPIO注射后，T1DM组骨髓T2值明显降低（P<0.05），而对照组T2值差异无统计学意义（P>0.05）。在T1DM组内，干骺端骨髓（图5A红色圆圈）相较于骨干骨髓（图5A白色圆圈）T2值变化出现得更快，持续时间更长，最低值更低，具体表现为干骺端骨髓在12 h时已接近最近水平，而骨干骨髓则在24 h时达到最低水平，且干骺端骨髓T2值改变幅度更大（图5B）。Micro-CT微血管图像显示，T1DM的干骺端和骨干处微血管的VV/TV和VN均出现明显降低（P<0.05）（图5C）。联合免疫荧光的病理结果统计发现，T1DM组与对照组间T2值最大改变和最快时段速率与离体骨髓Micro-CT微血管图像的VV/TV、VN及CD31、EMCN的免疫荧光的平均荧光强度值均呈显著负相关（r值=-0.98、-0.98、-0.93、-0.97、-0.98、-0.97、-0.91、-0.97，P<0.05）。

点击查看大图

图5  USPIO增强MRI和骨髓显微CT（Micro-CT）微血管图像及定量参数。5A：1型糖尿病（T1DM）组和对照组在超小超顺磁性纳米氧化铁（USPIO）（1 mg/kg）注射前和注射后24 h的MAGiC MRI图像和离体骨髓微血管Micro-CT图像。MAGiC T2 mapping中圆圈为手动勾画的胫骨骨髓感兴趣区。红色圆圈：干骺端骨髓感兴趣区；白色圆圈：骨干骨髓感兴趣区。箭：干骺端处微血管。5B：T1DM组的干骺端和骨干与对照组在USPIO注射后T2值随时间的变化曲线。
Fig. 5  Ultra-small superparamagnetic nano-iron oxide (USPIO)-enhanced MRI and bone marrow Micro-CT microvasculature images with quantitative parameters. 5A：MAGiC MRI images and Micro-CT images of isolated bone marrow microvessels are obtained before and 24 h after USPIO (1 mg/kg) injection in type 1 diabetes mellitus (T1DM) group and control group. The circles in MAGiC T2 mapping are the tibial bone marrow areas of interest outlined manually. Red circle: metaphyseal bone marrow area of interest; White circle: diaphyseal bone marrow area of interest. Arrow: Microvessels at metaphyseal. 5B: The change curve of T2 values in metaphyseal and diaphysis of T1DM group and control group after USPIO injection with time.

点击查看表格

表1  T1DM组和对照组的干骺端与骨干的影像定量参数评价
Tab. 1  Quantitative imaging parameter comparison of metaphysis and diaphysis between T1DM and control group

点击查看表格

表2  影像定量参数的组间和组内的一致性分析
Tab. 2  Inter- and intra-group agreement analysis of quantitative imaging parameters

3 讨论

       本研究首次证实T1DM兔和正常兔的骨髓血管内皮细胞通过囊泡胞吞摄取USPIO，T1DM的USPIO增强MRI结果显示干骺端骨髓相较于骨干骨髓T2值变化出现得更快，持续时间更长，最低值更低。离体骨髓Micro-CT微血管成像结果发现，T2值改变越大、变化越快的干骺端骨髓区域，以H型血管为主的VV/TV和VN降低幅度以及免疫荧光平均荧光强度降低幅度越大。

3.1 H型血管空间异质性改变

       最近多项研究采用空间转录组学和单细胞RNA测序等方法，从病理和免疫等角度提出了骨髓微血管可能存在着血管结构和血管内皮细胞功能的空间异质性的概念^{[19, 20]}。KUSUMBE等^[8]首次发现骨髓血管内皮细胞表面标志物EMCN和CD31的表达差异，将骨髓微血管分为H型血管和L型血管。H型血管主要分布在骨内膜下及长骨的干骺端，呈现密集的树状分支网络，形成丰富的毛细血管丛，并直接与动脉和远端小动脉流出的富氧血相通，细胞增殖与代谢速度较周围区域更快；而L型血管主要分布在骨干，沿骨长轴纵向以简单直管走行，分支较少，在不同骨骼发育状态的个体中其生长分布情况通常无明显差异。最新研究结果表明，以H型血管为靶点通过改善血管内皮生长因子的分泌从而增加血管内皮细胞的增殖和微血管的新生，增强H型血管的生成与成骨的耦合，可以改善DBD的发展和预后 ^{[21, 22]}。

       H型血管内皮细胞是成骨微环境中不同细胞群之间双向分子串扰的枢纽，是多模态成像探索骨髓成血管-成骨耦联机制的关键靶点^[23]。Micro-CT可以获得高空间分辨率的骨髓整体微血管结构图像并进行定量分析，对研究微血管形态表征改变有着良好潜在价值，在H型血管靶向追踪中可以与病理结果共同对照以直观显示和定量微血管改变^{[24, 25]}。本研究通过流式细胞术和免疫荧光证实了兔的H型血管集中分布于骨髓的干骺端，与对照组比较，T1DM兔骨髓H型血管数量和结构计量形态学参数差异有统计学意义；在此基础上采用基于USPIO增强MRI联合离体Micro-CT微血管成像技术，通过T2值变化与血管体积等定量参数改变说明T1DM的微血管改变，首次分别从活体和离体层面共同证实T1DM兔干骺端、骨干不同骨髓区域的H型血管存在空间异质性改变，H型血管的新生已被证实与骨形成和骨折愈合具有重要联系^[10]，探索T1DM的骨髓H型血管空间异质性特点有望为临床早期预测与评估T1DM脆性骨折风险提供思路，为预防和改善T1DM患者DBD预后提供决策支持。

3.2 USPIO分子靶向成像

       骨髓微血管作为参与机体物质交换的重要网状内皮组织系统，构成了骨髓造血干细胞的功能性生态位微环境^[26]。研究^{[27, 28, 29]}表明，网状内皮系统通透性等功能的改变可以导致纳米颗粒药代动力学的变化，从而实现对特定炎症组织的靶向追踪，本研究选用核心直径7 nm的USPIO（DMSA@Fe3O4）作为网状内皮系统差异性T2对比剂，首次探索基于USPIO增强MRI在表征T1DM骨髓H型血管中应用价值。糖尿病可以通过氧化应激损伤和脂质代谢紊乱导致骨髓微血管出现包括炎症和内皮细胞功能损伤在内的多种功能障碍 ^{[30, 31]}，从而出现对纳米颗粒的摄取水平升高。本研究结果显示：基于USPIO增强MRI的骨髓T2值改变在T1DM组和对照组之间差异具有统计学意义，并且围绕USPIO摄取总量和速度中干骺端骨髓相较于骨干骨髓T2值变化出现得更早，持续时间更长，最低值更低；离体与活体的USPIO标记实验共同说明T1DM以H型血管为主的骨髓微血管发生了结构和功能改变化。本团队前期采用基于DCE-MRI骨髓微血管渗透性定量成像技术、影像组学和代谢组学整合研究，证实了在糖尿病骨髓早期存在着血管内皮渗透性和血流灌注的功能改变^{[11, 12]}，本研究通过USPIO分子靶向成像联合Micro-CT微血管成像与免疫荧光的病理结果，揭示了T1DM骨髓在干骺端和骨干的微血管类型、结构、数量和功能的空间异质性改变以及时序变化趋势，提示了USPIO作为纳米对比剂在监测糖尿病骨髓微血管病变应用中的可能性，为围绕H型血管改变为中心的DBD诊疗策略提供了定量影像学证据。

3.3 局限性

       本研究存在一定局限性：（1）本研究对象为T1DM兔模型，与临床糖尿病疾病进程存在一定差异；（2）胫骨骨髓中部分微血管可能未连接到中心血管树，从而导致增强MRI和Micro-CT成像过程中的灌注不足；（3）本研究未开展基于骨髓H型血管DCE-MRI渗透性和骨微结构改变的相关性研究。

4 结论

       T1DM兔骨髓微血管存在基于H型血管分布差异导致的数量和功能上的空间异质性，基于USPIO增强MRI联合离体Micro-CT微血管成像定量可视化靶向评价T1DM兔骨髓H型血管结构是可行的，为探索糖尿病骨髓微血管病变提供影像学证据。