0 引言

       孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一种常见的神经发育障碍性疾病，其核心症状是社会交往和沟通障碍、刻板重复行为和狭隘的兴趣。据报道，美国每36名儿童中就有1名被确诊为ASD^[1]。国内ASD儿童的患病率也在逐年增加，给家庭和社会带来沉重的经济和情感负担^{[2, 3]}。目前ASD的病理生理机制并不明确，ASD儿童的诊断主要依靠临床医生和相关临床量表的评估。ASD儿童通常在2~5岁之间确诊，然而有些异常行为表现在1岁左右就可发现，研究表明，对ASD儿童实施早期干预能够有效地改善其症状。因此寻找一种客观的影像学标志物以实现ASD儿童的早期诊断就显得尤为重要。

       定量磁化率成像（quantitative susceptibility mapping, QSM）可以量化人体组织内的磁化率变化，可以无创评估儿童神经系统发育水平^{[4, 5]}。有研究指出2~4岁ASD儿童的尾状核、红核、黑质、齿状核等脑区铁含量低于正常值^[6]，可能是由于铁含量的降低影响了这些脑区的髓鞘化及神经元的生成，因此脑铁含量的降低可能是ASD的一种潜在的致病因素，然而该研究对于这些脑区的铁含量与患儿的临床症状的相关性并未探索。本研究首次将ASD儿童按照严重程度再次进行分组比较，来探讨脑铁含量是否能够判断ASD儿童的严重程度。因此本研究的主要目的是采用QSM技术探索1~6岁学龄前ASD儿童和正常发育儿童脑铁含量的差异及其与临床症状和ASD严重程度的相关性，为ASD儿童的病理生理机制研究提供新的依据，并为ASD儿童的早期诊断提供新的影像学标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       依据纳排标准，纳入2023年11月至2024年6月期间经郑州大学第三附属医院儿童发育行为科确诊的30例ASD儿童作为试验组（ASD组），同时间段招募了30例年龄和性别相匹配的典型发育（typically developing, TD）儿童作为正常对照组（TD组）。ASD组纳入标准：（1）年龄1~6岁，右利手，汉族；（2）患儿符合美国精神障碍诊断和统计手册（DSM-Ⅴ）^[7]孤独症的诊断标准；（3）无癫痫、脑白质发育不良、抽动障碍等其他可能影响儿童生长发育及认知的神经系统功能疾病或精神疾病；（4）无神经药物治疗史；（5）常规颅脑MRI检查未见异常。TD组纳入标准：（1）年龄1~6岁，右利手，汉族；（2）无个人或家族ASD病史；（3）无癫痫、脑白质发育不良、抽动障碍等其他可能影响儿童生长发育及认知的神经系统功能疾病或精神疾病。ASD组和TD组共同排除标准：（1）临床资料或影像图像不完整；（2）因头动等原因导致图像质量差，不满足后续处理及分析要求。

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经郑州大学第三附属医院伦理委员会的批准，所有受试者的法定监护人均签署知情同意书，批准文号：2023-057-01、2024-105-01。

1.2 一般临床资料收集

       收集ASD儿童和正常发育儿童的基本临床资料，如月龄、性别、体质量、Gesell发育量表评分^[8]和儿童孤独症评定量表（Childhood Autism Rating Scale, CARS）评分^[9]等。Gesell发育量表包括适应性、大运动、精细动作、语言和个人社交5个能区，各个能区的发育水平以发育商（development quotient, DQ）表示。CARS量表包含15项内容，总分低于30分为非孤独症，总分在30~36分之间为轻中度孤独症，总分在37分及以上为重度孤独症。

1.3 MRI检查设备及参数

       所有MRI图像均在GE 3.0 T扫描仪（SIGNA. Pioneer）采用16通道头颈联合线圈进行采集。所有儿童均静脉给予0.8 μg/kg的盐酸右美托咪定注射液镇静后扫描，磁共振扫描前患儿家属均签署知情同意书。扫描序列包括常规序列[轴位的T1WI、T2WI、T2液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery, FLAIR）、扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）和矢状位T1WI]和QSM序列。扫描参数如下：（1）轴位T1WI，TR 1750 ms，TE 24 ms，FOV 240 mm×240 mm，层厚5 mm，层间距1.5 mm，层数23；（2）轴位T2WI，TR 5552 ms，TE 128 ms，FOV 240 mm ×240 mm，层厚5 mm，层间距1.5 mm，层数23；（3）轴位T2 FALIR，TR 8000 ms，TE 120 ms，FOV 240 mm×240 mm，层厚5 mm，层间距1.0 mm，层数23；（4）矢状位T1WI，TR 1800 ms，TE 26 ms，FOV 240 mm×240 mm，层厚5 mm，层间距1.0 mm，层数19；（5）DWI，TR 4000 ms，TE 85 ms，FOV 240 mm×240 mm，层厚5 mm，层间距1.5 mm，层数23，b值为1000 s/mm²；（6）QSM，TR 25.8 ms，TE 3.5 ms，FOV 240 mm×240 mm，层厚2 mm，层数70。总的扫描时间为9 min 10 s。

1.4 图像处理和分析

       数据处理前，由两名具有5年以上工作经验的放射科主治医师对所有图像进行评估，以排除脑内有明显结构异常或者有伪影、图像质量差的图像，然后将所有受试者的QSM原始图像导入Matlab（MathWorks, R2019b, U.S.）软件的STISuite v3.0工具包中（https://people. eecs.berkeley.edu/~chunlei.liu/software.html）^[10]对数据进行磁敏感量化后处理，通过相位解缠、去除背景场、磁化率反演等步骤，获得全脑QSM定量图和幅值图。将QSM定量图和幅值图同时导入ITK-SNAP 3.8.0软件（www.itksnap.org）进行感兴趣区（region of interest, ROI）的勾画，ROI包括额叶白质、颞叶白质、顶叶白质、枕叶白质、尾状核、苍白球、壳核、丘脑、胼胝体膝部、胼胝体压部、红核、黑质、齿状核、脑桥（图1），每个ROI测量三次后取平均值作为最终值。勾画时采用ITK-SNAP中圆形测量工具，在各个脑区的最佳显示层面上用圆形笔刷进行勾画，每个ROI的大小依据结构大小，额叶白质、颞叶白质、顶叶白质、枕叶白质、尾状核、壳核、苍白球、胼胝体膝部、胼胝体压部、脑桥、齿状核、红核和黑质为5个体素，丘脑为9个体素，拥有双侧解剖结构的ROI勾画时保持左右对称。以上测量均由两名具有5~10年儿科脑神经影像诊断经验的主治医师和副主任医师完成，医师在勾画过程中并不了解患者的具体分组情况及临床资料。

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图1  在QSM定量图中勾画ROI的示意图。1、2：额叶白质；3、4：颞叶白质；5、6：顶叶白质；7、8：尾状核；9、10：壳核；11、12：苍白球；13、14：丘脑；15、16：枕叶白质；17：胼胝体膝部；18：胼胝体压部；19、20：黑质；21、22：红核；23：脑桥；24、25：齿状核。QSM：定量磁化率成像；ROI：感兴趣区。
Fig. 1  Schematizing ROI in a quantitative QSM chart. 1, 2: Frontal white matter; 3, 4: Temporal white matter; 5, 6: Parietal white matter; 7, 8: Caudate nucleus; 9, 10: Putamen; 11, 12: Globus pallidum; 13, 14: Thalamus; 15, 16: Occipital white matter; 17: Genu of corpus callosum; 18: Splenium of corpus callosum; 19, 20: Substantia nigra; 21, 22: Red nucleus; 23: Pons; 24, 25: Dentate nucleus. ROI: region of interest; QSM: quantitative susceptibility mapping.

1.5 统计学分析

       采用SPSS 26.0软件（IBM, Armonk, NY, USA）和GraphPad prism（version 9.5; https://www.graphpad-prism.cn/）对数据进行统计分析和绘图。使用Shapiro-Wilk检验方法对所有数据进行正态性检验，服从正态分布的定量资料以（x¯±s）表示，ASD组和正常对照组的差异性比较和性别差异比较使用两独立样本t检验，三组之间的差异性比较使用ANOVA分析；不服从正态分布的定量资料以M [P25，P75]表示，ASD组和正常对照组的差异性比较和性别差异比较使用Mann-Whitney U检验，三组之间的差异性比较使用Wilcoxon秩和检验；定性资料用频数和频率表示，差异性比较使用χ²检验。将两组间差异具有统计学意义的感兴趣区的磁化率值与Gesell发育量表进行相关性分析，符合正态分布时使用Pearson相关分析，否则使用Spearman相关分析。采用组内相关系数（intra-class correlation efficient, ICC）比较不同脑区磁化率值在两个测量者之间的一致性。ICC>0.75表示一致性良好，0.40~0.75表示一致性一般，<0.40表示一致性差。使用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评价各感兴趣区内磁化率值的诊断效能。按照严重程度分组后，三组之间各感兴趣区内磁化率值的差异均通过Tukey's多重比较校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

       对ASD组和TD组的月龄、体质量和性别分别进行比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。按照ASD严重程度分组后，轻中度组、重度组与正常对照组的性别、月龄和体质量差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

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表1  ASD组和TD组一般资料比较
Tab. 1  Comparison of general information between ASD and TD groups

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表2  轻中度组、重度组与正常对照组一般资料比较
Tab. 2  Comparison of general information between mild-moderate group, severe group and normal control group

2.2 ASD组各脑区磁化率值与年龄的相关性分析及不同性别ASD儿童磁化率值差异分析

       将ASD组儿童各脑区的磁化率值与年龄进行偏相关分析（控制了性别）发现，双侧苍白球，右侧尾状核及双侧黑质的磁化率值与年龄存在显著相关性（P<0.05）。将ASD儿童按照性别分成两组，比较两组之间各脑区的磁化率值，结果显示ASD男童右侧枕叶白质的磁化率值低于女童（P<0.05）。

2.3 ASD组与TD组各ROI内一致性检验及磁化率值比较

       所有ROI内的磁化率值在两个测量者之间的一致性均良好（ICC均>0.75，P值<0.05）。统计ASD儿童与健康儿童各ROI内的磁化率值，并比较两组儿童各ROI内磁化率值的差异。结果显示，相比于健康儿童，ASD儿童的双侧额叶白质、左侧颞叶白质、双侧红核、双侧黑质和双侧齿状核的磁化率值明显降低（P<0.05）（表3、图2）。

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图2  ASD组与TD组各ROI内磁化率值比较图。*：P<0.05。ASD：孤独症谱系障碍；TD：典型发育；ROI：感兴趣区。
Fig. 2  Comparison plot of magnetic susceptibility values within each ROI between the ASD group and the normal control group. * : P < 0.05. ASD: autism spectrum disorder; TD: typically developing; ROI: region of interest.

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表3  ASD组与TD组各脑区磁化率值比较
Tab. 3  Comparison of magnetic susceptibility values in each brain region between ASD and TD groups

2.4 ASD儿童各ROI内磁化率值与Gesell发育量表评分的相关性

       分析ASD儿童各ROI内的磁化率值与Gesell发育量表各能区得分的相关性。结果显示，ASD儿童左侧额叶白质的磁化率值与语言得分呈正相关（r=0.315, P=0.001）（图3A），右侧红核的磁化率值与精细动作得分呈正相关（r=0.160, P=0.029）（图3B）。其余各个ROI的磁化率值与Gesell发育量表各能区得分无明显相关性（P>0.05）。

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图3  ASD组ROI内磁化率值与Gesell发育量表的相关性分析。3A：左侧额叶白质磁化率值与语言能区得分；3B：右侧红核磁化率值与精细动作能区得分。ASD：孤独症谱系障碍；ROI：感兴趣区。
Fig. 3  Correlation analysis of magnetic susceptibility values within the ROI and the Gesell Developmental Scale in the ASD group. 3A: The left frontal white matter magnetic susceptibility values and language scores; 3B: The right red nucleus magnetic susceptibility values and fine motor scores. ASD: autism spectrum disorder; ROI: region of interest.

2.5 磁化率值的诊断效能分析

       受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析表明，左侧额叶白质、右侧额叶白质、左侧颞叶白质、左侧红核、右侧红核、左侧黑质、右侧黑质、左侧齿状核、右侧齿状核诊断ASD儿童的AUC值分别为0.694、0.686、0.736、0.677、0.634、0.692、0.649、0.671和0.752（P均<0.05），其中右侧齿状核的AUC值最高，为0.752（图4）。最佳截断值、特异度和敏感度详见表4。

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图4  磁化率值的ROC曲线分析。ROC：受试者工作特征。
Fig. 4  ROC curve analysis of magnetic susceptibility values. ROC: receiver operating characteristic.

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表4  磁化率值的诊断效能分析
Tab. 4  Diagnostic efficacy analysis of magnetic susceptibility values

2.6 磁化率值在正常对照组、轻中度组、重度组之间的差异

       为进一步研究这些脑区的磁化率值对于判断ASD儿童的严重程度是否具有参考意义，我们通过CARS评分将ASD儿童按照严重程度分为轻中度组和重度组进行比较。结果显示右侧额叶白质、左侧颞叶白质、右侧齿状核和左侧红核的磁化率值在正常对照组和轻中度组之间差异有统计学意义（图5）。右侧齿状核的磁化率值在正常对照组和重度组之间差异有统计学意义（图5C）。

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图5  各ROI内磁化率值在正常对照组、轻中度组、重度组之间的差异。*：P<0.05。ROI：感兴趣区。
Fig. 5  Differences in magnetic susceptibility values within each ROI between normal control, mild-moderate, and severe groups. * : P < 0.05. ROI: region of interest.

3 讨论

       本研究基于QSM技术比较ASD儿童与正常发育儿童不同脑区内磁化率值，并与发育量表相结合，对ASD儿童脑内铁含量的改变及其与临床症状的相关性进行探究，且本研究首次将ASD儿童按照严重程度再次进行分组比较，来探讨有差异脑区的脑铁含量是否能够判断ASD儿童的严重程度。结果发现：与健康儿童相比，ASD儿童多个脑区的磁化率值明显降低，且与临床量表具有一定的相关性；ROC曲线分析表明，右侧齿状核的AUC值最高，为0.752，且右侧额叶白质、左侧颞叶白质、右侧齿状核和左侧红核的磁化率值在区分ASD儿童严重程度上可能具有参考意义。既往关于QSM与ASD儿童的研究仅关注不同脑区内磁化率值的改变，没有与ASD儿童的临床症状相结合，本研究不仅探讨了不同脑区的铁含量差异，还探究了不同脑区铁含量与临床症状的相关性，并进一步探讨了这些脑区的磁化率值对于判断ASD儿童的严重程度是否具有参考意义，旨在为ASD儿童的诊断提供一个新的影像学标志物。

3.1 铁元素与神经发育障碍的关系及QSM技术的应用

       铁元素作为多种蛋白质的关键成分，参与机体如氧转运、氧化磷酸化、髓鞘产生及神经递质的合成和代谢等^{[11, 12]}许多过程，铁代谢的改变可能会导致身体稳态失衡，铁元素过多或过少都会导致人体功能异常，多项研究指出，铁代谢异常与神经发育和精神障碍有关^{[13, 14]}，如抑郁症、焦虑障碍、精神分裂症、多动症、ASD等^{[15, 16, 17, 18]}均能检测到脑内铁的异常沉积。因此非侵入性的精确量化各个脑区的铁含量，并探讨其与ASD临床症状的相关性和严重程度的相关性对于ASD的诊断、治疗和预后都有重要意义。QSM技术可以量化人体组织的磁化率变化，相较于传统磁敏感加权成像、R2^*、T2^*等技术，QSM技术对于探讨脑内铁含量的变化具有独特的优势，可无创评估儿童神经系统发育水平^[4]。

3.2 ASD组各脑区磁化率值与年龄的相关性及性别差异分析

       研究显示多个脑区的磁化率值与年龄存在相关性，程卓等^[6]按照年龄段分组探讨发现随着年龄增加，磁化率值降低的脑区增加。且有研究^[19]发现，ASD儿童在2岁之前，大脑的灰质与白质体积显著增加。因此，ASD儿童的大脑改变有明显的年龄依赖性。但由于本研究的样本量较小，无法将ASD儿童按照年龄进一步分组比较，下一步可以扩大样本量并分别分析各年龄段的差异。在对ASD儿童的性别差异分析中发现，ASD男童右侧枕叶白质的磁化率值低于女童。ASD的一个标志性特征是其发育早期大脑的异常过度增长^[20]。有研究表明，ASD儿童的早期大脑过度生长与性别有关，与对照组相比，男性脑体积的过度生长较女性更为显著^[21]。男性脑体积增大，导致髓鞘等抗磁性物质增多，从而导致右侧枕叶白质的磁化率值低于女童。

3.3 ASD组与TD组磁化率值差异分析

       研究结果显示与正常对照儿童相比，ASD儿童各个脑区的磁化率值均降低，这与之前的研究结果一致^{[6, 22]}，表明这可能是ASD的一种潜在致病因素。然而，这一结果是否适用于所有年龄段的ASD儿童仍需进一步研究。本研究表明ASD儿童的额叶白质、左侧颞叶白质的磁化率值明显降低。与DU等^[23]的研究结果一致，这可能与ASD儿童早期脑体积过度发育有关^{[24, 25]}，储康康等^[26]通过纵向比较发现与健康儿童相比ASD儿童的额叶和颞叶的白质体积增加，RIDDLE等^[27]发现ASD儿童的额叶、顶叶、颞叶较正常儿童增大。另一个研究^[28]发现ASD儿童脑体积的增加在不同脑区的增加程度不同，额叶和颞叶受到的影响要大于枕叶和顶叶。HARADA等^[29]表明髓鞘为抗磁性物质，因此，ASD儿童早期额颞叶体积增大^[28]，髓鞘成分增加，髓鞘成分中抗磁性物质增加磁化率值减低。本研究还表明，与正常儿童相比，ASD儿童两侧的红核、黑质、齿状核的磁化率值明显下降。红核、黑质和齿状核是富含铁的脑区，磁化率值的下降可能表明这些ASD儿童这些区域的铁沉积减少或铁代谢异常。红核是一个运动区域，在调节体态和维持运动协调上具有重要作用，也是连接大脑皮层、丘脑、脊髓、小脑、脑干的通路的一部分。脑内的铁大多储存在铁蛋白（或含铁血黄素）中，或在多巴胺能神经元神经黑色素中^[30]，红核铁含量的降低可能与少突胶质细胞功能减低，对铁蛋白或含铁血黄素的摄取减少有关。红核铁含量的降低反过来影响相应回路的功能，从而导致ASD儿童出现运动、语言方面的功能异常。黑质是调节运动的重要中枢，其致密部主要为多巴胺能神经元，其合成的多巴胺经黑质纹状体纤维释放到新纹状体，来调节纹状体的功能活动，黑质铁含量的减少可能与多巴胺能神经元的异常有关^[31]，在一些基因敲除的孤独症动物模型中发现多巴胺神经元的数量、形态和结构发生了变化^[32]，大量临床和动物模型^[33]的研究表明，多巴胺系统异常是孤独症的病理机制之一，研究表明多巴胺系统的异常与孤独症的核心症状重复刻板行为有关^[34]。齿状核作为小脑最重要的传出神经中枢，主要参与运动的启动和协调^[35]。齿状核的磁化率降低可能与浦肯野神经元及兴奋-抑制调节异常有关，铁元素参与神经元细胞的合成，一项关于ASD的尸检样本^[35]发现小脑皮层浦肯野细胞减少，因此铁含量降低，从而导致磁化率值减小。

3.4 ASD儿童各ROI内磁化率值与Gesell发育量表评分的相关性分析

       本研究相关性分析发现左侧额叶白质的磁化率值与语言得分呈正相关，额叶是大脑的前部区域，负责多种高级认知功能和行为调控，主要参与执行功能、注意力与工作记忆、情绪与行为调节、奖励机制、运动控制等重要人体功能，在额叶还有一个重要的Broca区^[36]，与语言产生相关，特别是在言语表达和语言结构等方面发挥作用。WEBER等^[37]、LI^[38]等研究表明ASD的非典型偏侧化反映了ASD左半球白质的异常连接，并与ASD的语言和社交障碍有关。本研究相关性分析还发现右侧红核的磁化率值与精细动作得分呈正相关。皮质红核束是连接大脑皮层和红核的神经通路，在调节运动和维持运动等方面发挥重要作用^[39]。而DU等^[23]的研究则发现右侧苍白球的磁化率值与精细动作评分呈正相关。苍白球^[40]作为基底节的一部分，位于大脑前脑深部，对于运动控制、认知功能以及情绪调控具有重要作用。红核通过红核脊髓束直接参与精细动作的执行（如手部协调），而苍白球更多调控运动的启动与抑制。二者的相关性可能分别指向动作执行与运动控制的不同环节异常。然而，ASD儿童的运动障碍究竟源于执行障碍还是控制失调，抑或二者兼有，需要进一步验证。且由于ASD儿童的临床异质性较高，下一步需要进一步增加样本量来继续探讨，并结合病理学和解剖发现，进一步明确ASD儿童铁代谢异常所影响的运动通路。

3.5 磁化率值在正常对照组、轻中度组、重度组之间的差异分析

       本研究在对比正常对照组、轻中度组和重度组之间的磁化率值的差异中发现重度组各脑区的磁化率值均低于正常对照组和轻中度组，右侧额叶白质、左侧颞叶白质和左侧红核的磁化率值在正常组和轻中度组之间差异有统计学意义，右侧齿状核的磁化率值在正常对照组和重度组之间有显著差异，所有脑区的磁化率值在轻中度组和重度组之间差异无统计学意义，说明右侧齿状核的磁化率值对于区分ASD的严重程度可能具有参考意义，但是各个脑区磁化率值在区分轻中度和重度的时候结果并不显著，出现这种结果的原因也可能是本研究纳入的ASD儿童中重度组的儿童数量较少，下一步可以扩大重度组的样本量来继续探究磁化率值对于区分ASD儿童的严重程度是否具有参考意义，以及这些脑区的磁化率值与严重程度的相关性。

3.6 本研究的局限性

       （1）未进行微量元素铁及铁蛋白的检测，未将微量元素铁与脑区铁含量进行比较，有待进一步研究完善；（2）本研究中ASD女童的数量较少，下一步可以增加ASD组女性患者的数量，进一步探讨ASD儿童的性别差异；（3）本研究采用手动勾画ROI，由于学龄前儿童年龄较小，部分脑区铁含量较低，可能导致勾画不够精准，未来应考虑与结构像进行配准并匹配脑模板进行自动分割的方法来进一步验证研究结果；（4）本研究数据量较少，未将ASD儿童按照年龄进行分组分析，下一步应继续增加样本量，按照年龄段进行分组探讨；（5）本研究尽管采用了DeLong检验进行ROC曲线的差异性分析，但受限于样本量，暂未发现差异有统计学意义，后续本课题组的研究将着力扩大样本量以验证结果的稳健性。

4 结论

       综上所述，ASD儿童的脑铁含量低于正常儿童，这可能与其临床症状及ASD严重程度相关，对探究ASD儿童的病理生理机制及其早期诊疗具有临床意义。